Identification des Belle au Bois Dormant Insertions de transposons dans les tumeurs solides en utilisant l'éditeur de liens médiée par PCR

Cette procédure montre comment identifier de nouveaux oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs en cartographiant les insertions chez la souris qui entraînent la formation de tumeurs. Ceci est accompli en générant et en récoltant d’abord des tumeurs à partir du modèle de souris transgénique. Les prochaines étapes de la procédure consistent à isoler l’ADN tumoral, à effectuer une PCR médiée par linker, puis à séquencer les échantillons d’ADN amplifiés et à analyser la transposition sur les insertions.

En fin de compte, la procédure identifie les gènes moteurs de tumeurs candidats. Le principal avantage de l’utilisation de la PCR médiée par linker en conjonction avec un dépistage génétique non biaisé à l’aide de transposons de la belle au bois dormant, est que nous pouvons facilement identifier de nouveaux facteurs génétiques du cancer. Commencez toujours la dissection en vaporisant l’extérieur de la souris sacrifiée avec de l’éthanol à 70 %.

Les tissus et les tumeurs collectés doivent être divisés en quatre sections, d’une taille de 50 à 100 milligrammes. Fixez une section dans de la formine tamponnée à 10 % pendant 18 heures, suivie d’éthanol à 70 %. Cette section peut être utilisée pour la coloration h et e et/ou l’immunohistochimie.

Congelez rapidement les sections restantes dans de l’azote liquide. Ceux-ci peuvent être conservés dans un congélateur et utilisés pour le D-N-A-R-N-A et l’isolement des protéines afin de collecter l’ADN d’un échantillon de tumeur congelé. Tout d’abord, hachez finement le tissu avec une lame de rasoir.

Ensuite, digérez le tissu dans un tube de 1,5 millilitre avec un millilitre de tampon de lyse cellulaire et cinq microlitres de 20 milligrammes par millilitre. La solution de protéase K tourbillonne soigneusement le mélange et procède à une extraction d’ADN standard à base d’isopropanol. Commencez ce protocole en recuit les linkers dans un tube de 1,5 millilitre.

Mélangez 50 microlitres de chaque solution d’agent de liaison avec deux microlitres de chlorure de sodium concentré. Placez ensuite le tube dans un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius. Après cinq minutes, éteignez le feu et laissez-le refroidir lentement à température ambiante, ce qui peut prendre une heure ou plus après le refroidissement.

Les linkers anaux peuvent être conservés au congélateur jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Préparez 2 plaques de 96 puits par Ali en citant un microgramme d’ADN de chaque échantillon dans les puits correspondants dans les deux plaques de 96 puits. Par exemple, placez un microgramme d’ADN de l’échantillon dans le puits A de l’une des deux plaques de puits.

L’ADN de l’une des plaques de 96 puits sera digéré à l’aide de l’enzyme NLA trois du côté droit et les échantillons d’ADN de l’autre plaque de 96 puits à l’aide de l’enzyme BFA 1 du côté gauche. Laissez l’ADN digérer pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, terminez la digestion par la chaleur, en inactivant les enzymes pendant 20 minutes.

Nettoyez maintenant les réactions de digestion à l’aide d’une mini plaque de pillage à 96 puits. À l’aide de la pipette multicanaux, transférez chaque échantillon dans le mini butin. Plaque de 96 puits.

Placez la plaque mini loot 96 puits dans un collecteur sous vide. Appliquez un aspirateur sur la plaque jusqu’à ce que les puits aient l’air secs. En règle générale, 15 minutes tout au long de ce protocole.

Il faut faire très attention à ne pas contaminer vos échantillons. Lorsque vous travaillez avec du 96, les plaques de puits gardent les puits couverts de bouchons autant que possible et évitez de passer votre pipette sur des puits ouverts, car toute goutte de liquide indésirable peut ruiner l’échantillon. Retirez la mini plaque de butin du collecteur d’aspirateur et bloquez le bas de la plaque avec une serviette en papier jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche.

Remettez l’ADN en suspension dans la plaque de 96 puits en ajoutant 30 microlitres d’eau distillée à chacun. Eh bien, placez la mini assiette de butin sur un agitateur orbital réglé à haute température pendant deux minutes.

Ensuite, transférez le contenu de la mini plaque de butin dans une plaque propre à 96 puits. Pour effectuer les réactions de ligature de l’éditeur de liens. Préparez la réaction de ligature en mélangeant une quantité suffisante de tampon de ligature, un linkers agenouillés de l’étape 3.2 T, quatre ADN ligase et de l’eau dans un réservoir de réactif.

À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 10 microlitres d’ADN digéré de l’étape précédente dans une nouvelle plaque à 96 puits. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux pour Eloqua 10 microlitres de la réaction de ligature à tous les puits de la plaque de 96 puits. Après tout, les puits ont été chargés d’ADN et de réactifs de ligature.

Incuber l’assiette pendant quatre heures jusqu’à toute la nuit à 16 degrés Celsius. Le lendemain matin. Mettez fin à la ligature en inactivant la T quatre Ligase à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Comme précédemment, nettoyez la réaction de ligature à l’aide de mini-plaques de butin et d’un collecteur sous vide pour sécher la plaque, puis épongez le fond de la plaque jusqu’à ce qu’il soit complètement sec. Remettre l’ADN en suspension dans 30 microlitres d’eau distillée doublement. Placez-le sur un agitateur orbital pendant deux minutes, puis transférez le contenu de la mini assiette de butin dans une assiette propre.

Ensuite, effectuez une deuxième digestion de l’ADN avec bam H one pour détruire les transposons de concat restants. Digérez l’ADN à 37 degrés Celsius pendant trois à six heures ou toute la nuit, puis la digestion est nettoyée à l’aide de mini-assiettes de butin en suivant la même procédure que précédemment. Effectuez une PCR de 30 cycles à l’aide d’une amorce spécifique pour la transposition et d’une amorce spécifique pour l’agent de liaison.

La réaction doit contenir trois microlitres d’ADN digéré avec des liants. Ensuite, nettoyez la réaction PCR à l’aide d’un mini-butin. 96 plaques de puits et un collecteur à vide comme réalisé précédemment.

Remettez l’ADN en suspension dans 30 microlitres d’eau et transférez les suspensions à un 96 propre. Bien joué, procédez en diluant deux microlitres de produits de réaction PCR dans 148 microlitres d’eau double distillée en utilisant seulement deux microlitres de produits dilués. Effectuez des PCR de 30 cycles à l’aide de versions imbriquées des amorces dans des volumes de 100 microlitres.

Ces apprêts sont destinés à la machine Illumina GA two X. Chaque échantillon aura un code-barres unique de 12 paires de bases de l’exécution PCR, 45 microlitres de chaque produit sur un gel à 1 % avec du bromure AUM. Il devrait y avoir un frottis de produits PCR représentant des amplicons des nombreuses insertions de transposons différentes dans la tumeur.

Utilisez la méthode de lavage sous vide décrite précédemment pour nettoyer les 50 microlitres de PCR restants, puis remettez l’ADN en suspension dans 50 microlitres d’eau et effectuez à nouveau le lavage sous vide. Maintenant, Resus, suspendez l’ADN dans 30 microlitres de TE et transférez-le sur une plaque propre à 96 puits. Déterminez la concentration d’ADN dans chaque échantillon.

Combinez ensuite des quantités égales d’ADN de chaque échantillon dans un seul tube. Il est possible de séquencer plusieurs centaines d’échantillons d’ADN en une seule voie d’une exploitation Illumina, à condition que chaque échantillon ait été généré à l’aide d’une amorce à code-barres distincte à l’aide du protocole. Un L-M-P-C-R réussi devrait amplifier des centaines de transposes sur les insertions dans une seule tumeur après avoir exécuté la moitié du produit PCR secondaire sur un gel à 1 %, un frottis d’ADN représente cette amplification.

Si la PCR LM échoue, il y aura une absence de frottis d’ADN. Au lieu de cela, vous verrez des bandes définitives de séquençage de l’ADN d’un à 200 tumeurs dans une seule voie de la plate-forme Illumina GA two X devrait produire plus de 30 millions de séquences de 100 paires de bases chacune lors de la tentative de cette procédure. Il est important de se rappeler de travailler lentement et soigneusement pour s’assurer qu’aucune contamination ne se produit après cette procédure.

L’analyse des facteurs génétiques du cancer récemment découverts peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : lesquels de ces facteurs pourraient être ciblés pour le traitement ?