Name: Létablissement dune culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte In vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Découvrez comment établir des cultures polarisées de cellules Calu-3 recouvertes de liquide en utilisant un système de culture Transwell. Cette méthode permet d'étudier la fonction épithéliale des voies respiratoires.

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Les auteurs tiennent à remercier Elisabeth Blanchard pour son assistance technique. Les constatations et conclusions présentées dans ce rapport sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des Centers for Disease Control and Prevention.

1. La culture de cellules Calu-3 pour une utilisation dans les cultures Transwell Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. <ol><li> Pour décongeler des cellules de congélation: <ol><li> Préparer Eagle milieu essentiel minimum contenant 20% de sérum de sérum fœtal bovin (FBS), 0,1 mM non-acides aminés essentiels, 2 mM de L-glutamine, et 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). -Filtre stérile au milieu préparé à l&#39;aide d&#39;un 0,2 um de taille de pore du filtre, et au chaud dans un bain-marie à 37 ° C. Pour être plus représentatif de l&#39;épithélium des voies aériennes dans l&#39;environnement in situ, moyen n&#39;est pas supplémenté avec des antibiotiques ou antifongiques. </li><li> Décongeler un tube cryogénique congelé des cellules Calu-3 rapidement (&lt;1 min) dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Transférer les cellules décongelées dans un tube conique de 50 ml stérile et ajouter 30 ml d&#39;EMEM chauffée-20% + S. </li><li> Granules des cellules par centrifugation pendant 5 min à 1000-1200 xg,sans réfrigération, et avec une vitesse de frein est bas. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension délicatement les cellules dans 5 ml de EMEM chauffée-20% + S en pipetant doucement de haut en bas. Graine 2 à 5 × 10 6 cellules par puits dans une plaque à 6 puits de culture de tissu et incuber à 37 ° C, CO 7% 2 dans l&#39;atmosphère de l&#39;air jusqu&#39;à ce que les cellules sont 75% - 80% de confluence. Vérifiez tous les jours, jusqu&#39;à 7 jours peut être nécessaire. Tous les 3-4 jours aspirer le fluide à partir des cellules et le remplacer avec des produits frais EMEM-20% + S. </li></ol></li><li> Pour les cellules sous-culture: <ol><li> Chaud trypsine 0,05% - 0,02% d&#39;EDTA dans un bain à 37 ° C. Aspirer le fluide à partir des cellules, et laver les cellules une fois avec de la trypsine 0,05% chaud - 0,02% d&#39;EDTA pour éliminer l&#39;excès et milieu sérique. Retirez le lavage et ajouter 1 ml de trypsine réchauffé par puits pour les cellules. </li><li> Incuber à 37 ° C et 7% de CO 2 et de contrôle au microscope toutes les 5 min jusqu&#39;à ce qu&#39;au moins 75% des cellules détacher du puits (s) de la plaque de culture tissulaire. Cela peutprendre entre 5 et 30 min. </li><li> Laver les cellules dans du EMEM-20% + S pour éliminer la trypsine excès. Transférer les cellules trypsinisées à un tube conique de 50 ml stérile. Plusieurs puits de cellules d&#39;une plaque de culture à 6 puits peuvent être regroupés en un seul tube conique de 50 ml stérile. Ajouter 30 ml de EMEM-20% + S et sédimenter les cellules par centrifugation à 1000-1200 xg, sans réfrigération, et avec une vitesse de frein est bas. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension délicatement les cellules en eau douce EMEM-20% + S en pipetant doucement de haut en bas. En utilisant les étapes 1.2.1 1.2.3 ci-dessus par le biais de trypsiniser cellules, les cellules continuent de sous-culture dans des boîtes de culture de tissus comme décrit dans les étapes 1.2.5 1.2.7 travers quand ils sont entre 75 - 80% de confluence. </li><li> Subculture d&#39;un puits d&#39;une plaque à 6 puits jusqu&#39;à un T-flacon de 25 cm2 dans un volume final de 5 ml de EMEM-20% + S, l&#39;ensemencement de 0,5 à 1 × 10 6 cellules / flacon. </li><li> Avec 5 ml de trypsine réchauffé par T-flacon de 25 cm2 pour détacher les cellules, sous-cultured&#39;un T-25 cm 2 jusqu&#39;à une fiole T-75 cm 2 ballon dans un volume final de 10 ml de milieu EMEM-20% + S, entre l&#39;ensemencement de 1 à 5 x 10 6 cellules / flacon. </li><li> Utilisation 8 ml réchauffé par la trypsine T-flacon de 75 cm2 pour détacher les cellules, d&#39;une sous-culture T-75 cm 2 en 2 flacon T-75 cm 2 flacons. Pour une croissance optimale des cellules, les cellules ne sont pas sous-culture dans des flacons de plus de T-75 cm 2 ou sous-culture à un ratio supérieur à 1 flacon parent: 3 nouveaux flacons. </li></ol></li><li> Une fois que les cellules ont été repiquées, supprimer complètement et remplacer milieu tous les 2 à 3 jours jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la confluence 75-90%. Les cellules peuvent prendre jusqu&#39;à 3 semaines pour atteindre 75-90% de confluence. Pour la génération optimale des cultures de cellules polarisées, subculture, avant qu&#39;ils cultivent au-delà de 90% de confluence en monocouche. </li><li> Continuer jusqu&#39;à ce que la sous-culture de cellules suffisamment de cellules se sont développées pour ensemencer le nombre désiré d&#39;inserts Transwell. Chaque insert Transwell exige 2 × 10 5 cellules. Pour des performances optimales générer cultures polarisés, utiliser des cellules qui ont subi pas plus de 10 sous-cultures. </li></ol> 2. Croissance Polarized Calu-3 Liquide couvertes de cultures (LCC) Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. <ol><li> Préparer EMEM contenant 10% de FBS (EMEM-10%) et au chaud dans un bain-marie à 37 ° C. </li><li> Préparer une plaque de 24 puits Transwell pour l&#39;ensemencement. En utilisant une pince stérile, déplacer inserts Transwell de l&#39;intérieur aux lignes extérieures de la plaque sans toucher la membrane insert. Les cellules ne doivent être repiquées dans des puits sur les lignes extérieures de la plaque. Pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans les compartiments basolatéral, ajouter 600 ul de milieu EMEM-10% à chacun en inclinant la pipette contre la paroi de chaque compartiment et relâchant lentement le support dans le puits. </li><li> Détacher les cellules de T-75 cm 2 de tissu. Par voie sousflacons lture l&#39;aide de trypsine réchauffé, et laver dans 30 ml de EMEM-20% + S pour tous les 2 flacons de cellules trypsinisées, tel que décrit à l&#39;étape 1.2. </li><li> Bien remettre en suspension les cellules lavées dans 5 ml de EMEM-10% en pipetant doucement de haut en bas. </li><li> Déterminez nombre de cellules viables totales par la méthode d&#39;exclusion au bleu trypan. Effectuez cette opération uniquement si 80% - 90% sont viables. </li><li> 50 ml dans un tube conique stérile, diluer les cellules à une concentration de 2 x 10 6 cellules viables / ml avec EMEM-10%. </li><li> Ajouter à cellules du compartiment apical de chaque Transwell. Pour les puits A1 et D1, qui seront des puits de contrôle acellulaires, qui est, flans, ajouter 100 ul de MEM-10% sans cellules. Pour chacun des puits restants, ajouter 100 ul d&#39;extrait cellules Calu-3, pêche à la ligne doucement la pipette contre le canal de guidage intérieur de la paroi d&#39;insertion et libérant lentement les cellules. Ne touchez pas la pipette sur la membrane d&#39;insertion. Afin de maintenir une suspension homogène de cellules Calu-3, agiter doucement la suspension cellulaireau cours de cette étape d&#39;ensemencement. </li><li> Incuber Transwell plaque à 37 ° C et 7% de CO 2 dans l&#39;atmosphère de l&#39;air. Placer la plaque dans un incubateur où les perturbations physiques seront minimes. Pour améliorer l&#39;efficacité de polarisation, ne pas empiler les plaques les unes sur les autres. </li><li> Pour maintenir les cultures jusqu&#39;à polarisée et prête à l&#39;emploi dans les expériences, remplacer complètement milieu dans Transwells, comme décrit dans les étapes 2,10 à 2.13 ci-dessous. Milieu doit être entièrement remplacé trois jours après avoir été repiquées dans Transwells, puis sur un cycle alterné entre le quatrième et troisième après l&#39;alimentation précédente, jusqu&#39;à ce que les cellules sont complètement polarisées. </li><li> Chaud EMEM-10% dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Aspirer moyenne des inserts Transwell. Avec une pipette capillaire relié à un piège à vide avec un léger vide, ou à une norme de pipette de 1 ml, moyenne aspiration de puits sans cellules A1 et D1, puis ensemencé à partir des puits, enlever premier milieu apical de tous les puits, et tpoule élimination du milieu basolatéral de tous les puits. Ne pas toucher les membranes d&#39;insertion tout en aspirant à moyen terme. </li><li> Ajouter 200 ul de milieu EMEM-10% au compartiment apical de la cellule sans puits A1 et D1, puis ensemencés dans les puits, diriger le milieu dans le compartiment apical avec le côté de l&#39;insert pour guider la pointe de la pipette. Ne pas ajouter de support directement sur les cellules, et ne pas toucher la membrane d&#39;insertion. </li><li> Ajouter 600 ul de milieu EMEM-10% dans les compartiments basolatéral. Pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans les compartiments basolatéral, ajouter à chaque support d&#39;une pêche à la ligne par la pipette contre la paroi de chaque compartiment et le moyen de libération lente dans le puits. </li></ol> 3. Développement de la résistance de l&#39;évaluation Calu-3 LCC Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. <ol><li> Évaluer trans-épithélial résistance électrique (TEER) de Calu-3 LCC 30 minutes aprèschangements de milieu, l&#39;évaluation peut être effectuée après chaque changement de milieu si vous le souhaitez. Effectuer des mesures dans des conditions stériles. Commencez avec des mesures de contrôle acellulaire puits A1 et D1 (les blancs) pour obtenir des mesures de référence, et continuer avec les mesures pour chaque puits. <ol><li> Dans des conditions stériles, transférer l&#39;électrode STX2 un tube à centrifuger de 50 ml contenant 70% d&#39;éthanol dans de l&#39;eau stérile, et stériliser 15 minutes. </li><li> Calibrer et tester l&#39;voltohmmeter pour une utilisation selon les instructions du fabricant. </li><li> Retirer l&#39;électrode de l&#39;éthanol, de l&#39;air sec 5-10 sec et rincer l&#39;électrode avec stérile EMEM-10%. </li><li> Réglez le commutateur de mode de la voltohmmeter au réglage de la résistance, et mettez sous tension. </li><li> Placer doucement l&#39;électrode dans l&#39;un des orifices 3 qui permettent d&#39;accéder dans le compartiment basolatéral de la culture une Transwell. Placer l&#39;électrode de telle sorte que la tête légèrement plus seulement touche le fond du puits extérieur et reste vertical,et la plus courte est de plomb dans le milieu de culture de tissu du compartiment apical, sans toucher la membrane insert. </li><li> Appuyez sur &quot;Mesure R&quot;, et attendre que la lecture se stabilise. Répéter pour les 2 autres ports pour chaque puits et enregistrer les mesures de tous les trois ports, pour un total de trois mesures par puits. Continuer à mesurer la résistance de tous les puits de cellules. </li><li> Nettoyer l&#39;électrode par trempage 5-10 min dans de l&#39;éthanol à 70%, rinçage à l&#39;O stérile dH 2, et sécher soigneusement. Stocker dans le récipient d&#39;origine. </li><li> Calculer la résistance de chacun des puits, en utilisant l&#39;équation 1. Ω = Ω réelle échantillon - Ω vide, l&#39;équation 1 où l&#39;échantillon Ω est la mesure moyenne d&#39;un puits épépiné et Ω vierge est la mesure moyenne de la 2 puits, A1 et D1, contenant des inserts et des moyens, mais pas de cellules. </li><li> Calculer la résistance unité de surface, à l&#39;aide Equation 2. Ω × réelle surface de membrane efficace = Ω × cm 2, l&#39;équation 2 où la surface de membrane efficace est de 0,33 cm 2 pour les inserts Transwell de 24 puits. </li></ol></li><li> Vérifiez que la polarisation est complète en effectuant un essai secondaire, la mesure de la diffusion passive de fluorescéine de sodium entre les compartiments apical et basolatéral, sur une à trois cultures Transwell. Les puits utilisés pour le dosage de fluorescéine de sodium doit être jetée immédiatement après la fin de l&#39;essai. <ol><li> Préparer non fluorescent tampon (118 mM NaCl; 4,75 mM de KCl; 2,53 mM de CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM de KH 2 PO 4; 25 mM NaHCO 3 dans de l&#39;eau stérile; filtre stérile de 0,45 um dispositif de filtration ). Préparer la fluorescéine de sodium à 1 mg / ml dans un tampon non fluorescent, filtre stérile, envelopper dans du papier aluminium, et conserver à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière. Réchauffer à la salle de temre avant de l&#39;utiliser. </li><li> Après avoir terminé les mesures de résistance, retirez soigneusement moyen de deux compartiments basolatéral et apical de un à trois cultures Transwell individuels. </li><li> Rincer cultures Transwell. Ajouter délicatement 600 ul de PBS à température ambiante stérile Dulbecco (D-PBS) pour les compartiments basolatéral et 100 pi température ambiante stériles D-PBS dans les compartiments apical. </li><li> Retirez délicatement D-PBS dans les puits. Ajouter 600 ul stérile non fluorescent tampon dans les compartiments basolatéral. Ajouter 100 ul stérile 1 fluorescéine sodique mg / ml dans les compartiments apicales. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 heure. CO 2 n&#39;est pas nécessaire pendant cette incubation. </li><li> Pendant l&#39;incubation, préparer un sel de sodium de fluorescéine courbe standard comprise entre 20 pg / ml et 0 pg / ml, en utilisant non fluorescent tampon pour diluer la fluorescéine de sodium. Préparer au moins 8 différentes concentrations de fluorescéine de sodium, chacun dans un volume final de 600 pl au moins. Garderdilutions courbe standard abri de la lumière jusqu&#39;au moment de mesurer l&#39;absorbance. </li><li> Transférer le tampon d&#39;échantillon non fluorescent du compartiment basolatéral de chaque Transwell test pour un tube séparé propre à l&#39;analyse. Retirer le test Transwells utilisée pour examiner la diffusion passive de fluorescéine de sodium de la plaque et le jeter. Retour à la plaque Transwells restantes à l&#39;incubateur. </li><li> Placer 100 pl de chaque solution étalon en triple dans un plat à 96 puits à fond plat. </li><li> Préparer trois dilutions de chaque échantillon basolatérale (1:2, 1:20 et 1:50) dans un tampon non fluorescent, et ajouter 100 ul de chaque échantillon non dilué et de chaque dilution, en double exemplaire, dans un plat à 96 puits- plaque de fond. </li><li> Absorbance de l&#39;échantillon de mesure sur un lecteur de plaque ELISA à 486 nm ou 490 nm. </li><li> Déterminer la concentration de fluorescéine de sodium dans le compartiment basolatéral en comparant l&#39;absorbance des échantillons à l&#39;encontre des valeurs d&#39;absorbance pour la fluorescéine sodique ercourbe Andard. </li></ol></li></ol> 4. Infectant Polarized Calu-3 LCC avec le virus respiratoire Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile, à un niveau de biosécurité appropriées pour le virus utilisé. <ol><li> Diluer virus dans le sérum sans MEM afin que inoculum désiré serait dans 100 pi. </li><li> Laver les cellules dans le sérum sans MEM. Aspirer moyenne de tous les puits, enlever le milieu apical puis le milieu basolatéral. Avec une pipette capillaire relié à un piège à vide avec un léger vide, ou à une norme de pipette de 1 ml, moyenne aspiration de puits sans cellules A1 et D1, puis ensemencé à partir de puits, d&#39;une part l&#39;élimination du milieu apical de tous les puits, puis l&#39;élimination du milieu basolatéral de tous les puits. Ne pas toucher les membranes d&#39;insertion tout en aspirant à moyen terme. <ol><li> Ajouter 100 ul de sérum EMEM au compartiment apical de la cellule sans puits A1 et D1, puis à til ensemencée puits, de la direction moyenne dans le compartiment apical avec le côté de l&#39;insert pour guider la pointe de la pipette. Ne pas ajouter de support directement sur les cellules, et ne pas toucher la membrane d&#39;insertion. </li><li> Ajouter 600 ul de sérum EMEM aux compartiments basolatéral. Ajouter à chaque milieu Transwell en inclinant la pipette contre la paroi du compartiment à libération lente et le milieu dans le puits. </li><li> Aspirer un milieu sans sérum à partir de puits. </li></ol></li><li> A partir de puits non infectées ou infectées maquette, ajouter dilutions de virus appropriées pour le compartiment apical de Transwells. Pour les puits non infectés, ajouter 100 ul de sérum sans MEM dans le compartiment apical de Transwells appropriées, par pseudo-infectées puits, ajouter 100 ul de virus sans préparation dilué dans du sérum sans MEM dans le compartiment apical de Transwells appropriées, et pour infection par le virus, diluer le virus dans le sérum sans MEM et ajouter 100 ul dans les compartiments apical de Transwells appropriées. </li><li>Ajouter 600 ul de sérum EMEM à tous les compartiments basolatéral. </li><li> Incuber à 37 ° C et 7% de CO 2 pendant 2 heures. </li><li> Aspirer moyen de puits, d&#39;abord à partir de puits non infectés et infectés par simulation, puis à partir de puits infectés. Retirer surnageants apicaux d&#39;abord, puis les surnageants basolatéral. </li><li> Remplacer moyenne avec 200 pl de milieu EMEM-10% dans les compartiments apical et 600 ul de milieu EMEM-10% dans les compartiments basolatéral. </li></ol>

<ol><li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+airway+epithelial+cells+%28calu-3%29%3A+a+model+of+human+respiratory+function%2C+structure%2C+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+research+and+practice%22%5BJournal%5D)">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li>
<li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li>
<li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li>
<li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li>
<li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li>
<li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+%28PADDOCC%29+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutics+and+biopharmaceutics+%3A+official+journal+of+Arbeitsgemeinschaft+fur+Pharmazeutische+Verfahrenstechnik+e%22%5BJournal%5D)">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li>
<li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+research%3A+PTR%22%5BJournal%5D)">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li>
<li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li>
<li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li>
<li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li>
<li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+nutritional+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li>
<li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+%28SARS%29+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li>
<li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729(2010).</li>
<li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947(2012).</li>
<li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological+methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li>
<li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized%2C+specific+to+ciliated+cells%2C+and+without+obvious+cytopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li>
<li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li>
<li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro+%3A+an+international+journal+published+in+association+with+BIBRA%22%5BJournal%5D)">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li>
<li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Lors de l&#39;établissement Calu-3 dans des inserts Transwell LCC, les cellules ne peuvent pas du tout polariser, ou peuvent ne pas être totalement polariser, telle que définie par un TEER ≥ 1000 Ω x cm 2 et ≤ 1% de sodium de fluorescéine colorant équilibrage entre les compartiments basolatéral et apical. En outre, les cellules Calu-3 dans LCC peut polariser entièrement, mais TEER peuvent être incompatibles entre les mesures. Bien que les fluctuations dans les mesures de TEER de cellules Calu-3 LCC sont normales au jour le jour, une fois complètement polarisées, balançoires dramatiques dans TEER sont pas attendus avant la culture diminue naturellement avec l&#39;âge, ce qui peut être aussi peu que 5 semaines ou aussi longtemps que 12 semaines après le semis. La capacité des cellules Calu-3 LCC à polariser dépend en partie de la façon dont les cellules sont maintenues et repiqués avant de l&#39;utiliser dans le système Transwell. Les cellules qui se sont développées au-delà de 90% de confluence en monocouche pendant le repiquage, qui ont été repiquées plus de 10 fois en stock congelé, ou qui n&#39;ont pas êtrefr fourni avec un milieu frais sur une base régulière sont moins susceptibles de polariser entièrement, et toute polarisation est susceptible de diminuer rapidement. Manque incomplète ou totale de la polarisation peut également être attribuée à la variation dans le matériau et la taille des pores de Transwells utilisés pour Calu-3 LCC, et beaucoup à beaucoup de variation dans Transwells de composition similaire et la taille des pores peut également affecter la polarisation. Tailles de pores plus grands peuvent permettre Calu-3 à grandir à travers la membrane Transwell dans le compartiment basolatéral, ce qui empêche la culture de polarisation. Une absence de polarisation peut également être due à la croissance bactérienne, indiqué par un milieu de culture nébuleuse, ce qui conduit à la dégradation ultérieure des jonctions serrées entre les cellules Calu-3. Mesures de TEER variables de Calu-3 LCC peuvent être causées par des perturbations mécaniques des monocouches de cellules Calu-3 LCC, les inserts ou les plaques elles-mêmes. Changements de milieu et des mesures de TEER devraient être exécutées sans pointes de pipettes ou électroconduit de toucher les cellules. Lors de l&#39;exécution de ces opérations, des précautions doivent être prises pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans les compartiments apical et basolatéral, qui vont perturber la capacité du voltohmmeter pour détecter la résistance. La capacité de la voltohmmeter pour détecter la résistance dans une culture qui est en réalité polarisée peut également limitée par l&#39;accumulation de protéines sur les fils d&#39;électrodes. Cette accumulation peut être enlevé avec ponçage léger, ou peut être corrigé par le remplacement de l&#39;électrode. Une fois Calu-3 LCC complètement polariser et la TEER n&#39;augmente plus, Calu-3 LCC sont prêts à être utilisés comme un modèle in vitro pour caractériser les réponses d&#39;accueil de cellules épithéliales pulmonaires aux infections respiratoires. Ce système permet une meilleure caractérisation des réponses directionnelles à des agents pathogènes par rapport à une monocouche de culture des lignées de cellules pulmonaires traditionnellement utilisées pour étudier les pathogènes respiratoires, comme l&#39;A549 et cellules HEp-2, avec les avantages supplémentaires de Calu-3 bei LCCng plus rapide à développer, plus facile à obtenir, et moins cher à produire que l&#39;enseignement primaire, polarisé, NHBE différenciée. Semblable à NHBE, polarisée Calu-3 montrent la formation des jonctions serrées, et de produire des mucines. Cependant, contrairement à NHBE, polarisés Calu-3 cellules ne se différencient pas en couches de cellules basales et les cellules épithéliales ciliées, et quelques polarisés Calu-3 cellules se développent cils projections semblables 19. Ainsi, bien utile pour examiner les réponses des cellules polarisées épithéliales des voies aériennes respiratoires à l&#39;insulte, polarisée Calu-3 LCC ne sont pas un modèle idéal pour étudier le développement des voies aériennes ou de rénovation en réponse à une agression respiratoires ou des blessures. La production de mucus par les cellules en culture in vitro peut avoir un impact infectivité cellulaire, ainsi que la libération de virus infectieux et la propagation du virus dans un modèle polarisé, et une comparaison directe de la production de mucus entre polarisée Calu-3 LCC et polarisée, NHBE différencié n&#39;a pas été signalée . A549 et cellules HEp-2 d&#39;unesont plus faciles à la culture de cellules Calu-3, mais, contrairement à Calu-3 LCC, ils ne forment pas cultures polarisées lorsqu&#39;elles sont cultivées sur des inserts Transwell, et sont des modèles idéaux donc pas d&#39;examiner in vitro les réponses des cellules épithéliales polarisées à l&#39;infection par le virus respiratoire .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIFS </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de trypsine - EDTA à 0,02% </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle milieu essentiel minimum (MEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Chaleur inactiver, 56 ° C, 30 min </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Conserver à 4 ° C dans l&#39;obscurité </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> FBS EMEM-10% (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Supplément EMEM avec la chaleur de FBS inactivé à 10% de sérum stérile filtre </td></tr><tr><td> EMEM-20% de FBS + suppléments (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> Supplément EMEM à des concentrations finales: inactivé par la chaleur FBS, 20%; 1X acides aminés; 2 mM de L-glutamine; HEPES 10 mM, stérile filtre </td></tr><tr><td> Plaques à 24 puits Transwell </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 taille des pores um, polyester </td></tr><tr><td> Bleu trypan </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Préparez-vous à 70% en utilisant stérile dH 2 O </td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Non fluorescent tampon </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM de KCl; 2,53 mM de CaCl 2 x H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM de KH 2 PO 4; 25 mM NaHCO 3 dans de l&#39;eau stérile; stérile-filtre </td></tr><tr><td> Fluorescéine de sodium </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml dans des conditions stériles non fluorescent tampon; stérile filtre, protéger de la lumière, conserver à 4 ° C à 6 mois </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 électrode </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lecteur de plaque ELISA </td><td></td><td></td><td> Capable de mesurer A 486 ou A 490 </td></tr></tbody></table>

l&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de airway humaines épithéliales polarisées cellules calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; in vitro</em

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Les surfaces apicales et basolatérale des cellules épithéliales des voies aériennes démontrer réponses directionnelles à l&#39;exposition pathogène in vivo. Ainsi, idéal dans des modèles in vitro pour examiner les réponses cellulaires à des agents pathogènes respiratoires polarisent, formant des surfaces apical et basolatéral. Un tel modèle se différencie normales cellules épithéliales bronchiques humaines (NHBE). Cependant, ce système nécessite des échantillons de tissus pulmonaires, l&#39;expertise isoler et cultiver des cellules épithéliales du tissu, et le temps pour générer une culture de l&#39;interface air-liquide. Calu-3 cellules, dérivées d&#39;un adénocarcinome bronchique humain, sont un modèle alternatif pour l&#39;examen de la réponse des cellules des voies respiratoires proximales épithéliales respiratoires insulte 1, composés pharmacologiques 2-6, et 7-9 bactérienne et des agents pathogènes viraux, y compris les virus de la grippe, rhinovirus et le syndrome respiratoire aigu sévère - le coronavirus associé au 10-14. Récemment, we démontré que Calu-3 cellules sont sensibles au virus respiratoire syncytial (VRS) d&#39;une manière compatible avec NHBE 15,16. Ici, nous détaillons la mise en place d&#39;un polarisée, liquide recouvert de culture (LCC) des cellules Calu-3, en se concentrant sur les détails techniques de culture et de la culture de cellules Calu-3, le maintien des cellules qui ont été cultivées dans LCC, et nous présentons le procédé pour effectuer infection par le virus respiratoire polarisés cellules Calu-3. Pour obtenir systématiquement polarisée Calu-3 LCC, les cellules Calu-3 doit être soigneusement repiquées avant la culture dans les inserts Transwell. Calu-3 cultures monocouches devrait rester inférieur à 90% de confluence, doivent être repiquées moins de 10 fois en stock congelé, et doit être régulièrement alimenté par du milieu frais. Une fois cultivées dans Transwells, Calu-3 LCC doivent être manipulés avec soin. Irréguliers changements de supports et de la perturbation mécanique ou physique des couches de cellules ou de plaques de polarisation pour avoir un impact négatifplusieurs heures ou jours. Polarisation est contrôlée par l&#39;évaluation de trans-épithéliale résistance électrique (TEER) et est contrôlée par l&#39;évaluation de l&#39;équilibrage passif de la fluorescéine de sodium entre les compartiments basolatéral et apical 17,18. Une fois les plateaux TEER égale ou supérieure à 1000 Ω x cm 2, Calu-3 LCC sont prêts à utiliser pour examiner les réponses cellulaires à des agents pathogènes respiratoires.

Lorsqu&#39;il est cultivé comme liquide recouvertes de cultures (CLC) dans les systèmes de culture Transwell, comme illustré à la figure 1, les cellules Calu-3, polarisent développement distincts surfaces apical et basolatéral. Suivant la méthode décrite ici, la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) de Calu-3 LCC atteint un plateau ou supérieure à 1000 Ω × cm 2 dans les 3 semaines après le semis, dont un exemple est illustré à la figure 2. Les jonctions serrées formées entre cellules polarisées empêcher l&#39;équilibrage passif de petites molécules entre les compartiments apical et basolatéral. Ainsi, un test de la fluorescéine de sodium modifié l&#39;équilibre est utilisée pour confirmer la polarisation de Calu-3 LCC 15.17.18. Que la TEER de monocouches de cellules Calu-3 augmente dans LCC, la quantité de fluorescéine qui s&#39;équilibre passivement dans le compartiment basolatéral diminue. Une fois la TEER est 1.000 Ω x cm 2, la quantité de fluorescéine qui s&#39;équilibre endans le compartiment basolatéral est ≤ 1%, comme le montre la figure 3, par conséquent, Calu-3 LCC sont considérés comme complètement polarisée lorsque la TEER est ≥ 1000 Ω x cm 2. La mesure de TEER pic de Calu-3 LCC peut varier d&#39;une expérience à l&#39;. Cependant, une fois les valeurs TEER plateau pour une expérience donnée, un complètement polarisée, non infecté Calu-3 LCC peut être stable pendant 5 à 12 semaines après l&#39;ensemencement. Absence de développement d&#39;une résistance dans Transwell-culture Calu-3 peut être causée par plusieurs facteurs tels que décrits dans le tableau 1. Lorsque le TEER de Calu-3 plateaux LCC ou au-dessus de 1000 × Ω cm 2, le modèle est prêt à être utilisé pour examiner réponses des voies aériennes de cellules épithéliales respiratoires à des agents pathogènes, notamment les virus respiratoire syncytial (VRS). L&#39;exposition à des résultats RSV dans une baisse plus rapide de la culture de l&#39;intégrité polarisée par rapport à une maquette de l&#39;infection des cellules (figure 4). Figure 1. Les cellules section représentation des Transwell-cultures de cellules. Sont cultivées sur la surface apicale de la membrane d&#39;insertion. <img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Figure 2. Développement des réseaux trans-épithélial résistance électrique (TEER) et la polarisation des cellules Calu-3 après le semis dans des inserts Transwell. A chaque point dans le temps, TEER est présentée comme médiane cm x 2 Ω ± SEM de 32 puits indépendants issus d&#39;une expérience représentative. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Figure 3. Passif equilibre<html> bration de la fluorescéine de sodium dans le compartiment basolatéral des monocouches de cellules Calu-3 est inhibée que les cellules se polariser. données cumulées de quatre expériences indépendantes sont présentés. Chaque point représente une mesure individuelle. <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Figure 4. Infection par le VRS de polarisation Calu-3 LCC accélère une baisse intégrité de la monocouche. Polarized Calu-3 cellules ont été infectées avec RSV-A2 à une MOI = 1 au jour 0 et la polarité a été suivie pendant 8 semaines après l&#39;infection. Une expérience représentative est présentée. Les données sont présentées comme la résistance médiane de 8 puits indépendants par l&#39;infection ± SEM par point de temps. * P &lt;0,05 entre les cultures maquette et RSV-A2-infectés, tels que déterminés par t de Student-test. moyens &quot;&gt; <tbody><tr><td> Question </td><td> Résolution (s) </td></tr><tr><td> La résistance n&#39;est pas mesurable </td><td><ul><li> Retirer les bulles d&#39;air dans les puits </li><li> Utilisez Calu-3 cellules qui ont été repiquées en stock congelé moins de 10 fois </li><li> Ne laissez pas les cellules Calu-3 pour atteindre 100% de confluence dans la sous-culture monocouche </li><li> Vérifier que les cellules ne poussent pas sur le plastique bien en dessous de la garniture (ce qui indique que les cellules peuvent avoir poussé à travers les pores de l&#39;insert) </li><li> Permettez 2-3 semaines après l&#39;ensemencement pour le développement résistance complète </li><li> Vérifiez la composition et la taille des pores d&#39;inserts utilisés, changer si nécessaire (insert polyester recommandé, 0,3 um taille des pores, pas de revêtements, matériaux pour voir les détails) </li><li> Vérifier la qualité de l&#39;électrode, le ponçage doucement pour éliminer les protéines accumulées à partir de la pointe, et le remplacement, si nécessaire </li><li> Vérifiez milieu pour la croissance bactérienne </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> La résistance se développe, mais la polarisation complète (≥ 1000 Ω x cm 2) n&#39;est pas atteint </td><td><ul><li> Prévoyez un délai supplémentaire pour la polarisation de se développer (peut parfois prendre jusqu&#39;à 4 semaines) </li><li> Utilisez Calu-3 cellules qui ont été repiquées en stock congelé moins de 10 fois </li><li> Ne laissez pas les cellules Calu-3 pour atteindre 100% de confluence dans la sous-culture monocouche </li><li> Constamment remplacer les moyennes dans les cultures Transwell, alternant entre le troisième jour, puis la quatrième place après l&#39;alimentation précédente </li><li> Seules des cellules en culture sur des inserts qui sont placés dans les rangées extérieures des plaques </li><li> Utilisez un lot différent d&#39;inserts Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> Polariser les cellules complètement, mais la résistance n&#39;est pas uniforme d&#39;une lecture à l&#39;autre </td><td><ul><li> Ne pas perturber ou empiler des plaques dans l&#39;incubateur </li><li> Ne pas provoquer des vibrations dans l&#39;armoire de biosécurité en Transwell platees sont traitées </li><li> Retirer les bulles d&#39;air dans les puits </li><li> Ne pas déranger la couche de cellules avec des pointes de pipette lors du changement de média ou d&#39;effectuer des lectures TEER </li><li> Utiliser 200 pl de milieu dans le compartiment apical; baisse du volume peut entraîner des lectures instables TEER </li><li> Vérifiez la qualité de l&#39;électrode, le ponçage en douceur pour éliminer les protéines accumulées à partir de la pointe, et remplacer si nécessaire </li></ul></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Identifier des problèmes qui peuvent survenir lorsque la culture de cellules Calu-3 dans Transwells. De multiples facteurs contribuent à la polarisation complète de cellules Calu-3 dans le liquide recouvertes de cultures, les plus susceptibles de laquelle sont mis en évidence dans ce tableau.

Les constatations et conclusions présentées dans ce rapport sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

L’objectif global de cette procédure est d’établir une culture liquide polarisée recouverte de trois cellules Calu à l’aide d’un système de culture Transwell pour mettre en place le système de culture Transwell. Tout d’abord, préparez une plaque de transpuits en déplaçant les inserts dans les rangées extérieures de la plaque et en ajoutant du milieu dans les chambres basolatérales de chaque puits. La deuxième étape consiste à préparer des cellules de culture monocouches en suspensions unicellulaires.Ensuite, les cellules suspendues sont placées dans les compartiments apicaux des inserts transwells. La dernière étape consiste à remplacer complètement les milieux latéraux apicaux et basaux. En culture, insère sur un cycle de trois puis quatre jours pendant deux à trois semaines jusqu’à ce que les cellules soient complètement polarisées.En fin de compte, la résistance électrique trans-épithéliale et un test d’équilibrage passif de la fluorescéine sodique sont utilisés pour démontrer la polarisation de cultures de calu trois recouvertes de liquide. Le principal avantage de l’utilisation de cette technique par rapport à l’utilisation de cellules épithéliales bronchiques humaines normales est que les cellules Calor trois sont plus accessibles et se transforment plus rapidement en cultures polarisées. Trois cultures couvertes de liquide ou LCC sont réalisées dans une enceinte de biosécurité à l’aide de techniques de culture stériles.Commencez par préparer une plaque de 24 puits trans. Pour l’ensemencement à l’aide d’une pince stérile, déplacer les inserts transwell de l’intérieur vers les rangées extérieures de la plaque sans toucher l’insert. Les cellules membranaires ne doivent être cultivées que dans des puits situés sur les rangées extérieures de la plaque.À partir de 600 microlitres d’EMEM contenant 10 % de FBS, ci-après dénommé EMEM 10 % à chaque compartiment basolatéral. Pour éviter l’introduction de bulles d’air, inclinez la pipette contre la paroi de chaque compartiment et relâchez lentement le milieu dans le puits. Ensuite, détachez Colu trois cellules des flacons de culture tissulaire et des cellules de sous-culture comme décrit dans le texte du protocole, remettez complètement en suspension les cellules lavées dans cinq millilitres d’EMEM 10 % en pipetant doucement de haut en bas, déterminez le nombre de cellules viables et totales par la méthode d’exclusion du bleu trian et ne procédez que si 80 % à 90 % sont viables.Ensuite, dans un tube conique stérile de 50 millilitres, diluez les cellules à une concentration de deux fois 10 pour six cellules viables par millilitre. Avec EMEM 10 %, ajoutez 100 microlitres de cellules de calu en suspension trois cellules dans le compartiment apical de chaque puits à l’exception des puits A un et D un. Inclinez doucement la pipette contre le canal de guidage intérieur de la paroi de l’insert et libérez lentement les cellules.Ne touchez pas la pipette à la membrane d’insertion. Agitez doucement la suspension à trois cellules CALU pendant cette étape de mise en place pour maintenir une suspension homogène des cellules aux puits A un et D un, qui seront des puits de contrôle acellulaires ou des flans à 100 microlitres d’EMEM 10 % sans cellules. Incuber la plaque trans puits à 37 degrés Celsius et 7 % de dioxyde de carbone dans l’atmosphère de l’air dans un incubateur où les perturbations physiques seront minimes afin d’améliorer l’efficacité de la polarisation.N’empilez pas les plaques les unes sur les autres trois jours après la sous-culture et calibrez trois cellules dans les transwells, remplacez complètement le milieu en aspirant doucement les inserts de transpuits à l’aide d’une pipette capillaire fixée à un piège à vide avec un vide doux. Retirez d’abord le milieu apical de tous les puits, puis retirez le milieu basolatéral de tous les puits. Ne touchez pas les membranes d’insertion lors de l’aspiration du fluide.Ajouter 200 microlitres d’EMEM 10 % dans le compartiment apical des puits acellulaires A un et D un. Puis vers les puits en place, en dirigeant le milieu dans le compartiment apical à l’aide du côté de l’insert pour guider la pointe de la pipette. N’ajoutez pas de milieu directement sur les cellules et ne touchez pas la membrane d’insertion.Ensuite, ajoutez 600 microlitres d’EMEM 10 % dans les compartiments latéraux basaux pour éviter l’introduction de bulles d’air dans les compartiments latéraux basaux. Ajoutez du milieu à chacun en orientant la pipette contre la paroi de chaque compartiment et en relâchant lentement le milieu dans le puits. Remettez la plaque transwell dans l’incubateur après ce premier milieu. Remplacement.Le milieu doit être remplacé selon un cycle alternant entre le quatrième et le troisième jour après l’alimentation précédente jusqu’à ce que les cellules soient complètement polarisées. La polarisation est surveillée en évaluant la résistance électrique transépithéliale ou la déchirure du CALU trois LCC à l’aide d’un volter qui a été calibré et testé. Pour commencer cette procédure, retirez l’électrode de l’air à l’éthanol pendant cinq à 10 secondes et rincez l’électrode avec de l’EMEM stérile à 10 %Réglez le commutateur de mode du volter sur le réglage de résistance et mettez l’appareil sous tension.Commencez les mesures avec les puits de contrôle acellulaires pour obtenir des mesures de base, puis poursuivez avec les mesures pour chacun. Eh bien, placez doucement l’électrode dans l’un des trois ports qui permettent d’accéder au compartiment basolatéral de la culture transwell. Placez l’électrode de manière à ce que le fil le plus long touche légèrement le fond du puits extérieur et reste vertical.Et la sonde la plus courte se trouve dans le milieu de culture tissulaire du compartiment apical sans toucher la membrane d’insertion, appuyez sur le bouton R de mesure et attendez que la lecture se stabilise. Répétez l’opération pour les deux autres ports de chaque puits et enregistrez les mesures des trois ports pour un total de trois mesures par puits afin de vérifier que la polarisation est complète. Un test secondaire mesurant la diffusion passive de fluorescéine de sodium entre les compartiments apical et basolatéral est effectué sur une à trois cultures transwell.Retirer soigneusement le milieu des compartiments basal, latéral et apical des cultures transwell qui seront testées. Rincez les cultures transwell en ajoutant doucement 600 microlitres de DPBS stérile à température ambiante dans les compartiments basolatéraux et 100 microlitres de DPBS stérile à température ambiante dans les compartiments apicals. Retirez délicatement le DPBS des puits.Ajoutez 600 microlitres de tampon stérile non fluorescent dans les compartiments basolatéraux, suivis de 100 microlitres de fluorescéine sodique stérile dans les compartiments apicals. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure. Au bout d’une heure.Transférez l’échantillon tampon non fluorescent du compartiment basolatéral de chaque puits d’essai dans un tube propre séparé. Pour l’analyse, retirer de la plaque les puits d’essai utilisés pour examiner la diffusion passive de la fluorescéine de sodium et les jeter. Remettez la plaque avec les transwells restants dans l’incubateur.Placez 100 microlitres de chaque solution étalon de fluorescéine de sodium préalablement préparée en trois exemplaires dans une plaque à fond plat de 96 puits. Préparez trois dilutions de chaque échantillon latéral basal dans un tampon non fluorescent. Pour chaque échantillon, ajoutez 100 microlitres d’un échantillon non dilué et 100 microlitres de chaque dilution en double dans une plaque à fond plat de 96 puits.Mesure de l’absorbance de l’échantillon sur un lecteur de plaques EISA à 486 nanomètres ou 490 nanomètres. Pour commencer cette procédure, lavez d’abord les cellules et l’EMEM libre de sérum à l’aide d’une pipette capillaire fixée à un piège à vide avec un vide doux, aspirez doucement le milieu de tous les puits, en retirant le milieu apical suivi du milieu basolatéral, aspirez le milieu des puits libres A un et D un, puis des puits ensemencés. Ne touchez pas les membranes d’insertion lors de l’aspiration du fluide.Ajoutez 100 microlitres d’EMEM libre de sérum dans le compartiment apical des puits libres de cellules A un et D un, puis dans les puits placés en dirigeant le milieu dans le compartiment apical. Utilisation du côté de l’insert pour guider la pointe de la pipette. N’ajoutez pas de milieu directement sur les cellules et ne touchez pas la membrane d’insertion.Ensuite, à 600 microlitres d’EMEM sans sérum vers les compartiments basolatéraux. Ajoutez du milieu à chaque puits trans en inclinant la pipette contre la paroi du compartiment et en relâchant lentement le milieu dans le puits. Aspirez doucement le milieu sans sérum des puits. En commençant par des puits non infectés ou des puits faussement infectés, ajoutez les dilutions virales suivantes dans le compartiment apical des puits trans appropriés.100 microlitres d’EMEM sans sérum pour les puits non infectés. 100 microlitres de préparation sans virus dilués dans de l’EMEM sans sérum pour les puits infectés fictifs et 100 microlitres de virus dilués dans de l’EMEM sans sérum pour les virus. Après cela, à 600 microlitres d’EMEM sans sérum dans tous les compartiments basolatéraux, incuber à 37 degrés Celsius et 7 % de dioxyde de carbone pendant deux heures.Après deux heures, aspirez le milieu des puits d’abord des puits non infectés et des puits infectés fictifs, puis des puits infectés. Retirez d’abord les surnageants apicals, puis les surnageants latéraux basaux. Enfin, remplacez le milieu par 200 microlitres d’EMEM, 10 % dans les compartiments apicaux et 600 microlitres d’EMEM 10 % dans les compartiments basolatéraux en suivant la méthode démontrée dans cette vidéo.La résistance électrique trans épithéliale ou déchirure des cultures recouvertes de liquide atteint un plateau à 1000 M ou plus par centimètre carré dans les trois semaines suivant l’ensemencement. Cette figure en montre un exemple : les jonctions serrées formées entre les cellules polarisées empêchent l’équilibre passif des petites molécules entre les compartiments apical et basolatéral. Un test d’équilibrage de fluorescence de sodium modifié est utilisé pour confirmer la polarisation des cultures recouvertes de calu trois liquides.À mesure que le niveau des monocouches à trois cellules calu et des cultures liquides augmente, la quantité de fluorescéine qui s’équilibre passivement dans le compartiment basolatéral diminue, les données cumulatives de quatre expériences indépendantes sont présentées ici, et chaque point de données représente une mesure individuelle. Une fois que la déchirure est de 1000 possédée par centimètre carré, la quantité de fluorescéine qui s’équilibre dans le compartiment basolatéral BA est inférieure ou égale à 1 %Par conséquent, les cultures recouvertes de calu trois liquides sont considérées comme entièrement polarisées lorsque le niveau est supérieur ou égal à 1000 possédé par centimètre carré. Une fois que le niveau de cultures couvertes de liquide calu trois plafonne à 1000 ou plus par centimètre carré, le modèle est prêt à être utilisé pour examiner les réponses des cellules épithéliales des voies respiratoires aux agents pathogènes respiratoires, y compris le virus respiratoire syncytial ou VRS, comme indiqué.Dans cet exemple, l’exposition au VRS représentée en rouge entraîne un déclin plus rapide de la culture polarisée. L’intégrité par rapport à une infection simulée des cellules représentées dans les données bleues est présentée comme la résistance médiane de huit puits indépendants par infection, plus ou moins SEM par point temporel. L’astérisque indique un P inférieur à 0,05 entre les cultures infectées par le test T de l’élève.N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec des agents infectieux, cela peut être dangereux et que vous devez porter un EPI approprié et utiliser les bonnes pratiques de laboratoire lors de l’exécution de ces procédures.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Cellules épithéliales nasales, obtenues par grattage superficiel de la biopsie des volontaires humains, sont expansées et transférées sur des inserts de culture tissulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont cultivées à l'interface air-liquide, ce qui donne des cultures de cellules ciliées et non ciliées. Cultures de cellules épithéliales nasales différenciées fournissent des modèles expérimentaux viables pour l'étude de la muqueuse respiratoire.

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

Nous décrivons un protocole pour un modèle tridimensionnel de co-culture des voies respiratoires infectées, utilisant CFBE41o- cellules, macrophages THP-1, et Pseudomonas aeruginosa, établi à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une nouvelle plate-forme pour tester simultanément l’efficacité antibiotique, la fonction de barrière épithéliale, et les marqueurs inflammatoires.

P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

Décrit est la culture cellulaire et la méthode d’exposition d’un modèle bronchique in vitro pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules pour l’essai de toxicité.

Un modèle épithélial bronchique d’interface air-liquide pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules aéroportées pour l’essai de toxicité

Ce protocole détaille une étude des interactions précoces entre les cellules épithéliales nasales infectées par le virus et l’activation des cellules innées. Des sous-ensembles individuels de cellules immunitaires peuvent être distingués en fonction de leur activation en réponse à des infections virales. Ils peuvent ensuite être étudiés plus avant pour déterminer leurs effets sur les réponses antivirales précoces.

Modèle de co-culture sans contact pour l’étude de l’activation des cellules immunitaires innées au cours d’une infection virale respiratoire

Le présent protocole décrit les cellules alvéolaires de type 2 dérivées de cellules souches pluripotentes de type 2 induites par l’homme (iAT2s). Ces cellules peuvent être cultivées en tant que sphères auto-renouvelées en culture 3D ou adaptées à la culture d’interface air-liquide (ALI).

Génération de sphères 3D et de cultures d’interface air-liquide 2D de cellules épithéliales pluripotentes de type 2 dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Les progrès récents dans les protocoles de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme permettent la dérivation par étapes de types de cellules spécifiques à un organe. Ici, nous fournissons des étapes détaillées pour la maintenance et l’expansion des cellules basales des voies respiratoires dérivées de l’iPSC et leur différenciation en épithélium mucociliaire dans des cultures d’interface air-liquide.

Génération de cultures d’interface air-liquide de cellules épithéliales des voies respiratoires à partir de cellules souches pluripotentes humaines

L’épithélium nasal est le principal site barrière rencontré par tous les agents pathogènes respiratoires. Ici, nous décrivons des méthodes pour utiliser des cellules épithéliales nasales primaires cultivées sous forme de cultures d’interface air-liquide (ALI) pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte dans un système physiologiquement pertinent.

Infection de cellules épithéliales nasales primaires cultivées à l’interface air-liquide pour caractériser les interactions entre le coronavirus humain et l’hôte

Présenté ici est une méthode reproductible, abordable et robuste pour l’isolement et l’expansion des cellules épithéliales bronchiques primaires pour la biobanque à long terme et la génération de cellules épithéliales différenciées par culture à l’interface air-liquide.

Isoler les cellules épithéliales bronchiques du tissu pulmonaire réséqué pour les biobanques et établir des cultures d’interface air-liquide bien différenciées

La culture d’interface air-liquide est couramment utilisée pour développer un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié en différenciant les cellules épithéliales bronchiques humaines normales primaires qui imitent la face apicale des voies respiratoires pulmonaires. Nous décrivons ici un protocole simple pour déterminer sa qualité en surveillant ses propriétés biophysiques, telles que la fonction ciliaire et l’intégrité de la membrane.

Détermination de la fonction ciliaire et de l’imperméabilité membranaire de l’épithélium des voies respiratoires pulmonaires pseudostratifié

Cet article décrit la génération d’un modèle complexe de barrière respiratoire multicellulaire composé d’épithélium pulmonaire, de mésenchyme, de cellules endothéliales et de macrophages dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une culture d’interface air-liquide.

Co-culture de cellules épithéliales, mésenchymateuses, endothéliales et immunitaires dérivées d’iPSC pour modéliser l’intégrité de la barrière des voies respiratoires dans la santé et les maladies pulmonaires

Découvrez comment établir des cultures polarisées de cellules Calu-3 recouvertes de liquide en utilisant un système de culture Transwell. Cette méthode permet d'étudier la fonction épithéliale des voies respiratoires.

Létablissement dune culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte In vitro (Vidéo) | JoVE Journal

L'établissement d'une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte

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