Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer les propriétés mécaniques du glycocalyx endothélial à l’aide d’un microscope à force atomique ou d’un FM. Ceci est réalisé par la première culture, une monocouche de cellules endothéliales sous un flux physiologique dans un bioréacteur afin de construire la couche de glycocalyx dans un deuxième temps. Des billes de taille d’un micron sont fixées à des porte-à-faux FM et utilisées comme sonde pour mesurer la force résistive du corps cellulaire et du glycocalyx lors de l’indentation. Ensuite, les courbes d’indentation sont ajustées avec un modèle à deux couches afin de déterminer le module et l’épaisseur du glycocalice, des résultats sont obtenus qui montrent que le glycocalice endothélial a un module de 0,7 kilo pascals et une épaisseur de 380 nanomètres sur la base de l’analyse à deux couches.

Bonjour, je m’appelle Rick Wa.Je suis président du département d’ingénierie biomédicale de l’Université de Rochester. Il y a eu beaucoup de discussions ces dernières années sur le rôle possible du glycocalyx endothélial dans l’inflammation, en particulier sur la question de savoir s’il pourrait agir comme une barrière protectrice pour empêcher l’adhésion cellulaire indésirable pendant l’inflammation. L’une des clés pour résoudre les questions qui entourent cette question est la capacité de mesurer les propriétés physiques, à savoir l’épaisseur et la rigidité de cette couche, à la fois dans des conditions normales et pendant la réponse inflammatoire.

Je m’appelle Graham Marsh. Je suis étudiant diplômé au département de génie biomédical de l’Université de Rochester. Le gros problème pour caractériser le glycocalyx endothélial est qu’il est incroyablement mou.

L’approche que nous avons trouvée est d’apposer un gros cordon à l’extrémité d’un porte-à-faux A FM afin que les forces mesurées puissent être résolues avec le A FM.To commencer cette procédure, construire une chambre d’écoulement comme celle montrée ici, capable de faire croître des cellules sous une contrainte de cisaillement de 1,0 Pascal. Préparez la chambre d’écoulement pour l’expérience en nettoyant d’abord les lames de verre dans une solution de piranha pendant 15 minutes. Rincez-les trois fois à l’eau distillée et séchez-les à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, enduisez les lames d’amino propyl trixi, de cy lane ou d’apte par dépôt en phase vapeur. Ajoutez un millilitre d’apte dans une fiole fixée à la chambre à vide avec l’échantillon. Ensuite, bouchez le ballon et faites un vide de 0,7 bar pendant une heure.

Pendant ce temps, rafraîchissez l’aspirateur trois fois. Ensuite, découpez un nouveau joint de chambre d’écoulement dans une feuille de silicone de 0,4 millimètre d’épaisseur à l’aide d’un outil de coupe silhouette SD. Le canal mesure 6,4 millimètres de large sur 19 millimètres de long, et le diamètre extérieur est réduit à 35 millimètres afin de s’insérer dans la parabole de culture de l’asile.

À l’aide de ces dimensions, calculez le débit nécessaire pour générer une contrainte pure d’un pascal avec l’équation illustrée ici. Q représente le débit. Tau, c’est le stress pur.

Mu est la viscosité du milieu. H est la hauteur du canal et W est la largeur de la chambre d’écoulement. L’étape suivante consiste à aligner la partie supérieure de la chambre d’écoulement avec le joint dans la boîte de culture cellulaire et à la fixer avec un anneau magnétique.

Connectez les orifices d’écoulement de la boîte de culture cellulaire à trois vannes ondulatoires avec des conduites aux seringues de 30 millilitres. Ensuite, stérilisez l’ensemble en rinçant avec de l’alcool isopropylique pendant cinq minutes. Retirez ensuite l’alcool et laissez-le sécher à l’air libre dans le tissu.

Sérum de veau fœtal préchauffé à 4 % dans le milieu McCoy’s à 37 degrés Celsius. Après avoir laissé sécher pendant cinq à 10 minutes, rincez l’alcool restant avec 30 millilitres de sérum de veau fœtal préchauffé. Remplissez ensuite les seringues avec 20 millilitres de milieu de croissance veek MCDB 1 31.

Ensuite, bouchez les seringues pour éviter toute contamination. Lorsque vous sortez le système de la hotte stérile, installez le capuchon du réservoir de récupération avec l’aiguille qui pénètre dans le fluide pour ramener le fluide vers le réservoir en amont. Enfin, fixez des filtres stériles de 0,2 micron aux entrées d’air sur les bouchons de la veine ombilicale humaine lors de la prochaine récolte.

Cellules endothéliales cultivées jusqu’à la confluence dans une fiole T 25. Remettre en suspension les cellules granulées à 100 000 cellules par millilitre dans le milieu et aspirer la solution dans une seringue. Injectez ensuite la suspension dans la chambre d’écoulement par la vanne à trois voies.

Laissez les cellules se déposer et adhérer au substrat de verre pendant deux heures. Avant de commencer l’écoulement, déplacez le bioréacteur et les cellules dans un incubateur où les cellules sont autorisées à se stabiliser et à adhérer pendant deux heures. Le tube reliant les réservoirs à une pompe péristaltique passe à l’arrière de l’incubateur Une fois que les cellules ont adhéré, réglez la pompe péristaltique sur le débit souhaité.

Le fluide se déplace entre les réservoirs, créant une charge de pression et un écoulement à travers le bioréacteur qui produit une contrainte de cisaillement de paroi d’un pascal. Laissez les cellules incuber avec un débit continu à 37 degrés Celsius pendant un à cinq jours jusqu’à ce que la chambre soit confluente. Pour commencer la préparation du cantilever, nettoyez une pointe et un cantilever FM dans de l’acide nitrique pendant cinq minutes, puis rincez à l’eau distillée.

Une fois sec, fonctionnaliser le cantilever avec apdi dans une chambre de dépôt en phase vapeur comme indiqué précédemment pour les lames de verre. Préparez ensuite une solution de cinq milligrammes par millilitre en poids NHS Sulf O lc, biotine dans la solution saline tamponnée de Hank. Immergez les porte-à-faux dans la solution pendant 15 minutes.

Cette réaction conjugue le CY et l’oxyde d’hydroxy final et présente des molécules de biotine à la surface des porte-à-faux. La veille, commencez à préparer une solution de milieu sans biotine en combinant 20 millilitres de milieu de culture vexcel contenant 20 % de sérum avec 200 microlitres de billes enrobées d’ENC streptoc, et incubez pendant 12 heures en tournant. Le jour de l’expérience.

Tirez les billes magnétiques au fond du tube à l’aide d’un aimant pendant deux minutes et transférez le surnageant contenant du milieu sans biotine dans un nouveau tube. Stérilisez le média en le faisant passer à travers un filtre de 0,22 micromètre et mettez-le dans un nouveau tube. L’étape suivante consiste à retirer la chambre d’écoulement de la boîte de culture cellulaire, puis à laver les cellules trois fois avec deux millilitres de milieu sans biotine à 37 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite un microgramme de 2,4 micromètres de diamètre, des perles enduites d’Aden dénudées. Ajoutez une concentration de 10 microgrammes par millilitre dans la boîte de culture cellulaire et mélangez-la délicatement. Ensuite, calibrez le tib A FM en le fixant à une perle de strippin et en le pressant sur une surface en verre ordinaire.

Pour ce faire, faites atterrir la pointe sur la surface du verre à côté d’une perle, rétractez la pointe, puis positionnez le sommet du porte-à-faux sur la perle et appuyez pendant plusieurs secondes. Enfin, utilisez le porte-à-faux calibré pour indenter les échantillons. Les billes de 2,4 micromètres offrent une plus grande surface de contact avec la surface de la cellule, de sorte que les propriétés mécaniques de la couche molle de glycocalyx peuvent être plus facilement détectées.

Pour accomplir cette position, le porte-à-faux sur une cellule près du noyau de la cellule, utilise une approche douce de la pointe sur la cellule pour régler la hauteur du porte-à-faux à environ trois micromètres au-dessus de la surface de la cellule. Ensuite, enfoncez la surface 20 fois à une vitesse d’un micromètre par seconde jusqu’à une force maximale de sept. Les nanonewtons permettent à six secondes de s’écouler entre les contacts successifs.

Calculez l’épaisseur de la couche de glycocalyx à l’aide d’équations liées à la théorie du hertz. La force d’indentation F est décrite par cette équation où delta est la profondeur d’indentation. R est le rayon de la sphère et estar est le module combiné des matériaux sous contrainte.

Afin de séparer le module d’élasticité combiné estar en composants cellulaires et glycocalices, traitez la couche de glycocalyx comme un film mou uniforme et mince à la surface du corps cellulaire et utilisez le modèle à deux couches de Clifford et C.In cette équation, PQ et N sont constants déterminés empiriquement à partir des ajustements de polymères. M est une constante du modèle polymère, et Z est lié à l’épaisseur du film mince ou de la couche de glycocalyx par l’équation illustrée ici. La force mesurée par le A FM mesuré en nano Newtons commence à augmenter après le contact avec la surface et est initialement dominée par le composant de la couche de glycocalice.

Une fois que la couche de glycocalyx est comprimée, le corps cellulaire devient le principal composant de la déformation. La ligne d’ajustement bleue à deux couches a été calculée en ajustant quatre paramètres libres pour qu’elle corresponde aux données d’indentation indiquées en rouge à partir de l’équation utilisée Le module de cellule, le glycocalice, le module de couche et l’épaisseur de la couche de glycocalyx peuvent tous être déterminés. Les propriétés de 25 cellules ont été compilées dans l’histogramme présenté ici.

Le module moyen de la couche de glycocalyx a été déterminé à 0,7 plus ou moins 0,5 kipa cals, et l’épaisseur de la couche de glycocalyx a été déterminée à 380 plus ou moins 50 nanomètres. Cette approche nous donne l’outil dont nous avions besoin pour répondre à des questions fondamentales sur le rôle du glycocalyx dans la régulation de l’adhésion cellulaire pendant l’inflammation. Nous sommes maintenant en mesure de répondre à des questions sur la façon dont les propriétés du glycocalyx sont modifiées pendant l’inflammation.

Par quels moyens ces changements sont accomplis. Cette approche peut être étendue de plusieurs façons. Par exemple, on pourrait l’utiliser pour tester de nouvelles descriptions théoriques plus sophistiquées des propriétés du glycocalice.

Ou sur un plan plus pratique, on pourrait être en mesure de l’utiliser pour tester des revêtements de surface bio-inspirés, conçus pour protéger les dispositifs implantables de la réponse immunitaire de l’hôte. Merci beaucoup de l’intérêt que vous portez à notre travail.