Name: Identification des Belle au Bois Dormant Insertions de transposons dans les tumeurs solides en utilisant léditeur de liens médiée par PCR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Découvrez comment identifier des oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs par cartographie des insertions de transposons Sleeping Beauty dans un modèle murin. Cette méthode par PCR médiée par linker permet de découvrir de nouveaux conducteurs génétiques du cancer.

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Les auteurs tiennent à remercier Branden Moriarity, David Largaespada, et Vincent Keng à l&#39;Université du Minnesota, et Adam Dupuy à l&#39;Université de l&#39;Iowa pour leur aide dans l&#39;élaboration du protocole décrit ci-dessus.

1. L&#39;élevage et le vieillissement des animaux transgéniques <ol><li> Sélectionnez les souches de souris transgéniques appropriés pour votre expérience. Une expérience typique utilisera trois lignées transgéniques; une souris transposase conditionnelle, une souris hébergeant un concatémère de transposons, et une souris exprimant la recombinase Cre dans les cellules considérées comme les cellules d&#39;origine pour le cancer désiré. Si le cancer est modélisé a une mutation connue dans un grand pourcentage des patients, il peut être souhaitable d&#39;inclure cette mutation au début. Des exemples de ces «prédisposants» comprennent des mutations Kras activés, TP53 dominantes négatives ou un allèle Pten floxé. En ajoutant une mutation prédisposant le modèle peut mieux représenter le cancer chez l&#39;homme (voir 1.3). Plusieurs transposase Sleeping Beauty et souris transposons sont disponibles auprès de l&#39;Institut national du cancer du référentiel de la souris ( <a href="http://mouse.ncifcrf.gov/" target="_blank">http://mouse.ncifcrf.gov/</a> ). </li><li> Souris Race transposase conditionnelles avec des souris hébergeant les transposons pour finalement obtenir des souris homozygotes pour les deux allèles si possible. Race descendance homozygote chez la souris exprimant la recombinase Cre pour générer vos triples souris transgéniques expérimentales (Figure 2). Remarque: Pour obtenir des souris homozygotes sont pas toujours possibles ou idéal. Par exemple, homozygotes p53 dominantes souris négatifs sont beaucoup plus difficiles à élever que les souris hétérozygotes. En outre, il est utile de veiller à ce que les portées suivre la génétique mendélienne pour confirmer que le schéma de sélection est réussie. </li><li> Si vous utilisez un prédisposait, les souris se reproduisent abord avec la transposase à des souris avec l&#39;allèle prédisposant. Dans le même temps, les souris exprimant la recombinase Cre race à des souris portant les transposons. Créer des souris homozygotes pour chaque allèle si possible. Enfin, élever la descendance homozygote des deux précédents programmes de sélection afin de générer quadruple anim transgénique expérimentaleals. </li><li> En plus des animaux de laboratoire, de générer des cohortes de contrôle de la souris. Le groupe témoin se compose normalement de même portée de l&#39;élevage expérimental qui héritent seulement deux des trois allèles (figure 2). Dans le cas d&#39;un prédisposait, les souris, y compris trois des quatre allèles sera également nécessaire. </li><li> Surveiller les souris expérimentales et le contrôle quotidiens pour le développement de la tumeur et / ou un état moribond. Suivez votre soins aux animaux et utilisation comité (IACUC) les exigences pour l&#39;élevage. En outre, il est courant de déterminer un âge dans lequel vous allez sacrifier un animal si elle n&#39;est pas encore devenue moribonde. Dix-huit mois est un âge typique à laquelle les souris sont euthanasiées. </li></ol> 2. L&#39;autopsie des animaux transgéniques <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sure-Seal InducChambre tion </td><td> Arbre Scientific Brain </td><td> EZ-177 </td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td></tr><tr><td> 10% tamponnée de formaldéhyde </td><td> Sigma Aldrich </td><td> HT501128-4L </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Nécessaire. <ol><li> Lorsqu&#39;une souris est moribond ou a atteint la fin de la durée de vie déterminée, euthanasier des animaux en utilisant une chambre de CO 2 suivant vos directives IACUC. En général, placer l&#39;animal dans une chambre à gaz propre, ouvrir le réservoir de gaz et régler le régulateur de lire pas plus de 5 livres par pouce carré. Remplissez lentement pour minimiser l&#39;irritation nasale et oculaire et l&#39;aversion pour le CO 2. Assurez-vous que le cœur de l&#39;animal est ne bat plus et ne répond pas quand on les touche dans les yeux. </li><li> Extérieur pulvérisation de souris sacrifiées à l&#39;éthanol 70%. </li><li> Placer la souris sur une planche à l&#39;autopsie et sécuriser avec des épingles à dissection. Utilisez des ciseaux uned une pince pour ouvrir la souris et le prélèvement d&#39;organes. Déterminer quels sont les organes doivent être prélevés est un projet dépend. Toutefois, il est recommandé de toujours recueillir la rate et le foie que ces organes donnent souvent des indications importantes sur lesquelles la souris était moribond. Également recueillir le sternum de l&#39;analyse du potentiel de moelle osseuse. En outre, il est toujours bénéfique pour collecter n&#39;importe quel organe ou tissu qui semble anormale. </li><li> Les tissus et les tumeurs qui sont collectées devraient être divisé en quatre sections. Une section est fixé à 10% du formol tamponné pendant 18 heures suivie d&#39;éthanol à 70%. Cette section peut être utilisée pour la coloration H &amp; E et / ou IHC. Les trois dernières sections, qui sont généralement de 50 à 100 mg de taille, pression sont congelés dans l&#39;azote liquide. Ceux-ci peuvent être utilisés pour l&#39;ADN, de l&#39;ARN et de l&#39;isolement des protéines. </li><li> Jetez les mouchoirs carcasse restante et selon les directives du IACUC. </li></ol> 3. Isolement de l&#39;ADN génomique de tumeurs <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;Nom strong&gt; du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Solution de précipitation des protéines </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td></tr><tr><td> Tampon de lyse cellulaire </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td></tr><tr><td> TE Buffer </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 2. Nécessaire. <ol><li> Hacher finement l&#39;échantillon de tumeur congelée (50 à 100 mg) en utilisant une lame de rasoir propre. </li><li> Lieu hachée tissu dans un tube de 1,5 ml et ajouter 1 ml de tampon de lyse cellulaire contenant 5 pi protéinase K solution (20 mg / ml). </li><li> Vortex fond. </li><li> Incuber dans un shaker 55 ° C fixé à 250 tours par minute pendant au moins 4 heures, de préférence pendant la nuit. </li><li> Ajouter 1 RNase Une solution (10 mg / ml) et inverser tubes 25 fois. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Laisser refroidir à température ambiante en plaçant sur de la glace pendant 3 min. </li><li> Ajouter 333 ul de solution de précipitation des protéines et homogénéiser vigoureusement au vortex. </li><li> Centrifuger à 14000 rpm 10 min. Les protéines doivent granulés. Si pellet est très faible, vortex encore, incuber sur de la glace pendant 5 min, puis re-centrifugeuse. </li><li> Décanter le surnageant contenant l&#39;ADN dans un récipient propre tube de 15 ml centrifugeuse. </li><li> Ajouter un volume égal à 100% d&#39;isopropanol et mélanger doucement par inversion 50 fois. </li><li> Centrifuger à 3500 rpm pendant 3 min. </li><li> Rejeter le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 70% et inverser tube à plusieurs reprises à laver le culot. </li><li> Transférer le culot lavé avec de l&#39;éthanol à un tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger à 14000 rpm pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Verser l&#39;éthanol et inverser le tube à air sec (environ 5 à 30 minutes). </li><li> Resuspendre l&#39;ADN pEllet dans 50 à 500 ul de TE en fonction de la taille du culot d&#39;ADN. </li><li> D&#39;incubation en option à 37 ° C pour remettre en suspension l&#39;ADN. </li><li> Conserver à 4 ° C ou -20 ° C pour le stockage à long terme. </li></ol> 4. Linker médiation-PCR utilisant l&#39;ADN génomique à partir de tumeurs <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Bfai </td><td> New England Biolabs </td><td> R0568S </td></tr><tr><td> NlalII </td><td> New England Biolabs </td><td> R0125S </td></tr><tr><td> MinElute plaques de 96 puits </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td></tr><tr><td> QIAvac collecteur sous vide 96 </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td></tr><tr><td> Multi-MicroPlate Genie, 120V </td><td> Scientific Industries, Inc </td><td> SI-4000 </td></tr><tr><td> ADN ligase T4 avec du tampon de ligation 5x </td><td> Invitrogen </td><html><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> BamHI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0136S </td></tr><tr><td> 25 mM de dNTP </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td></tr><tr><td> Taq Platinum </td><td> Invitrogen </td><td> 10966-034 </td></tr><tr><td> FastStart polymérase Taq ADN </td><td> Roche </td><td> 12032929001 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Promega </td><td> V3121 </td></tr><tr><td> TAE Buffer </td><td> Promega </td><td> V4271 </td></tr><tr><td> TE Buffer </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr><tr><td> Le bromure d&#39;éthidium </td><td> Promega </td><td> H5041 </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 3. Nécessaire. Séquences de liaison Bfai linker + 5 &#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3&#39; Bfai linker-5 &#39;Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3&#39;NH2 &quot;&gt; Linker NlalII + 5&#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 &#39; NlalII linker-5 &#39;Phos-GTCCCTTAAGCGGAGCC 3&#39; Les séquences des amorces PCR primaire avant droite (NlalII): Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC PCR primaire avant côté gauche (bfai): Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC Primaire PCR inverse pour le côté droite et à gauche: Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC Côté secondaire PCR avant droite: Exemple d&#39;une amorce secondaire Illumina code-barres 5 &#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa (les N représente le code à barres de 12 pb, la séquence en majuscules sont requises pour la plateforme Illumina, et la séquence en minuscules se lie à l&#39;transposon.) PCR secondaire avant côté gauche: Exemple d&#39;une seconde Illumina code à barresapprêt dary 5&#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa (les N représentent le code à barres de 12 pb, la séquence en majuscules sont nécessaires pour la plate-forme Illumina, et la séquence en minuscules se lie à l&#39;transposon.) Secondaire PCR inverse pour le côté droite et à gauche: linker amorces emboîtées inverse 5 &#39;CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC <ol><li> Recuire le + et le - linkers pour linkers bfai deux linkers et NlaII en mélangeant 50 pi de linker + (100 uM) avec 50 ul de lieur-(100 M) et ajouter 2 pi de NaCl (5 M) dans un tube de 1,5 ml. Lieu à 95 ° C pour un autre 5 minutes. Éteignez bloc de chauffage et laisser refroidir lentement à température ambiante (cela prend une heure ou plus). Après refroidissement, linkers recuits peuvent être stockés dans un congélateur à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Préparer deux aliquotes de l&#39;ADN tumoral, chaque aliquote contenant 1 ug d&#39;ADN. Un aliquot sera digéré espritenzyme de restriction qui coupe ha à proximité de la &quot;bonne&quot; fin du transposon. La seconde partie aliquote sera digéré par une enzyme de restriction qui coupe à proximité de la &quot;gauche&quot; fin du transposon. Ceci est fait pour maximiser les chances de amplifiant chaque site d&#39;insertion du transposon. </li><li> Digérer l&#39;ADN tumoral dans une partie aliquote en utilisant le &quot;droit&quot; NlaII enzyme côté, et de digérer l&#39;ADN tumoral dans la partie aliquote autre en utilisant la &quot;gauche&quot; enzyme côté bfai: mélanger 1 ul d&#39;enzyme, 5 pl de tampon NEB 10x n ° 4, l&#39;ADN ( 1 pg) et ddH 2 O pour un volume total de 50 ul. Digest ADN nuit à 37 ° C au bain-marie ou un incubateur. </li><li> Chauffer inactiver les enzymes (bfai = 80 ° C pendant 20 min, NlalII = 65 ° C pendant 20 minutes). </li><li> Nettoyez les échantillons digérés en plaçant des échantillons dans MinElute plaque de 96 puits, plaque lieu dans le collecteur sous vide et le vide pendant environ 15 min jusqu&#39;à ce que les puits air sec. </li><li> Retirer la plaque du collecteur à vide et en bas blot de plaque de 96 puits avec une serviette en papier pour enlever tout liquidationd </li><li> Ajouter 30 ul ddH 2 O dans chaque puits et agiter sur un ensemble agitateur orbital à température élevée pendant 2 min, ou pipeter le haut et le bas 20 à 40 fois. </li><li> Transfert volume entier dans les puits (30 pi) de MinElute plaque de 96 puits dans des plaques 96 puits propre. </li><li> Effectuer des réactions de ligature linker avec l&#39;ADN digéré de l&#39;étape 4.8 et linkers de l&#39;étape 4.1. Mélanger 10 ul d&#39;ADN digéré, 4 pi de tampon de ligature 5x, 5,5 pl linkers recuit (950 pg / pl), 0,5 ul de ligase T4 (5 U / pl). </li><li> Incuber pendant 4 heures ou toute la nuit à 16 ° C. </li><li> Une inactivation de l&#39;ADN ligase T4 à 65 ° C pendant 10 min. </li><li> Nettoyer ligature en utilisant MinElute plaques de 96 puits et un collecteur à vide comme décrit dans les étapes de 4,5 à 4,6. </li><li> Remettre en suspension dans 30 ul de H 2 O et transférer dans un propre plaque de 96 puits. </li><li> Effectuer une digestion de l&#39;ADN seconde afin de détruire restant concatémère transposons. Ce résultat est obtenu en coupant l&#39;ADN une deuxième fois avec une enzyme qui coupe le plasmide vADN ecteur qui a été utilisé pour créer des souris transgéniques contenant le transposon concatémère. </li><li> Digest ADN en utilisant BamHI (côté gauche et droit): Mélanger 25 ul de lieur-ligaturé l&#39;ADN de l&#39;étape 4.13, 5 pl de tampon NEB 10x n ° 3, 0,5 pi BamHI (20 U / pl), 0,5 ul de BSA (10 mg / ml ), et 19 ul ddH 2 O. </li><li> Digest 3-6 heures ou toute la nuit à 37 ° C. </li><li> Effectuer primaire PCR en utilisant une amorce spécifique du transposon et une amorce spécifique de la liaison. Ceux-ci varient en fonction de ce transposon et l&#39;éditeur de liens que vous utilisez. Les amorces énumérées dans le tableau ci-dessus apprêt de travail pour la T2/Onc et T2/Onc2 transposons. </li><li> PCR primaire: 5 pi de tampon 10x, 2,0 ul de MgCl2 (50 mM), 4 pl dNTP (2,5 nM), 1 pl Primer 1 (20 uM), 1 pl Primer 2 (20 uM), 0,25 Platinum Taq ul (5 U / pl), 3 pl ADN digéré avec des linkers (le montant peut varier), jusqu&#39;à 50 pi ddH 2 O. </li><li> PCR programme: 94 ° C pendant 5 min, 30 cycles de 94 ° C pendant 30 sec, 60 &amp; dpar exemple, C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 90 sec. Extension finale à 72 ° C pendant 5 min. </li><li> Nettoyer produit de PCR utilisant MinElute plaques de 96 puits et un collecteur à vide comme décrit ci-dessus. </li><li> Remettre en suspension dans 30 ul de H 2 O et transférer dans un propre plaque de 96 puits. </li><li> Faire une dilution 1:75 du 1 ° PCR en diluant 2 pl d&#39;ADN de l&#39;étape 4.21 dans 148 ul O ddH 2 </li><li> Effectuer secondaire PCR en utilisant des versions imbriquées des amorces qui ont également la séquence requise pour la machine Illumina GAIIx ainsi que d&#39;un code à barres de base 12 paire qui est unique pour chaque échantillon de la tumeur traitée (voir le tableau ci-dessus apprêt pour des exemples de ces amorces). </li><li> PCR secondaire: 10 ul de tampon 10x avec MgCl2, 8 pi de dNTP (2,5 mM), 1 pl Illumina code à barres amorce secondaire (20 uM), 1 pl Nest Illumina 1 couche secondaire (20 uM), 0,25 ul FastStart Taq (5 U / pl ), 2 pl de l&#39;ADN 1:75 PCR primaires dilués jusqu&#39;à 100 pi ddH 2 O. </li><li> PCR programme: 94 °; C pendant 2 min, 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 53 ° C pendant 45 sec, 72 ° C pour 90 sec. Extension finale à 72 ° C pendant 5 min. </li><li> Exécuter 45 ul de cette réaction de PCR sur un gel d&#39;agarose 1% contenant du bromure d&#39;éthidium (0,5 pg / ml). Il devrait y avoir un «frottis» des produits de PCR représentant des amplicons de nombreuses insertions de transposons les différentes dans la tumeur (figure 3). </li><li> Nettoyer restante de 50 ul du produit de PCR utilisant MinElute plaques de 96 puits et un collecteur à vide comme décrit ci-dessus. Laver une fois en plaçant 50 pl ddH 2 O dans les puits et aspirer à nouveau. </li><li> Remettre en suspension dans 30 pl de TE et transférer dans un propre plaque de 96 puits. </li><li> Déterminer la concentration d&#39;ADN dans chaque échantillon. Mélanger des quantités égales d&#39;ADN dans un seul tube de 1,5 ml de centrifugeuse. Ce sera la bibliothèque qui est séquencé en une seule voie d&#39;une Illumina HiSeq 2000 de la machine. Il est possible de séquencer plusieurs centaines de tumeurs sur une seule voie d&#39;une course d&#39;Illumina. </li><li> Soumettrele tube unique contenant des quantités égales de l&#39;ADN à partir de toutes les tumeurs pour le séquençage. Cela peut être fait par votre institution ou dans le commerce. </li></ol> 5. Analyse des insertions de transposons <ol><li> Logiciel d&#39;analyse de données insertion d&#39;un transposon est disponible en téléchargement gratuit via SourceForge ( <a href="http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/" target="_blank">http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/</a> ). Le programme, appelé claquettes, nécessite le fichier de séquence à partir de la plate-forme Illumina et un code à barres fichier de bibliothèque texte de la carte. </li></ol>

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
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<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
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<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
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<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Un écran vers l&#39;avant génétique à l&#39;aide de la Belle au Bois Dormant système transposon fournit une méthode pour identifier les mutations qui causent le cancer. En sélectionnant le promoteur adéquat pour contrôler la recombinase Cre en plus des mutations prédisposant, l&#39;écran SB permettra d&#39;identifier de nouveaux gènes connus et candidats cancer. Le succès d&#39;un écran SB est largement tributaire des souris sélectionnées pour créer l&#39;écran. Pour le tra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Chambre à induction Sure-Seal </td><td> Arbre Scientific Brain </td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td><td></td></tr><tr><td> 10% tamponnée de formaldéhyde </td><td> Sigma Aldrich </td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td> Solution de précipitation des protéines </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de lyse cellulaire </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE Buffer </td> &lt;td&gt; Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> Bfai </td><td> New England Biolabs </td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlalII </td><td> New England Biolabs </td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> MinElute plaques de 96 puits </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> QIAvac collecteur sous vide 96 </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-MicroPlate Genie, 120V </td><td> Scientific Industries, Inc </td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> ADN ligase T4 avec du tampon de ligation 5x </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> DNTP 25 mM </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td> Taq Platinum </td><td> Invitrogen </td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td> FastStart polymérase Taq ADN </td><td> Roche </td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Promega </td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> TAE Buffer </td><td> Promega </td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE Buffer </td><td> Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> Le bromure d&#39;éthidium </td><td> Promega </td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

identification des<em&gt; belle au bois dormant</em&gt; insertions de transposons dans les tumeurs solides en utilisant l&#39;éditeur de liens médiée par pcr

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Génomiques, les analyses protéomiques, transcriptomiques, et épigénomiques de tumeurs humaines indiquent qu&#39;il ya des milliers d&#39;anomalies au sein de chaque génome du cancer par rapport aux tissus normaux appariés. Sur la base de ces analyses, il est évident qu&#39;il ya beaucoup d&#39;inconnues pilotes génétiques du cancer 1. Malheureusement, ces pilotes sont cachés dans un plus grand nombre d&#39;anomalies particulières dans le génome qui ne contribuent pas directement à la formation de tumeurs. Un autre aspect du génome du cancer, c&#39;est qu&#39;il ya grande hétérogénéité génétique au sein des mêmes types de tumeurs. Chaque tumeur peut héberger des mutations différentes qui offrent un avantage sélectif pour la formation de tumeurs 2. Exécution d&#39;une impartiale écran vers l&#39;avant génétique chez la souris fournit les outils pour générer des tumeurs et d&#39;analyser leur composition génétique, tout en réduisant le contexte de mutations particulières. La Belle au bois dormant (SB) transposon système est une de ces méthodes 3. Le système utilise SB portable vecteurs (transposons) qui peuvent être insérés dans le génome par l&#39;enzyme transposase. Mutations sont limités à un type de cellule spécifique grâce à l&#39;utilisation d&#39;un allèle conditionnel transposase qui est activé par la recombinase Cre. Il existe de nombreuses lignées de souris qui expriment la recombinase Cre dans des tissus spécifiques. En croisant l&#39;une de ces lignes à l&#39;allèle transposase conditionnelle (par exemple Lox-stop-Lox-SB11), le système ASR est activé uniquement dans les cellules qui expriment la recombinase Cre. La recombinase Cre sera une cassette d&#39;accise arrêt qui bloque l&#39;expression de l&#39;allèle transposase, activant ainsi mutagenèse par transposon dans le type de cellule désignée. Un écran SB est initiée par l&#39;élevage de trois souches de souris transgéniques afin que les souris expérimentales porteurs d&#39;un allèle conditionnel transposase, un concatémère de transposons, et un allèle spécifique du tissu recombinase Cre. Ces souris sont autorisés à l&#39;âge jusqu&#39;à la formation de tumeurs et ils deviennent moribonds. Les souris sont ensuiteADN autopsiés et génomique est isolé à partir des tumeurs. Ensuite, l&#39;ADN génomique est soumis à une liaison médiée par PCR (LM-PCR) qui entraîne une amplification du locus génomiques contenant un transposon SB. LM-PCR réalisée sur une seule tumeur se traduira par des centaines de amplicons distincts représentant les centaines de loci génomiques contenant insertions de transposons dans un 4 seule tumeur. Les insertions de transposons dans toutes les tumeurs sont analysées et sites d&#39;insertion communs (Ciss) sont identifiés à l&#39;aide d&#39;une méthode statistique appropriée 5. Gènes au sein de la CEI sont très susceptibles d&#39;être des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs, et sont considérés comme les gènes du cancer candidats. Les avantages de l&#39;utilisation du système SB pour identifier les gènes responsables du cancer candidats sont les suivants: 1) le transposon peut être facilement localisé dans le génome parce que sa séquence est connue, 2) la transposition peuvent être adressées à presque n&#39;importe quel type de cellule et 3) le transposon est capable de introduire à la fois le gain et la perte-de-fonction-6 mutations. Le following protocole décrit comment concevoir et d&#39;exécuter un écran vers l&#39;avant génétique à l&#39;aide du système SB transposon pour identifier les gènes responsables du cancer candidats (Figure 1).

Après le schéma de sélection a été mis en place, les éleveurs doivent produire une portée tous les 19-21 jours. La taille des portées varie entre 5 et 12 chiots, en fonction de l&#39;âge des éleveurs et l&#39;arrière-plan génétique. En outre, assurez-vous que le génotype de la litière suit la génétique mendélienne comme un moyen de confirmer que le schéma de sélection est à la fois correcte et réussie. Pour que l&#39;expérience soit un succès, l&#39;incidence des tumeurs chez les animaux de ...

Procédé d&#39;identification de la cancérogenèse conducteurs inconnus en utilisant une approche impartiale est décrit. La méthode utilise l&#39;<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Transposon comme un agent mutagène aléatoire dirigé vers des tissus spécifiques. Cartographie génomique des insertions de transposons qui sous-tendent la formation de tumeurs identifie nouveaux oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs

Identification des<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Insertions de transposons dans les tumeurs solides en utilisant l&#39;éditeur de liens médiée par PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cette procédure montre comment identifier de nouveaux oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs en cartographiant les insertions chez la souris qui entraînent la formation de tumeurs. Ceci est accompli en générant et en récoltant d’abord des tumeurs à partir du modèle de souris transgénique. Les prochaines étapes de la procédure consistent à isoler l’ADN tumoral, à effectuer une PCR médiée par linker, puis à séquencer les échantillons d’ADN amplifiés et à analyser la transposition sur les insertions.En fin de compte, la procédure identifie les gènes moteurs de tumeurs candidats. Le principal avantage de l’utilisation de la PCR médiée par linker en conjonction avec un dépistage génétique non biaisé à l’aide de transposons de la belle au bois dormant, est que nous pouvons facilement identifier de nouveaux facteurs génétiques du cancer. Commencez toujours la dissection en vaporisant l’extérieur de la souris sacrifiée avec de l’éthanol à 70 %.Les tissus et les tumeurs collectés doivent être divisés en quatre sections, d’une taille de 50 à 100 milligrammes. Fixez une section dans de la formine tamponnée à 10 % pendant 18 heures, suivie d’éthanol à 70 %. Cette section peut être utilisée pour la coloration h et e et/ou l’immunohistochimie.Congelez rapidement les sections restantes dans de l’azote liquide. Ceux-ci peuvent être conservés dans un congélateur et utilisés pour le D-N-A-R-N-A et l’isolement des protéines afin de collecter l’ADN d’un échantillon de tumeur congelé. Tout d’abord, hachez finement le tissu avec une lame de rasoir.Ensuite, digérez le tissu dans un tube de 1,5 millilitre avec un millilitre de tampon de lyse cellulaire et cinq microlitres de 20 milligrammes par millilitre. La solution de protéase K tourbillonne soigneusement le mélange et procède à une extraction d’ADN standard à base d’isopropanol. Commencez ce protocole en recuit les linkers dans un tube de 1,5 millilitre.Mélangez 50 microlitres de chaque solution d’agent de liaison avec deux microlitres de chlorure de sodium concentré. Placez ensuite le tube dans un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius. Après cinq minutes, éteignez le feu et laissez-le refroidir lentement à température ambiante, ce qui peut prendre une heure ou plus après le refroidissement.Les linkers anaux peuvent être conservés au congélateur jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Préparez 2 plaques de 96 puits par Ali en citant un microgramme d’ADN de chaque échantillon dans les puits correspondants dans les deux plaques de 96 puits. Par exemple, placez un microgramme d’ADN de l’échantillon dans le puits A de l’une des deux plaques de puits.L’ADN de l’une des plaques de 96 puits sera digéré à l’aide de l’enzyme NLA trois du côté droit et les échantillons d’ADN de l’autre plaque de 96 puits à l’aide de l’enzyme BFA 1 du côté gauche. Laissez l’ADN digérer pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, terminez la digestion par la chaleur, en inactivant les enzymes pendant 20 minutes.Nettoyez maintenant les réactions de digestion à l’aide d’une mini plaque de pillage à 96 puits. À l’aide de la pipette multicanaux, transférez chaque échantillon dans le mini butin. Plaque de 96 puits.Placez la plaque mini loot 96 puits dans un collecteur sous vide. Appliquez un aspirateur sur la plaque jusqu’à ce que les puits aient l’air secs. En règle générale, 15 minutes tout au long de ce protocole.Il faut faire très attention à ne pas contaminer vos échantillons. Lorsque vous travaillez avec du 96, les plaques de puits gardent les puits couverts de bouchons autant que possible et évitez de passer votre pipette sur des puits ouverts, car toute goutte de liquide indésirable peut ruiner l’échantillon. Retirez la mini plaque de butin du collecteur d’aspirateur et bloquez le bas de la plaque avec une serviette en papier jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche.Remettez l’ADN en suspension dans la plaque de 96 puits en ajoutant 30 microlitres d’eau distillée à chacun. Eh bien, placez la mini assiette de butin sur un agitateur orbital réglé à haute température pendant deux minutes.Ensuite, transférez le contenu de la mini plaque de butin dans une plaque propre à 96 puits. Pour effectuer les réactions de ligature de l’éditeur de liens. Préparez la réaction de ligature en mélangeant une quantité suffisante de tampon de ligature, un linkers agenouillés de l’étape 3.2 T, quatre ADN ligase et de l’eau dans un réservoir de réactif.À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 10 microlitres d’ADN digéré de l’étape précédente dans une nouvelle plaque à 96 puits. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux pour Eloqua 10 microlitres de la réaction de ligature à tous les puits de la plaque de 96 puits. Après tout, les puits ont été chargés d’ADN et de réactifs de ligature.Incuber l’assiette pendant quatre heures jusqu’à toute la nuit à 16 degrés Celsius. Le lendemain matin. Mettez fin à la ligature en inactivant la T quatre Ligase à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.Comme précédemment, nettoyez la réaction de ligature à l’aide de mini-plaques de butin et d’un collecteur sous vide pour sécher la plaque, puis épongez le fond de la plaque jusqu’à ce qu’il soit complètement sec. Remettre l’ADN en suspension dans 30 microlitres d’eau distillée doublement. Placez-le sur un agitateur orbital pendant deux minutes, puis transférez le contenu de la mini assiette de butin dans une assiette propre.Ensuite, effectuez une deuxième digestion de l’ADN avec bam H one pour détruire les transposons de concat restants. Digérez l’ADN à 37 degrés Celsius pendant trois à six heures ou toute la nuit, puis la digestion est nettoyée à l’aide de mini-assiettes de butin en suivant la même procédure que précédemment. Effectuez une PCR de 30 cycles à l’aide d’une amorce spécifique pour la transposition et d’une amorce spécifique pour l’agent de liaison.La réaction doit contenir trois microlitres d’ADN digéré avec des liants. Ensuite, nettoyez la réaction PCR à l’aide d’un mini-butin. 96 plaques de puits et un collecteur à vide comme réalisé précédemment.Remettez l’ADN en suspension dans 30 microlitres d’eau et transférez les suspensions à un 96 propre. Bien joué, procédez en diluant deux microlitres de produits de réaction PCR dans 148 microlitres d’eau double distillée en utilisant seulement deux microlitres de produits dilués. Effectuez des PCR de 30 cycles à l’aide de versions imbriquées des amorces dans des volumes de 100 microlitres.Ces apprêts sont destinés à la machine Illumina GA two X. Chaque échantillon aura un code-barres unique de 12 paires de bases de l’exécution PCR, 45 microlitres de chaque produit sur un gel à 1 % avec du bromure AUM. Il devrait y avoir un frottis de produits PCR représentant des amplicons des nombreuses insertions de transposons différentes dans la tumeur.Utilisez la méthode de lavage sous vide décrite précédemment pour nettoyer les 50 microlitres de PCR restants, puis remettez l’ADN en suspension dans 50 microlitres d’eau et effectuez à nouveau le lavage sous vide. Maintenant, Resus, suspendez l’ADN dans 30 microlitres de TE et transférez-le sur une plaque propre à 96 puits. Déterminez la concentration d’ADN dans chaque échantillon.Combinez ensuite des quantités égales d’ADN de chaque échantillon dans un seul tube. Il est possible de séquencer plusieurs centaines d’échantillons d’ADN en une seule voie d’une exploitation Illumina, à condition que chaque échantillon ait été généré à l’aide d’une amorce à code-barres distincte à l’aide du protocole. Un L-M-P-C-R réussi devrait amplifier des centaines de transposes sur les insertions dans une seule tumeur après avoir exécuté la moitié du produit PCR secondaire sur un gel à 1 %, un frottis d’ADN représente cette amplification.Si la PCR LM échoue, il y aura une absence de frottis d’ADN. Au lieu de cela, vous verrez des bandes définitives de séquençage de l’ADN d’un à 200 tumeurs dans une seule voie de la plate-forme Illumina GA two X devrait produire plus de 30 millions de séquences de 100 paires de bases chacune lors de la tentative de cette procédure. Il est important de se rappeler de travailler lentement et soigneusement pour s’assurer qu’aucune contamination ne se produit après cette procédure.L’analyse des facteurs génétiques du cancer récemment découverts peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : lesquels de ces facteurs pourraient être ciblés pour le traitement ?

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