Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des Drosophila melanogaster

L’objectif global de cette procédure est de marquer des neurones uniques dans le système nerveux central d’embryons de drosophile de stade précoce 17. Ceci est accompli en collectant des œufs et en leur permettant de se développer au bon stade. La deuxième étape de la procédure consiste à chlorer et à aligner manuellement les œufs.

Suite à cette diva, la colonisation et le filetage des embryons rendent le cordon nerveux accessible. La dernière étape consiste à marquer les cellules uniques par application ionorique de l’œil lipophile. En fin de compte, les résultats permettent de visualiser la morphologie d’un seul neurone si nécessaire dans le contexte de modèles d’expression GFP connus et/ou dans un arrière-plan mutant.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes de marquage de cellules uniques existantes comme le markum est qu’elle fonctionne dans l’embryon et permet de visualiser intentionnellement les cellules identifiées. La démonstration visuelle de cette méthode est extrêmement utile car de nombreuses étapes sont délicates et donc difficiles à apprendre. Laissez les mouches saines pondre des embryons sur des plaques de gélose.

Replacez la plaque toutes les heures et demie à 25 degrés Celsius et conservez les embryons. Incuber les embryons dans leurs assiettes à 25 ou 18 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement requis. Lorsque vous êtes prêt, transférez les embryons sur une lame recouverte de ruban adhésif double face.

Évitez de transférer de la gélose avec les embryons car cela interférerait avec leur adhérence au ruban. Sur la bande. Laissez les embryons sécher pendant cinq à 10 minutes en attendant.

Enduire une lamelle de 24 millimètres sur 60 millimètres de colle heptane. Placez une petite goutte de colle au centre de la diapositive et étalez-la en un film très fin à l’aide d’une lamelle carrée de 18 millimètres. Une fois que les embryons sont secs, touchez-les doucement avec une aiguille.

Le corion s’ouvrira et l’embryon se collera à l’aiguille. Transférez immédiatement les embryons déchlorés dans un bloc de gélose pour éviter qu’ils ne sèchent. Alignez-les là 10 fois de suite, côté ventral vers le haut.

Coupez l’excès de gélose du bloc avec un scalpel. Touchez ensuite délicatement les embryons avec la lamelle enduite de colle heptane. Ils doivent adhérer à la lamelle avec leur côté ventral vers le bas.

Appliquez un cadre de ruban adhésif autour de la lamelle et fixez-le à une lame de microscope. Garder les embryons sur le dessus de la lamelle. Couvrez les embryons avec des quantités généreuses de PBS sur la face dorsale de chaque embryon près de son extrémité postérieure.

Pénétrez la membrane du vitel avec une aiguille de verre, déchirez la membrane le long de la ligne médiane dorsale et faites sortir l’embryon de la membrane. Réorientez maintenant la face ventrale de l’embryon ailleurs sur le substrat de colle heptane. Limer l’embryon à l’aide d’une aiguille de verre en perforant doucement la paroi du corps et en déchirant le long de la ligne médiane dorsale.

À l’aide de l’aiguille, appuyez sur la paroi du corps pour qu’elle adhère à la diapositive. Déchirez l’intestin à ses extrémités antérieure et postérieure et soulevez l’intestin. Étant donné que plusieurs embryons seront archivés sur la même lame, il est utile d’être très précis dans leur orientation ou de faire un dessin de leur orientation.

Ensuite, les embryons peuvent être légèrement fixés pendant 10 à 15 minutes dans du formaldéhyde à 7,4 % dans du PBS, suivis de quatre lavages dans du PBS, en prenant soin d’éviter de toucher les embryons à la surface de la solution. Les forces de tension superficielle les détruiront sous un objectif de 10 x. Centrez le champ de vision sur un embryon préparé, augmentez le grossissement et localisez la cellule d’intérêt sous optique DIC ou sous fluorescence.

Si la cellule cible exprime la GFP, assurez-vous que le diaphragme de champ du microscope est ouvert juste jusqu’au bord du champ de vision, et non au-delà d’un éclairage étroit. Le faisceau facilitera le positionnement de la micro-pipette, le remettra à l’objectif 10 x et placera l’électrode de bain de l’amplificateur DC dans la solution loin de l’embryon et du chemin de la micro-pipette. Montez la micropipette d’injection remplie de solution de chlorure de lithium sur le support et fixez-la au micromanipulateur.

À l’aide des commandes de parcours, positionnez la micropipette sous l’objectif et bien au-dessus de l’embryon. Si l’angle du micro peppe est trop raide, la pointe ne sera pas nette. S’il est trop peu profond, la tige s’encrassera contre la paroi de la baignoire au centre de la pointe dans le champ de vision.

Abaissez maintenant la micropipette et faites la mise au point en alternance jusqu’à ce que la pipette soit dans le PBS et pas trop loin au-dessus de l’embryon. Passez maintenant à l’objectif haute puissance et centrez la pipette dans le champ de vision. Lorsque la tige est nette, déplacez la micro-pipette dans l’axe X jusqu’à ce que sa pointe se trouve au centre du champ de vision.

La pointe de la micropipette doit être bien au-dessus du niveau de l’embryon. Passez à l’éclairage par fluorescence et examinez la pointe. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite de l’œil colorant.

Ajustez le courant continu de manière à ce que le cristal de l’œil de colorant ne s’accumule pas à l’extrémité. Abaissez maintenant la micropipette dans l’axe Z vers l’embryon. Ajuster progressivement la mise au point au fur et à mesure que l’embryon devient focal.

Passez à l’utilisation de la commande fine. Focaliser la cellule à injecter au centre du champ puis recentrer sur la pointe de la micro pipette. À partir de ce moment, il peut être plus pratique d’utiliser le contrôle de platine du microscope pour déplacer l’embryon par rapport à la micro-pipette.

Mettez la pointe de la micro-pipette en contact avec la cellule et faites une dépression à sa surface. Faites passer plusieurs nanoampères de courant de dépolarisation pendant quelques secondes. Un petit cristal d’œil à colorant se formera sur la cellule pour confirmer que la cellule a été marquée.

Ouvrez brièvement l’obturateur pour éclairer le champ avec une lumière fluorescente. Si le corps de la cellule présente des signes d’étiquetage, appliquez le courant pendant plusieurs secondes supplémentaires. Ensuite, coupez le courant et éloignez rapidement l’embryon de la micropipette à l’aide des commandes de la platine.

Si aucun marquage de l’œil D n’était évident, la micropipette a peut-être été bloquée et doit être remplacée. Si l’extrémité de la pipette accroche d’autres tissus de la racine à la cellule et colore ce tissu, essayez de retirer légèrement la micropipette et de vous approcher à nouveau de la cellule avant de recourir à la redistribution de la micropipette au besoin. Continuez à étiqueter d’autres cellules dans le même embryon ou dans d’autres embryons sur la même lame.

Déplacez l’extrémité vers le bord du champ de vision et répétez la procédure. Retirez la majeure partie de la solution dans la chambre d’injection. Ensuite, fixez les embryons en ajoutant 7,4 % de formaldéhyde PBS pendant 10 minutes, suivi de quatre lavages avec du PBS.

La préparation peut maintenant être photoconvertie ou montée pour la microscopie confocale en utilisant le protocole décrit. Un interneurone rempli de dai a été parfaitement converti en photo sous optique DIC. Le contexte spatial de la cellule marquée dans le tissu environnant non marqué a été bien résolu.

Par exemple, les positions du corps cellulaire dans le cortex et de la projection des fibres dans la pilule neurologique pourraient toutes deux être observées dans cette préparation. La goutte de colorant était un peu trop grosse. Plusieurs cellules voisines ont été marquées simultanément, ce qui rend difficile de relier les projections individuelles à des corps cellulaires distincts.

Notez également que sous le microscope fluorescent, la résolution de l’arrière-plan est beaucoup plus faible sans conversion photo. Plusieurs cellules dans des segments voisins peuvent également être injectées dans cette préparation, un anticorps contre les deux colorations rapides de fales dans la pilule neurologique. Malgré les corps cellulaires clairs, la préparation montre un effet secondaire possible de périodes de photoconversion prolongées.

Les cellules les plus intensément marquées ont tendance à se colorer et à commencer à gonfler par rapport au marquage d’une seule cellule avec une optique confocale. Le marquage de l’œil colorant chez les embryons porteurs de constructions rapporteures de la GFP peut fournir un contexte spatial et une identité de la cellule remplie de D au sein de populations spécifiques de types de cellules neuronales ou gliales positives à la GFP. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et d’effectuer des marquages de neurones uniques dans le SNC embryonnaire après oph.

Mais lorsque vous tentez cette procédure, gardez à l’esprit que chaque étape est exigeante, alors attendez-vous à quelques répétitions jusqu’à ce que toute la procédure se déroule sans problème.