Name: Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Découvrez une technique d'étiquetage de neurones uniques dans le système nerveux central d'embryons de Drosophila melanogaster. Cette méthode utilise un colorant lipophile et la microscopie confocale pour visualiser la morphologie neuronale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une subvention de la DFG avec l&#39;heure GMT

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+growth+cone+to+synapse%3A+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Suppl%22%5BJournal%5D)">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li>
<li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+J+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. Berlin. (1985).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347(2009).</li>
<li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li>
<li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li>
<li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li>
<li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics%2C+filopodial+length%2C+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li>
<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Un avantage majeur de la drosophile comme modèle de système est qu&#39;il permet l&#39;analyse du développement et de la fonction au niveau des cellules individuelles. Ceci est particulièrement utile en ce qui concerne le système nerveux, où la diversité des types de cellules est exceptionnellement élevé et la fonction et la morphologie des cellules voisines peut être totalement différente. Procédé nous présentons ici permet le marquage des neurones individuels avec un colorant qui ...

La connaissance de la morphologie neuronale au niveau des cellules individuelles est une condition essentielle pour la compréhension de la connectivité neuronale et la fonction du système nerveux central. Ainsi, dès les premiers jours de la neuroscience, les chercheurs ont cherché à développer des simples techniques de marquage de cellules (voir 7 pour un traitement historique de cette question). Les méthodes classiques comme la coloration de Golgi fournir une excellente résolution de la morphologie neuronale, mais ne sont pas adaptés si l&#39;on cherche à identifier un type particulier de neurone d&#39;une manière dirigée, que la coloration se produit de façon aléatoire. Le développement de méthodes pour la coloration des cellules individuelles par injection intracellulaire ou juxtacellulaire de colorants à partir d&#39;une microélectrode l&#39;exigence en matière d&#39;étiquetage spécifique. L&#39;application de neurone unique colorant injection chez la drosophile a présenté un défi majeur, en raison de la petite taille de l&#39;organisme et à la fois ses neurones. Néanmoins, la coloration seul neurone de Drosophila embryonnaire </em&gt; Neurones a été atteint au milieu des années 1980 dans le laboratoire de Corey Goodman 15. Bien que la méthode a été éminemment utile et a fourni des renseignements clés sur les mécanismes de développement neuronal chez la drosophile au cours des 20-30 dernières années (par exemple, 2, 10), de nombreux travailleurs ont renoncé en grande partie à cause de ses exigences techniques. La disponibilité de ces dernières années des techniques génétiques pour l&#39;étiquetage des neurones chez la drosophile a également contribué à l&#39;impopularité de l&#39;injection de colorant unique neurone. Expression GAL4-dirigé des constructions GFP membrane ciblées peuvent fournir une excellente résolution de la morphologie des neurones 1, 20. Cependant, cette méthode présente certaines limites: l&#39;expression souvent inévitable de la GFP dans les cellules multiples peuvent obscurcir la structure des neurones individuels et une ligne pilote de GAL4 peut ne pas être disponible pour conduire l&#39;expression dans un neurone d&#39;intérêt particulier. Le MarcM (Analyse mosaïque avec un représentantmarqueur des cellules ressible) Méthode 8 peut fournir l&#39;étiquetage des neurones essentiellement tout au niveau de la cellule individuelle, mais ne peut pas être utilisé avec succès dans l&#39;embryon et la larve au début à cause de la rotation lente de la protéine GAL80. Compte tenu de ces limites de l&#39;étiquetage génétique, nous croyons que l&#39;injection de colorant seul neurone dans l&#39;embryon de drosophile reste une technique intéressante et mérite une plus large application. Pour promouvoir cet objectif, nous proposons ici une description détaillée de la méthode. Une illustration de sa puissance est fournie par notre récent compte de la morphologie de l&#39;ensemble des interneurones dans neuromeres abdominale de l&#39;embryon chez la drosophile fin 14. Cette étude, qui révèle à la fois la variabilité morphologique des différents types de cellules neuronales et les principes d&#39;organisation neuromere dans le SNC de l&#39;embryon, n&#39;aurait pas été possible avec n&#39;importe quelle méthode d&#39;étiquetage actuellement disponible autres.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIFS </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml dans 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Dil </td><td> Sondes Invitrogen / moléculaires </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml dans de l&#39;éthanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldéhyde</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% dans du PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glycérol </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% dans du PBS </td></tr><tr><td> Heptane colle </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Violoncelle 31-39-30 * </td><td> diluer env. 1 à 1 avec du n-heptane </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> de visualiser et de documenter les marquages ​​en fluorescence </td></tr><tr><td> DC - unemplifier </td><td> Dragan Corporation </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> pour effectuer les marquages </td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> de préparer et de disect embryons </td></tr><tr><td> Plat capillaires </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> le diamètre extérieur de 1 mm, épaisseur 0,1 mm verre </td></tr><tr><td> Injection capillaires </td><td> Science Products </td><td> 100 Go TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> R micromanipulateur </td><td> Leica </td><td></td><td> pour effectuer les marquages </td></tr><tr><td> Modèle P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> de tirer capillaires </td></tr><tr><td> Diapositives Objets </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld supérieure</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope scientifique </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> pour voir les marquages ​​après photoconversion </td></tr><tr><td> Microscope scientifique </td><td> Olympe </td><td> BX50 </td><td> pour effectuer les marquages </td></tr><tr><td> Caméra vidéo Sony MC3255 </td><td> Sony / AVT Corne </td><td> Sony MC3255 </td><td> pour enregistrer marquages ​​après photoconversion </td></tr></tbody></table> Tableau 1.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Dans cet article, nous décrivons comment étiqueter individuellement les neurones dans le SNC embryonnaire de Drosophila melanogaster par injection juxtacellulaire de la membrane lipophile Dil marqueur fluorescent. Cette méthode permet la visualisation de la morphologie des cellules neuronales dans les moindres détails. Il est possible de marquer n&#39;importe quelle cellule du système nerveux central: les corps cellulaires des neurones cibles sont visualisés sous une optique DIC ou par expression d&#39;un marqueur fluorescent génétique comme la GFP. Après marquage, le DiI peut être transformée en une tache brune permanente par photoconversion pour permettre la visualisation de la morphologie des cellules avec de la lumière transmise et de l&#39;optique DIC. Alternativement, les cellules Dil-marqués peuvent être observés directement par microscopie confocale, permettant génétiquement introduits protéines rapporteurs fluorescents à colocalised. Cette technique peut être utilisée dans n&#39;importe quel animal, quelle que soit le génotype, ce qui permet d&#39;analyser les phénotypes mutants à résolution cellule unique.

La figure 4 illustre les résultats typiques de la technique, que nous décrivons ici. Figure 4A montre un exemple de Dil interneurone unique rempli qui a été proprement photoconverted. Il démontre bien le niveau de détail de ces préparatifs offre. Lorsqu&#39;elle est vue sous une optique DIC le contexte spatial de la cellule marquée dans le tissu environnant non marqué est visible, par exemple, la position du corps de la cellule à l&#39;intérieur de l&#39;écorce et de la project...

Nous présentons une technique pour l&#39;étiquetage des neurones simples dans le système nerveux central (SNC) de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons, ce qui permet l&#39;analyse de la morphologie neuronale soit par lumière transmise ou microscopie confocale.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

L’objectif global de cette procédure est de marquer des neurones uniques dans le système nerveux central d’embryons de drosophile de stade précoce 17. Ceci est accompli en collectant des œufs et en leur permettant de se développer au bon stade. La deuxième étape de la procédure consiste à chlorer et à aligner manuellement les œufs.Suite à cette diva, la colonisation et le filetage des embryons rendent le cordon nerveux accessible. La dernière étape consiste à marquer les cellules uniques par application ionorique de l’œil lipophile. En fin de compte, les résultats permettent de visualiser la morphologie d’un seul neurone si nécessaire dans le contexte de modèles d’expression GFP connus et/ou dans un arrière-plan mutant.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes de marquage de cellules uniques existantes comme le markum est qu’elle fonctionne dans l’embryon et permet de visualiser intentionnellement les cellules identifiées. La démonstration visuelle de cette méthode est extrêmement utile car de nombreuses étapes sont délicates et donc difficiles à apprendre. Laissez les mouches saines pondre des embryons sur des plaques de gélose.Replacez la plaque toutes les heures et demie à 25 degrés Celsius et conservez les embryons. Incuber les embryons dans leurs assiettes à 25 ou 18 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement requis. Lorsque vous êtes prêt, transférez les embryons sur une lame recouverte de ruban adhésif double face.Évitez de transférer de la gélose avec les embryons car cela interférerait avec leur adhérence au ruban. Sur la bande. Laissez les embryons sécher pendant cinq à 10 minutes en attendant.Enduire une lamelle de 24 millimètres sur 60 millimètres de colle heptane. Placez une petite goutte de colle au centre de la diapositive et étalez-la en un film très fin à l’aide d’une lamelle carrée de 18 millimètres. Une fois que les embryons sont secs, touchez-les doucement avec une aiguille.Le corion s’ouvrira et l’embryon se collera à l’aiguille. Transférez immédiatement les embryons déchlorés dans un bloc de gélose pour éviter qu’ils ne sèchent. Alignez-les là 10 fois de suite, côté ventral vers le haut.Coupez l’excès de gélose du bloc avec un scalpel. Touchez ensuite délicatement les embryons avec la lamelle enduite de colle heptane. Ils doivent adhérer à la lamelle avec leur côté ventral vers le bas.Appliquez un cadre de ruban adhésif autour de la lamelle et fixez-le à une lame de microscope. Garder les embryons sur le dessus de la lamelle. Couvrez les embryons avec des quantités généreuses de PBS sur la face dorsale de chaque embryon près de son extrémité postérieure.Pénétrez la membrane du vitel avec une aiguille de verre, déchirez la membrane le long de la ligne médiane dorsale et faites sortir l’embryon de la membrane. Réorientez maintenant la face ventrale de l’embryon ailleurs sur le substrat de colle heptane. Limer l’embryon à l’aide d’une aiguille de verre en perforant doucement la paroi du corps et en déchirant le long de la ligne médiane dorsale.À l’aide de l’aiguille, appuyez sur la paroi du corps pour qu’elle adhère à la diapositive. Déchirez l’intestin à ses extrémités antérieure et postérieure et soulevez l’intestin. Étant donné que plusieurs embryons seront archivés sur la même lame, il est utile d’être très précis dans leur orientation ou de faire un dessin de leur orientation.Ensuite, les embryons peuvent être légèrement fixés pendant 10 à 15 minutes dans du formaldéhyde à 7,4 % dans du PBS, suivis de quatre lavages dans du PBS, en prenant soin d’éviter de toucher les embryons à la surface de la solution. Les forces de tension superficielle les détruiront sous un objectif de 10 x. Centrez le champ de vision sur un embryon préparé, augmentez le grossissement et localisez la cellule d’intérêt sous optique DIC ou sous fluorescence.Si la cellule cible exprime la GFP, assurez-vous que le diaphragme de champ du microscope est ouvert juste jusqu’au bord du champ de vision, et non au-delà d’un éclairage étroit. Le faisceau facilitera le positionnement de la micro-pipette, le remettra à l’objectif 10 x et placera l’électrode de bain de l’amplificateur DC dans la solution loin de l’embryon et du chemin de la micro-pipette. Montez la micropipette d’injection remplie de solution de chlorure de lithium sur le support et fixez-la au micromanipulateur.À l’aide des commandes de parcours, positionnez la micropipette sous l’objectif et bien au-dessus de l’embryon. Si l’angle du micro peppe est trop raide, la pointe ne sera pas nette. S’il est trop peu profond, la tige s’encrassera contre la paroi de la baignoire au centre de la pointe dans le champ de vision.Abaissez maintenant la micropipette et faites la mise au point en alternance jusqu’à ce que la pipette soit dans le PBS et pas trop loin au-dessus de l’embryon. Passez maintenant à l’objectif haute puissance et centrez la pipette dans le champ de vision. Lorsque la tige est nette, déplacez la micro-pipette dans l’axe X jusqu’à ce que sa pointe se trouve au centre du champ de vision.La pointe de la micropipette doit être bien au-dessus du niveau de l’embryon. Passez à l’éclairage par fluorescence et examinez la pointe. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite de l’œil colorant.Ajustez le courant continu de manière à ce que le cristal de l’œil de colorant ne s’accumule pas à l’extrémité. Abaissez maintenant la micropipette dans l’axe Z vers l’embryon. Ajuster progressivement la mise au point au fur et à mesure que l’embryon devient focal.Passez à l’utilisation de la commande fine. Focaliser la cellule à injecter au centre du champ puis recentrer sur la pointe de la micro pipette. À partir de ce moment, il peut être plus pratique d’utiliser le contrôle de platine du microscope pour déplacer l’embryon par rapport à la micro-pipette.Mettez la pointe de la micro-pipette en contact avec la cellule et faites une dépression à sa surface. Faites passer plusieurs nanoampères de courant de dépolarisation pendant quelques secondes. Un petit cristal d’œil à colorant se formera sur la cellule pour confirmer que la cellule a été marquée.Ouvrez brièvement l’obturateur pour éclairer le champ avec une lumière fluorescente. Si le corps de la cellule présente des signes d’étiquetage, appliquez le courant pendant plusieurs secondes supplémentaires. Ensuite, coupez le courant et éloignez rapidement l’embryon de la micropipette à l’aide des commandes de la platine.Si aucun marquage de l’œil D n’était évident, la micropipette a peut-être été bloquée et doit être remplacée. Si l’extrémité de la pipette accroche d’autres tissus de la racine à la cellule et colore ce tissu, essayez de retirer légèrement la micropipette et de vous approcher à nouveau de la cellule avant de recourir à la redistribution de la micropipette au besoin. Continuez à étiqueter d’autres cellules dans le même embryon ou dans d’autres embryons sur la même lame.Déplacez l’extrémité vers le bord du champ de vision et répétez la procédure. Retirez la majeure partie de la solution dans la chambre d’injection. Ensuite, fixez les embryons en ajoutant 7,4 % de formaldéhyde PBS pendant 10 minutes, suivi de quatre lavages avec du PBS.La préparation peut maintenant être photoconvertie ou montée pour la microscopie confocale en utilisant le protocole décrit. Un interneurone rempli de dai a été parfaitement converti en photo sous optique DIC. Le contexte spatial de la cellule marquée dans le tissu environnant non marqué a été bien résolu.Par exemple, les positions du corps cellulaire dans le cortex et de la projection des fibres dans la pilule neurologique pourraient toutes deux être observées dans cette préparation. La goutte de colorant était un peu trop grosse. Plusieurs cellules voisines ont été marquées simultanément, ce qui rend difficile de relier les projections individuelles à des corps cellulaires distincts.Notez également que sous le microscope fluorescent, la résolution de l’arrière-plan est beaucoup plus faible sans conversion photo. Plusieurs cellules dans des segments voisins peuvent également être injectées dans cette préparation, un anticorps contre les deux colorations rapides de fales dans la pilule neurologique. Malgré les corps cellulaires clairs, la préparation montre un effet secondaire possible de périodes de photoconversion prolongées.Les cellules les plus intensément marquées ont tendance à se colorer et à commencer à gonfler par rapport au marquage d’une seule cellule avec une optique confocale. Le marquage de l’œil colorant chez les embryons porteurs de constructions rapporteures de la GFP peut fournir un contexte spatial et une identité de la cellule remplie de D au sein de populations spécifiques de types de cellules neuronales ou gliales positives à la GFP. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et d’effectuer des marquages de neurones uniques dans le SNC embryonnaire après oph.Mais lorsque vous tentez cette procédure, gardez à l’esprit que chaque étape est exigeante, alors attendez-vous à quelques répétitions jusqu’à ce que toute la procédure se déroule sans problème.

labeling-single-cells-central-nervous-system-drosophila

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Dans cet article, nous démontrons comment disséquer le système nerveux central du troisième stade drosophile larves.

Dissection de SNC larvaire chez Drosophila melanogaster

Nous décrivons la procédure pour préparer...

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

Pour comprendre comment les formes cellulaires complexes, comme les dendrites neuronales, sont atteints au cours du développement, il est important d'être en mesure de précision de dosage organisation des microtubules. Nous décrivons ici une méthode de marquage immunohistochimique robustes afin d'examiner l'organisation des microtubules des cellules dendritiques dendrites des neurones sensoriels arborisation, la trachée, les muscles et les...

Étiquetage immunohistologique des microtubules dans dendrites des neurones sensoriels, trachées et les muscles dans la Drosophile Mur Corps Larve

Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence d’un cerveau de drosophile transgénique pour l’imagerie unicellulaire des cellules gliales. Le cerveau exprime des protéines ciblées sur la membrane fusionnées avec différentes combinaisons d’épitopes antigéniques sous le contrôle d’un système de recombinase gliale spécifique. Les cerveaux isolés et fixes sont colorés avec des anticorps primaires spécifiques aux épitopes antigéniques, suivis d’anticorps secondaires conjugués aux...

Coloration par immunofluorescence du cerveau de la drosophile pour l’imagerie unicellulaire des cellules gliales

Source : Inal, M. A. et. al., Tracé rétrograde de Drosophila Motoneurones embryonnaires à l’aide de colorants fluorescents lipophiles. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la méthode de marquage rétrograde des motoneurones de Drosophila à l’aide de colorants lipophiles. Le colorant pénètre dans l’axone, se déplace rétrogradement et étiquette les neurones en vert, ce qui permet une visualisation détaillée de leur morphologie et de leurs projections au microscope confocal.

Marquage rétrograde des motoneurones de la drosophile à l’aide de colorants lipophiles fluorescents

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Les cellules affichent différentes morphologies et établissent une variété d’interactions avec leurs voisins. Ce protocole décrit comment révéler la morphologie des cellules individuelles et d’étudier les interactions cellule-cellule en utilisant le système d’expression de Gal4/UAS bien établi.

Application de MultiColor FlpOut Technique pour étudier les Morphologies de cellule unique de haute résolution et Interactions cellulaires des cellules gliales chez la drosophile

Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

L’analyse du cycle cellulaire avec marquage de la 5-éthyhyyl-2'-désoxyuridine (EdU) et de la phospho-histone H3 (pH3) est une procédure en plusieurs étapes qui peut nécessiter une optimisation approfondie. Ici, nous présentons un protocole détaillé qui décrit toutes les étapes de cette procédure, y compris l’analyse d’images et la quantification pour distinguer les cellules dans différentes phases du cycle cellulaire.

Protocole de double marquage 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 pour l’analyse de la progression du cycle cellulaire dans les cellules souches neurales de la drosophile

Cet article décrit un protocole efficace de dissection imaginaire des disques et de coloration par anticorps, économique en matière de réactifs et facilitant la manipulation de disques imaginaux en petites quantités.

Dissection à petite échelle et coloration par anticorps des disques imaginaux oculaires-antennaux et des ailes provenant de Drosophila melanogaster

Découvrez une technique d'étiquetage de neurones uniques dans le système nerveux central d'embryons de Drosophila melanogaster. Cette méthode utilise un colorant lipophile et la microscopie confocale pour visualiser la morphologie neuronale.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des

Explorer plus de vidéos