La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l'EMBL

L’objectif global de cette procédure est de produire des complexes protéiques en utilisant le système cellulaire d’insecte à virus baula à dos multiple. Ceci est accompli en générant d’abord la construction multigénique, codant pour le complexe protéique de choix. La deuxième étape consiste à fabriquer un virus baula composite qui contient la construction multigénique en transformant les cellules bactériennes et en dépistant les bons milieux arrières.

Ensuite, isolez le génome viral baula et utilisez-le pour infecter des cellules d’insectes à petite échelle dans une plaque à six puits après avoir testé la production de protéines. Le complexe protéique choisi est exprimé à plus grande échelle et purifié. En fin de compte, le complexe protéique purifié est utilisé pour découvrir sa structure et sa fonction et potentiellement pour la découverte de médicaments.

Les principaux avantages de cette technique par rapport aux systèmes d’échovirus existants sont doubles. Les complexes MultiPro peuvent être produits avec des résultats sans précédent. De plus, le matériel produit est de bien meilleure qualité car nous concevons l’échovirus pour une production optimale de protéines.

Les implications de cette technique vont bien au-delà des questions biologiques fondamentales. Notre plateforme multi-sacs a été utilisée avec succès pour produire des protéines qui sont de nouveaux candidats vaccins prometteurs pour diverses maladies et catalysent la recherche sur le cancer en produisant des assemblages de protéines clés qui provoquent la croissance tumorale. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront un peu de mal avec les processus et le besoin de stérilité.

Nous avons donc travaillé très dur pour établir des procédures opérationnelles standard afin de rendre l’application de multi-banques aussi facile que possible pour les utilisateurs non spécialistes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes robotiques sont beaucoup plus faciles à comprendre lorsque le processus est montré en mouvement. Vous ne pouvez pas l’extraire simplement en regardant des protocoles qui sont écrits, aussi détaillés soient-ils.

Avant de commencer cette procédure, il est important de planifier soigneusement la stratégie de co-expression. Il est recommandé de simuler d’abord l’expérience. In silico.

Les gènes doivent être distribués sur les plasmides accepteurs et donneurs. Ce qui fonctionne le mieux, c’est de regrouper des sous-unités qui peuvent former des sous-modules physiologiques. Étant donné que les grands complexes ont de nombreuses sous-unités protéiques, de nombreux gènes doivent être exprimés simultanément.

Le système multi-dos simplifie considérablement le clonage des gènes en utilisant des routines automatisées pour placer les gènes dans de petites molécules progénitrices d’ADN qui contiennent une courte séquence d’ADN appelée serrure P qui est reconnue par l’enzyme recombinase Cree. Ces progéniteurs sont ensuite combinés dans une réaction en une seule étape en ajoutant une pré recombinase, qui concatène tout ce qui a un site P lox en un grand plasmide d’ADN. Cette construction multigénique est ensuite insérée dans le génome du virus multi-rétro-bulla.

Si un grand nombre de constructions doivent être générées, il est recommandé d’utiliser des scripts robotiques et un poste de travail de manipulation de liquides. Le poste de travail est équipé d’un aspirateur pour les mini-préparations et le nettoyage PCR, d’un EEL pour le chargement automatique des échantillons PCR. Un thermocycleur pour les étapes de PCR et d’incubation, un agitateur pour les cellules en suspension et les blocs froids.

Pour les enzymes, les gènes d’intérêt sont insérés dans des donneurs et des accepteurs sélectionnés en utilisant des enzymes de restriction et la ligase ou, alternativement, en utilisant des méthodes indépendantes de la ligature, pour valider toutes les constructions du donneur et de l’accepteur, clonées par cartographie de restriction et séquençage. Procéder à des combinaisons diffuses d’accepteurs de donneurs par recombinaison CRE LAX P pour générer les constructions d’expression multigéniques de choix. Les constructions multigéniques assemblées sont validées par des réactions PCR analytiques avec des ensembles d’amorces spécialement conçus.

Des instantanés du processus TR assisté par robot sont présentés ici. Ils comprennent la préparation de réactions PCR dans des plaques multi-puits, la fourniture d’ADN matrice et d’amorces, l’amplification PCR d’ADN et la préparation de constructions multigéniques cultivées en culture bactérienne par lyse alcaline dans des plaques multi-puits. Pour commencer cette procédure, intégrez des vecteurs de transfert multigéniques dans le génome viral multi-bula en les transformant en cellules DH 10, hébergeant le génome viral et les fonctionnalités requises pour la transposition de TN sept.

Après la transposition de TN sept, les cellules avec le virus baula composite contenant les gènes d’intérêt sont sélectionnées par criblage bleu-blanc, la transposition réussie de TN sept entraîne une perte de complémentation alpha du bêta galacto. Par conséquent, les colonies avec une transposition correcte de TN sept restent blanches sur les APL sélectives contenant xal. Préparez des cultures bactériennes à partir des colonies blanches et isolez le dos par lyse alcaline et précipitation d’éthanol isopropanol.

Ensuite, transfectez des cellules d’insectes avec le génome viral bao purifié travaillant dans un capuchon stérile des aliquotes de graines de cellules d’insectes SF 21 en phase logarithmique dans une plaque de culture tissulaire à six puits. À chacun, ajoutez le génome viral bao purifié et un réactif de transfection mélangé dans un milieu de culture. Incuber les cellules transfectées à 27 degrés Celsius sans mouvement pendant 48 à 60 heures.

Après 48 à 60 heures, récoltez le virus initial ou V zéro en retirant le substrat, remplissez-le de milieu frais et remettez la plaque dans l’incubateur deux à trois jours plus tard, testez la production de protéines. Et si un marqueur YFP est présent, testez la fluorescence pour l’amplification du virus. Utilisez V zéro, le virus initial, pour infecter 25 à 50 millilitres de cellules en phase logarithmique dans de petits flacons agités sur une plate-forme orbitale.

Agitez : comptez les cellules et divisez-les toutes les 24 heures jusqu’à ce qu’elles cessent de doubler. Suivez un régime de faible multiplicité d’infection ou de MOI, les cellules doivent doubler au moins une fois, sinon répétez l’expérience avec un volume plus petit de V zéro ajouté. L’image de gauche montre des cellules d’insectes non infectées suite à une infection par le virus baula à dos multiple.

Les cellules d’insectes infectés ont cessé de proliférer et ont augmenté en taille, comme l’illustre l’image de droite. Après 48 à 60 heures, récoltez le virus V un en granulant les cellules. Retirez et stockez le support contenant le virus.

Resus suspend les cellules avec un milieu frais et les transfère dans l’erlenmeyer. Prélever une fois 10 à six cellules toutes les 12 ou 24 heures par granulation et tester la production de protéines et le signal de protéine marqueur si des volumes d’expression plus importants sont souhaités. Amplifiez davantage le virus en infectant jusqu’à 400 millilitres de cellules dans des flacons agitateurs de deux litres avec le virus V un.

Après le régime à faible MOI, nous recommandons fortement que le virus V one soit stocké en tant que virus de production en utilisant des cellules d’insectes infectées par le virus Ular ou des méthodes VIC pour prévenir les modifications du virus recombinant et pour préserver des niveaux d’expression élevés. 24 heures après l’arrêt de la prolifération est observé des cellules infectées par des pastilles. À ce stade, les cellules contiennent des particules virales complètes juste avant d’être libérées dans le milieu.

Retirez le support, remettez en suspension la pastille cellulaire dans une solution de congélation et effectuez la congélation de BIIC dans des tubes cryogéniques pour les cycles de production de protéines. Utilisez des aliquotes V un V deux ou des aliquotes BIC congelées pour infecter les cultures cellulaires plus grandes. Généralement, 400 millilitres dans des flacons de deux litres adhèrent au régime à faible MOI.

Ajuster le volume de virus utilisé pour l’infection de manière à ce que la culture infectée double au moins une fois. Si une protéine marqueur YFP est présente, prélever une fois 10 aux six cellules à des intervalles définis, soniser et centrifuger les cellules et transférer sur une plaque à 96 puits mesurer les niveaux YFP dans un lecteur de plaque standard à 96 puits capable d’enregistrer les signaux fluorescents surveiller l’évolution du signal YFP jusqu’à ce qu’un plateau soit atteint, indiquant la production maximale de protéines recombinantes. Récoltez les cellules à ce stade, stockez les pastilles cellulaires à moins 20 degrés Celsius à court terme ou à moins 80 degrés Celsius à long terme. Les cellules doivent être couchées selon une méthode adaptée aux besoins de la protéine, puis du cytosol et des noyaux.

Les protéines nucléaires fractionnées se trouvent généralement dans la pastille nucléaire. Tandis que les protéines cytosoliques restent dans le cytosol. La purification des protéines est grandement simplifiée par le fractionnement.

En effet, de nombreux contaminants peuvent être éliminés en une seule étape de centrifugation. Les complexes protéiques peuvent être facilement purifiés à partir de cultures cellulaires initiales à petite échelle en utilisant des méthodes de purification miniaturisées telles que la purification à plusieurs puits ou à micro-pointes. En conjonction avec des systèmes de chromatographie à petit volume tels que le micro ACTA, une étape future consistera à miniaturiser et à intégrer l’ensemble de la configuration expérimentale dans une petite application de table interfacée avec le poste de travail de clonage.

On voit ici le robot de traitement par lots à l’échelle microscopique actuellement en cours de développement, qui sera utilisé à cette fin. Une forte co-expression de protéines hétérologues est obtenue par le système multi-dos, comme illustré ici. Les interdictions de protéines surexprimées sont clairement perceptibles dans l’extrait de cellule entière, le WCE et le lysat clair.

La qualité et la quantité de la matière protéique produite sont souvent suffisantes. Permet la détermination structurée de complexes protéiques tels que le complexe de point de contrôle mitotique MCC illustré dans ce schéma. Souvent, le rendement de ces cycles de purification analytique est suffisant pour analyser la structure et la fonction du complexe purifié par divers moyens, y compris la microscopie électronique.

Les procédures opérationnelles standard que nous avons développées permettent aux utilisateurs non spécialistes d’appliquer facilement notre approche et notre technologie peut être utilisée dans de nombreux laboratoires intéressés par les grands complexes protéiques, tout comme c’est le cas aujourd’hui pour les petites protéines à Nikola. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le multi-sac afin de produire vos complexes protéiques d’intérêt en quantité et en qualité inégalées pour vos objectifs de recherche ambitieux. Travailler avec nos systèmes ne nécessite pas de conditions de sécurité particulières.

Cependant, gardez à l’esprit que le virus vous infectera si vous êtes négligent, même s’il ne se répliquera pas dans vos cellules. Par conséquent, une manipulation soigneuse de vos conditions de stéroïdes est indispensable lors de l’exécution de cette procédure. Notre méthode est devenue très populaire déjà dans plus de 600 laboratoires dans le monde.

Utilisez notre technique. Nous pensons qu’à l’avenir, notre méthode fera partie intégrante des efforts de génomique structurelle à grande échelle qui s’adressent à la zone complexe humaine. Cela peut aider à révéler la base des maladies et, à long terme, à conduire à de nouveaux médicaments et thérapies améliorés.