Name: Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Découvrez l'isolement et la culture de cardiomyocytes de souris néonatales pour la biologie cardiovasculaire. Cette méthode robuste permet d'étudier l'organisation myofibrillaire et la fonction cardiaque in vitro.

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Nous sommes reconnaissants envers le professeur émérite Jean-Claude Perriard et Evelyn Perriard (Institut fédéral suisse de technologie, Suisse) pour l&#39;introduction dans les techniques d&#39;isolation pour rat nouveau-né et les cardiomyocytes de souris. Nous tenons à remercier le professeur Chen Ju et le professeur Sylvia Evans (UCSD, USA) pour leur soutien. Le travail dans le laboratoire de l&#39;EE a été financé par une subvention d&#39;établissement de la MRC de carrière. SL est soutenu par une voie K99/R00 à l&#39;octroi de l&#39;indépendance du NIH / NHLBI (HL107744). TMM a été soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de l&#39;American Heart Association (11POST7310066).

La procédure qui suit décrit un protocole de 16,17 à deux jours pour l&#39;isolement et la culture des cardiomyocytes de souris néonatales. Toutes les solutions sont stériles ou stérilisées par filtration. Tous les outils sont stérilisés par stérilisation de surface avec 75% d&#39;éthanol. À l&#39;exception de l&#39;extraction initiale du tissu, toutes les étapes sont réalisées dans une cellule à flux laminaire culture hotte stérile. Ce protocole est destiné à l&#39;isolation des coeurs de souris néonatales une à deux litière (s) - environ 5-14 chiots, mais peut être adapté pour les grandes tailles de litière et rat cardiomyocytes néonataux. l&#39;utilisation des médias de l&#39;échelle / enzyme, le cas échéant. Pour les travaux de rongeurs nouveau-nés, reportez-vous à vos directives et les règles de l&#39;université locale énoncées par les programmes de protection des animaux législatif et / ou, et adhérer à votre protocole animale institutionnel approuvé. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle UC San Diego (IACUC), et adhérer à federal et règlements étatiques. Jour 1. Une. Isolation du tissu cardiaque de souris néonatale <ol><li> Préparer 50 ml de 1 x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) supplémenté avec 20 mM BDM 6-8, et à disperser en deux plats bactériennes stériles placés sur de la glace. </li><li> Préparer 10 ml de milieu d&#39;isolement dans 50 ml de tubes de Falcon conique stérile. Gardez toutes les solutions sur la glace. Stériliser ciseaux (une courbe; une droite), et des pinces (courbes, Dumont n ° 7). </li><li> Souris nouveau-nées âgées de 1-3 jours sont rincées rapidement dans une solution d&#39;éthanol à 75% pour la stérilisation de la surface. Les chiots sont décapités à l&#39;aide de ciseaux stériles (de droite), et le coffre est ouvert le long du sternum pour permettre l&#39;accès à la cavité de la poitrine et le cœur (figure 1A, film supplémentaire S1). Commentaire technique: souris néonatales de plus de 3 jours peut être utilisé, mais le résultat en moins de cellules viables 2. </li><li> Les coeurs sont extraites dele corps avec des ciseaux courbes et transféré immédiatement dans la capsule bactérienne contenant 1 x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) avec 20 mM BDM, sur de la glace. Toutes les étapes suivantes sont effectuées sous la hotte de culture cellulaire stérile. </li><li> Retirer le tissu pulmonaire, les grands navires (et oreillettes, si vous le souhaitez). Coeurs lavage dans la solution PBS 1x (sans Ca 2 +, Mg 2 +) mM BDM 20 (sur la glace) pour enlever le sang. Transfert lavé cœur du premier plat dans le second plat bactérienne contient 1x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) mM BDM 20 (sur la glace) en utilisant une pince ou une cuillère perforée (figure 1B). </li><li> Transfert nettoyé / lavé coeurs dans une goutte de milieu d&#39;isolement (environ 250 pi; figure 1C) dans un troisième plat bactérienne (sur la glace) et utiliser les ciseaux courbes pour hacher coeurs en petits morceaux (environ 0,5-1 mm 3, ou plus petites; Figure 1D, 1E). </li><li> Transfert coeurs hachées dans une coniquetube contenant 10 ml de milieu d&#39;isolement (sur de la glace), et incuber sous agitation douce à 4 ° C pendant une nuit. </li></ol> Jour 2. 2. Tissue digestion enzymatique et placage de cellules <ol><li> Peser 15 mg de mélange collagénase / dispase (Roche), et dissoudre le mélange d&#39;enzymes dans 10 ml L15-5 milieu supplémenté avec 20 mM BDM (milieu de digestion). Filtre stérile du milieu de digestion dans la hotte de culture cellulaire dans un nouveau 50 ml tube Falcon stérile. </li><li> Préparer 30 ml de milieu L-15 supplémenté avec 20 mM BDM, et moyen de placage. </li><li> Manteau de plaques de culture cellulaire avec une solution de collagène (Sigma C-8919) pour un minimum de 1 heure. Retirer la solution de collagène (peut être réutilisé) et revêtues de collagène plats de culture cellulaire sec en écoulement laminaire stérile hotte de culture cellulaire. </li><li> Retirer le tube conique contenant le cœur prédigéré de 4 ° C. fragments de tissus doivent être regroupées (figure 1G). Laissez les fragments de tissus coulentle fond du tube et retirer le surnageant (assurez-vous de ne pas perdre des fragments de tissus;. normalement, environ 1 ml de milieu d&#39;isolement peuvent rester dans le tube). Ajouter 5 ml de milieu de digestion et de 5 ml de L-15 supplémenté avec 20 mM BDM de fragments de tissus et de suspension à l&#39;aide de composés oxygénés de l&#39;oxygène ou de l&#39;air pendant 1 min. </li><li> Transférer le tube conique scellée contenant les fragments de tissus cardiaques dans du milieu de digestion à 37 ° C bain d&#39;eau pendant environ 2 min pour ajuster la température de la solution de digestion. </li><li> Incuber des fragments de tissus cardiaques à 37 ° C avec agitation douce pendant 20-30 min (par exemple agitateur à 37 ° C, mis à pas plus de 60rpm). temps de digestion peuvent dépendre fortement de mélange d&#39;enzymes et le numéro de lot. Attention: les périodes d&#39;incubation plus longues ou des concentrations d&#39;enzymes plus élevées peuvent réduire la viabilité cellulaire. </li></ol> Commentaire technique: Nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;un mélange de collagénase / dispase de Roche (Cat.No.: 10269638001) qui a très peu de variabilité de lot à lot. L&#39;enzyme classique pour l&#39;isolement des cardiomyocytes de souris est la trypsine et / ou de la collagénase de type II 3,16-20 disponible auprès de Worthington (Cat n ° CLS-2). Cependant, les performances de la collagénase II pourra différer sensiblement de lot à lot. Worthington permet généralement à l&#39;essai de plusieurs lots collagénase d&#39;optimiser les temps de digestion enzymatique et l&#39;utilisation. Sinon, Worthington vend un kit d&#39;isolement des cardiomyocytes avec un mélange d&#39;enzymes pré-testé inclus qui peuvent être adaptés pour l&#39;isolement des cardiomyocytes de souris 17 (Cat n °: NCIS). <ol start="7"><li> Placez cellule-filtre stérile (40-100 um de maille de nylon) en frais stériles de 50 ml tube conique faucon. Tamis cellulaire pré-humide avec 5 ml de L-15 complété par mM BDM 20. Fragments de tissus délicatement triturer l&#39;aide d&#39;un pré-mouillé 10 ml de culture cellulaire pipette pour environ 10-20 fois. Les fragments de tissus devraient principalement disperser au cours de cette étape, la libération des cellules en suspension (figure 1H). </li><li> Laissez fragments de tissus plus grands sédiments et surnageant de transfert contenant des cellules en suspension dans le tube conique frais à travers la cellule-filtre (figure 1I). </li><li> Re-suspendre les fragments de tissus digérés dans 5 ml de milieu de digestion et incuber pendant 5-10 min de plus un à 37 ° C avec agitation douce. </li><li> Après digestion continue de fragments de tissus restants, triturer doucement tissu pour 10-20 fois et ajouter aux cellules du tube contenant coniques de la première digérer par tamis cellulaire. Rincer la cellule-filtre avec 5 ml de L-15 supplémenté avec 20 mM BDM pour permettre le passage de toutes les cellules digérées. </li><li> Tube conique centrifugée contenant les cardiomyocytes en suspension pendant 5 min à 300 rpm (env. 50-100 xg). Eliminer le surnageant (contenant principalement des fibroblastes et des cellules endotheliales) et remettre en suspension culot cellulaire dans 10 ml de milieu de placage. </li><li> Cellules de la plaque dans 10 cm boîte de culture cellulaire (figure 2A) et incuber pendant 1-3 Heures en cellule incubateur de culture. Cette étape de pré-placage supprime les fibroblastes et les cellules endotheliales (Figure 2B), qui adhère à la boîte de culture cellulaire non revêtu (Figure 2C). </li><li> Après incubation, laver les cardiomyocytes non adhérentes à partir de 10 plat cm de culture (cellules remettre en suspension en pipetant à plusieurs reprises le milieu de plaquage sur le plat), et les cellules remises en suspension de transfert à un tube Falcon de centrifugation conique stérile (15 ml ou 50 ml). Facultatif: Répétez l&#39;étape de pré-dépôt de supprimer les fibroblastes supplémentaires de suspension cellulaire. Si on le souhaite, les cellules endothéliales et de fibroblastes adhérentes peuvent être ensuite mis en culture. </li><li> Compter les cellules (par exemple en utilisant Neubauer hématimètre, exclusion du bleu Trypan coloration 21). </li><li> cellules dans revêtues de collagène des boîtes de culture cellulaire avec une densité d&#39;environ 1,5 x 10 5 cellules par cm 2 (figure 2D plaque; voir également les commentaires au tableau 1 de placageet revêtement). Placez les plats dans la cellule incubateur de culture et laisser reposer pendant 12-18 heures pour permettre l&#39;adhésion et la diffusion des cardiomyocytes. </li></ol> Jour 3 - Culture des cardiomyocytes néonataux <ol><li> Préparer un milieu d&#39;entretien et préchauffer à 37 ° C bain d&#39;eau. Reportez-vous au tableau 1 pour l&#39;addition d&#39;inhibiteurs de prolifération ou agents chronotropes, ou la procédure pour la transfection liposomale de cardiomyocytes de souris néonatales. </li><li> Un jour après l&#39;étalement, cardiomyocytes auraient adhéré à la boîte de culture cellulaire et de façon optimale commencer spontanément à se contracter (figure 2E, 2F; supplémentaire Film S2; reportez-vous au tableau 2 pour des problèmes communs au cours de la procédure d&#39;isolement / culture). Remplacer milieu d&#39;étalement avec le milieu de la maintenance et de la culture pour d&#39;autres 1-5 jours. Changer le milieu comme nécessaire. </li></ol>

L&#39;utilisation de modèles animaux pour étudier les maladies cardiaques est devenu un standard dans la recherche cardiovasculaire. La caractérisation biochimique rapprocher de ces modèles (c.-à étudier les réponses directes des cellules cardiaques à des stimuli biochimiques ou biomécaniques) nécessite généralement l&#39;isolement des tissus cardiaques ou cardiomyocytes. Les études portant sur ​​les réactions physiologiques du cœur ex vivo (par exemple à l&#39;acétylcholine 40, ou dans les ...

Les premiers rapports de la dissociation de succès et de la culture de cellules cardiaques de rongeurs remonte au 1960 1,2. Même alors, Harary et Farley ont remarqué que des cardiomyocytes cultivés &quot;peuvent fournir un système unique pour l&#39;étude des exigences de la contractilité périodique [, et peuvent] fournir un moyen de déterminer la contribution des différentes voies métaboliques pour la [battre] processus». Bien Harary et Farley cardiomyocytes isolés et cultivés de jeunes rats, et le protocole original a été adapté et modifié par de nombreux scientifiques au cours des années, l&#39;isolement et la culture procédure générale n&#39;a pas beaucoup changé. Cependant, l&#39;amélioration des enzymes, des solutions standardisées 3 4,5, et l&#39;addition de la chaîne et un inhibiteur réversible de la myosine ATPase BDM à protéger les cellules au cours de la procédure d&#39;isolement 6-9 a considérablement amélioré le rendement de cellules et la viabilité. Adulte vs cardiomyo néonatalecytes Cardiomyocytes isolés et cultivés à partir de souris ou de rats nouveau-nés ont plusieurs avantages par rapport à des cultures de cardiomyocytes adultes. Tout d&#39;abord, la procédure d&#39;isolement de rat ou de souris néonatales coeurs est plus facile et moins coûteux, par rapport à l&#39;isolement des cardiomyocytes à partir de souris ou de rat adulte 10. Cardiomyocytes néonataux sont beaucoup moins sensibles à la réintroduction dans un milieu contenant du calcium après dissociation, augmentant considérablement cellule rendement. Un autre grand avantage est que les cardiomyocytes de souris néonatales subissent une dédifférenciation plus rapide - cycle de redifférenciation qui se traduit généralement par battant spontanément cellules 20 heures après l&#39;étalement, tout en cardiomyocytes adultes ont généralement besoin de stimulation pour induire la contraction. Cardiomyocytes néonataux sont également plus facilement transfectable avec des méthodes de transfection liposomale, alors que les cardiomyocytes adultes exigent des vecteurs viraux pour la livraison réussie de l&#39;ADN transgénique. Contrairement aux cardiomyocytes néonatauxs, la culture de cardiomyocytes de rongeurs adultes de 11 à 13 permet à des investigations de la dégradation myofibrillaire et rétablissement éventuel de l&#39;appareil contractile. Ces changements morphologiques caractéristiques de cardiomyocytes adultes se produisent sur des périodes de 1-2 semaines. La dédifférenciation - cycle de re-différenciation s&#39;accompagne de réexpression du programme de gène foetal, mimant ainsi les changements pathologiques observées dans les cardiomyopathies humaines 14. Un autre avantage de cardiomyocytes de rats adultes de plus la culture de cardiomyocytes néonataux est la capacité de la culture de ces cellules pendant de longues périodes de temps. Rat vs cardiomyocytes de souris L&#39;isolement et la culture des cardiomyocytes néonataux de rat a quelques avantages par rapport à celle des cardiomyocytes néonataux de souris, y compris des rendements plus élevés de cellules viables et une augmentation des taux de transfection. Cependant, la large utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées pour les maladies cardiaques (par exemple &lt;/ Em&gt; la lim de protéines musculaires souris knock-out comme modèle pour la cardiomyopathie dilatée 15) a conduit à l&#39;adaptation de la procédure d&#39;isolement pour les cardiomyocytes dérivés de souris néonatales. Bien que les protocoles utilisés pour isoler des cardiomyocytes de rat et de souris néonatales sont presque identiques, plus il faut prendre soin dans le choix d&#39;un mélange d&#39;enzyme approprié pour celui-ci. En effet, les cardiomyocytes de souris néonatales sont généralement plus sensibles à une digestion excessive, résultant dans une cellule-rendement et la viabilité réduite. En outre, la densité de placage doit être ajusté, cardiomyocytes, car dérivées de souris néonatale sont un peu plus petite par rapport à des cellules dérivées de coeurs de rats nouveau-nés. Avec beaucoup d&#39;utilisations pour l&#39;enquête de paramètres morphologiques, électrophysiologiques, biochimiques, cellulaires biologiques et biomécaniques ainsi que pour le processus de myofibrillogenesis, cardiomyocytes néonataux de culture sont devenus l&#39;un des systèmes les plus polyvalents pour l&#39;étude deles fonctions des cellules cardiaques in vitro. Toutefois, la première étape d&#39;un essai réussi dépend d&#39;une méthodologie simple et fiable pour isoler les cardiomyocytes de souris néonatales. Notre protocole tire sa méthodologie de nombreuses sources et a été optimisée pour la reproductibilité et la robustesse. Nous discutons des facteurs qui influent sur cardiomyocytes rendement et la viabilité, et offrons une variété d&#39;options pour l&#39;optimisation des conditions d&#39;isolement et de culture.

<table><tbody><tr><td>BDM (2,3-butanedione monoxime) 6-8</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td>préparer une solution mère de 0,2M dans HBSS (sans Ca2+, Mg2+), stériliser par filtre, peut être conservé à 4 &#176 ; C jusqu’à 6 mois ; Attention : L’utilisation prolongée de BDM en dehors de la procédure d’isolement peut entraîner des cellules non battantes, une diminution de la viabilité cellulaire et/ou une altération significative de l’expression génique pendant la culture de cardiomyocytes 46,47.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>peut être substitué par la collagénase de type II de Worthington</td></tr><tr><td>Collagénase de type II3</td><td>Worthington</td><td>CLS-2</td><td>Substitut du mélange Collagenase/Dispase de Roche</td></tr><tr><td>1x solution de trypsine (0,25 %) avec EDTA</td><td>cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x solution de pénicilline/streptomycine avec EDTA dans HBSS</td><td>cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (sans Ca2+, Mg2+)</td><td>e,g, cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank&#8217 ; solution saline équilibrée ; sans Ca2+, Mg2+) 4</td><td>cellgro</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose</td><td>cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>M-199</td><td>cellgro</td><td>10-060-CV</td><td></td></tr> sérum <tr><td>fœtal bovin</td><td>cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>culture cellulaire</td></tr><tr><td>de cheval sérum</td><td></td> cellgro <td>35-030-CV</td> culture <td>cellulaire grade</td></tr><tr><td>Leibovitz L-155</td><td>cellgro</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>AraC (chlorhydrate de cytosine-B-D-arabino-furanoside)</td><td>Sigma</td><td>C-6645</td><td>inhibiteur de la prolifération, préparer 1 mM de solution mère dans H2O, stériliser par filtre, conserver à 4 &#176 ; C</td></tr><tr><td>phényléphrine</td><td>Sigma</td><td>P-6126</td><td>agent chronotrope, préparer une solution mère de 100 mM dans H2O, filtrer stériliser, conserver à 4 &#176 ; C ou -20 &#176 ; Chlorhydrate</td></tr><tr><td>d’isoprotérénol</td><td>C Sigma</td><td>I-6501</td><td>agent chronotrope, préparer 1 mM de solution mère dans H2O, stériliser par filtre, conserver à 4 &#176 ; C ou -20 &#176 ; Solution</td></tr> de <tr><td>collagène C 0,1 %</td> Matrice extracellulaire <td>Sigma</td><td>C-8919</td><td>pour l’enrobage</td></tr> 3 <tr><td>mg/ml de collagène de type 1 solution</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>alternative à la solution de collagène Sigma</td></tr><tr><td>passoire</td> cellulaire <td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>taille de filtre appropriée : 40 &#956 ; M-100 &#956 ; Filtre</td></tr><tr><td>à seringue M 0,2 &#956 ; m</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>pour la filtration stérile de la digestion moyen</td></tr><tr><td>ciseaux droits</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>ciseaux incurvés</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont n° 7</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>cuillère perforée</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>10370-19</td><td>en option, pour le transfert du cœur tissu</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>coloration de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Neubauer hémocytomètre</td><td>Prosource Scientific</td><td>3500</td><td>utilisation alternative : hémocytomètre jetable C-chip ou systèmes de comptage automatique de cellules</td></tr><tr><td>50 ml Tubes</td><td>Falcon Fisherbrand</td><td>14-432-23</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubes Falcon</td><td>Fisherbrand</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 20 ml</td><td>BD Medical</td><td>14-820-19</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 10 ml</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>30 mm Boîte de culture cellulaire</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>pour la culture standard de cardiomyocytes</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire de 30 mm, fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>pour l’imagerie de cellules vivantes avec microscope inversé</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire de 10 cm</td><td>Nunc</td><td>172958</td><td>pour le préplacage</td></tr><tr><td>Escort III</td><td>Sigma</td><td>L3037</td><td>pour la transfection liposomale, alternativement utiliser lipofectamin 2000</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>52887</td><td>substitut d’Escort III</td></tr><<tr>td colspan="4">Tampons et milieux : <ul> <li>Milieu d’isolement (stérilisation par filtre) 20 mM BDM 0,0125 % trypsine in HBSS4 (sans Ca2+, Mg2+)</li> <li>Milieu de digestion (stérilisation par filtre) 20 mM BDM 1,5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix en milieu L15</li> <li> 65 % DMEM high glucose 19 % M-199 10 % horse serum 5 % foetal veau 1 % pénicilline/streptomycine</li> <li>Maintenance medium 78 % DMEM high glucose 17 % M-199 4 % sérum de cheval 1 % pénicilline/streptomycine facultatif : 1 &#956 ; M AraC 1 &#956 ; M isoprotérénol ou 0,1 mM de phényléphrine</li> </ul> Le milieu de placage et d’entretien peut être stocké à 4 &#176 ; C jusqu’à 6 mois.</td></tr></tbody></table>

isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes néonataux en culture ont longtemps été utilisés pour étudier myofibrillogenesis et fonctions myofibrillaires. Cardiomyocytes cultivés permettent d&#39;enquête facile et la manipulation des voies biochimiques, et leur effet sur les propriétés biomécaniques de battre cardiomyocytes spontanément. Le protocole 2 jours suivant décrit l&#39;isolement et la culture de cardiomyocytes de souris néonatales. Nous montrons comment disséquer facilement cœur de nouveau-nés, dissocier le tissu cardiaque et d&#39;enrichir les cardiomyocytes de la cellule-population cardiaque. Nous discutons de l&#39;utilisation de différents mélanges d&#39;enzymes pour dissociation des cellules, et leurs effets sur les cellules-viabilité. Les cardiomyocytes isolés peuvent ensuite être utilisés pour une variété d&#39;analyses morphologiques, biochimiques, électrophysiologiques de cellules biologiques ou biomécanique. Nous avons optimisé le protocole pour la robustesse et la reproductibilité, en utilisant des solutions seulement disponibles dans le commerce et l&#39;enzyme mélanges que show peu de variabilité de lot à lot. Nous abordons également les problèmes courants liés à l&#39;isolement et la culture des cardiomyocytes, et offrons une variété d&#39;options pour l&#39;optimisation des conditions d&#39;isolement et de culture.

En utilisant ce protocole, nous avons isolé les cœurs de 8 âge d&#39;un jour souriceaux nouveau-nés (figures 1A, 1B, film supplémentaire S1). Après lavage et hacher les coeurs avec des ciseaux (figures 1C-1F), des fragments de tissus ont été prédigérés en milieu d&#39;isolement pendant une nuit à 4 ° C sous agitation douce. À la suite de prédigestion (Figure 1G), on a transféré les fragments de tissus fraîchement préparé en milieu de digestion, et on incube les fragment...

Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l&#39;enquête de l&#39;organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l&#39;isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.

Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver des cardiomyocytes de souris nouveau-nés pour les utiliser dans des tests ultérieurs. Pour ce faire, on dissèque d’abord le cœur de souris néonatales, puis on coupe manuellement le tissu cardiaque en petits fragments. Dans un deuxième temps, les cellules cardiaques sont dissociées par une série de digestions enzymatiques. Ensuite, les cellules isolées sont mises en plaques, afin de les enrichir pour les cardiomyocytes. Enfin, les cardiomyocytes en culture peuvent être observés, adhérant à la plaque et affichant un comportement de battement spontané. En fin de compte, la localisation subcellulaire des protéines dans les cellules musculaires cardiaques transfectées avec des constructions d’expression eucaryotes peut être observée par microscopie immunofluorescente.- Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes est la robustesse et la reproductibilité dans l’isolement et la culture de cardiomyocytes de souris néonatales.- Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche cardiovasculaire et donner un aperçu de la biologie cellulaire moléculaire unique des

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Ici, nous décrivons un protocole pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d'un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d'origine essentiellement microvasculaires.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Nous décrivons ici l'isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus ou de lentivirus de manipuler l'expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

Nous avons développé une nouvelle technique et reproductible pour isoler les cultures primaires de cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire (PASMC) de souris dès l'âge de P7, ce qui permet une meilleure étude des voies de signalisation impliquées dans la contraction des cellules musculaires lisses néonatale et de détente.

Isolement de l&#39;artère pulmonaire cellules musculaires lisses de souris néonatales

Nous décrivons une méthode fiable pour l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes. Ce protocole donne un résultat cohérent pour la culture des cardiomyocytes adultes fonctionnels à partir d'une variété de souris génétiquement modifiées.

Isolement et culture de cardiomyocytes adultes de souris pour Signalisation cellulaire et<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrophie cardiaque

L’isolement des cardiomyocytes néonatals du rat est une procédure longue et imprévisible.  Cette étude décrit des méthodes de cryoconservation et de décongélation des cardiomyocytes de rat nouveau-né qui permettent une utilisation plus efficace des cellules. Les NRCM décongelés peuvent être utilisés pour diverses expériences sans qu’il soit nécessaire d’effectuer des isolations à chaque fois.

Isolement et cryoconservation des rats nouveau-nés cardiomyocytes

Ce protocole décrit une méthode étape par étape pour l’isolement reproductible et la culture à long terme de cardiomyocytes de souris adultes avec un rendement, une pureté et une viabilité élevés.

L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Cette étude présente une technique pour l'isolement des neurones de la souris néonatale WT. Il nécessite une dissection soigneuse de la moelle épinière de la souris néonatal, suivie de la séparation des neurones du tissu de la moelle épinière par un clivage mécanique et enzymatique.

L&#39;isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la transfection, et la culture à long terme de la souris adulte et les cardiomyocytes de rat.

Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Une méthode est décrite pour l’isolement simultané des myocytes et des non-myocytes des atria et des ventricules d’un coeur adulte simple de souris. Ce protocole a comme résultat des rendements cohérents des myocytes cardiaques et des non-myocytes fortement viables et détaille les conditions optimales de culture cellule-spécifique pour le phénotypage et l’analyse in vitro.

Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

L’étalon-or en cardiologie pour les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires sont les cardiomyocytes. Cet article décrit les adaptations à la technique non-Langendorff pour isoler les cardiomyocytes de souris.

Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

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Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

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