Name: Lutilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Découvrez l'utilisation des chémostats pour contrôler la croissance cellulaire en biologie des systèmes microbiens. Cette méthode permet d'étudier la régulation de la croissance et l'évolution adaptative.

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Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage forment la New York University. Nous remercions Maitreya Dunham et Matt Brauer qui a initialement développé l&#39;utilisation de bioréacteurs Sixfors comme chémostats.

Le principe de la culture en continu en utilisant un chemostat peut être réalisée dans une variété de mises en œuvre. Dans tous les chémostats il est essentiel d&#39;avoir une) méthodes pour maintenir la stérilité de tous les composants, 2) une culture bien mélangé, 3) l&#39;aération appropriée du récipient de culture et 4) un moyen fiable de plus de médias et l&#39;élimination de la culture. Ici, nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;un bioréacteur Sixfors (Infors Inc) en chemostat en utilisant des procédés qui peuvent être facilement adaptés à d&#39;autres configurations. Une. Assemblage des navires Chemostat <ol><li> Allumez les Sixfors l&#39;aide de l&#39;interrupteur principal. </li><li> Bien rincer le récipient chimiostatique, Ensemble agitateur, et le tube attaché avec (DI) de l&#39;eau déminéralisée. Vérifiez tous les tuyaux et les joints toriques et remplacer les pièces usées à la recherche. </li><li> Assurez-vous que la base de support d&#39;arbre d&#39;entraînement est tourné vers le haut dans le récipient en verre et que la partie supérieure de l&#39;arbre d&#39;entraînement est remis dans son logement sur l&#39;ensemble de l&#39;agitateur. Réglez le stirrer ensemble dans le récipient de verre assurant le bas de l&#39;arbre d&#39;entraînement est logé dans le support d&#39;arbre d&#39;entraînement. Utiliser la pince pour fixer l&#39;ensemble de l&#39;agitateur dans la cuve de verre. </li><li> Remplissez le réservoir avec environ 300 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Retirez les bouchons d&#39;un oxygène dissous (DO 2) sonde et vérifier le niveau d&#39;électrolyte en dévissant le boîtier en bas et en veillant à ce que le boîtier de fond est à moitié rempli avec une solution d&#39;électrolyte. Replacer le boîtier en bas et l&#39;insérer dans le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer. </li><li> Prenez une sonde de pH et la retirer de son tampon de stockage (3 M de KCl). Retirez le capuchon de la sonde de pH et le joindre à fermenteur 1. Utilisation de l&#39;écran de contrôle Sixfors, accédez au menu des paramètres de fermentation et sélectionnez &quot;calibrer pH&quot;. Placer la sonde de pH dans un tampon à pH 7 standard et fiche de lecture en tant que Haut Lire. Répéter l&#39;opération avec tampon à pH 4 et enregistrer la lecture en bas Lire. Détacher la sonde de pH de fermentation, laver avec de l&#39;eau DI et insérer la sonde into le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer. </li><li> Placer le récipient chimiostatique dans le rack. Remarque sur le navire qui fermenteur (1-6) de la sonde de pH a été connecté et calibré. Placez la sonde de pH bouchon sur la sonde de pH. Utilisant une feuille couvre bien le haut de la sonde à oxygène 2. </li><li> Plier la feuille sur les extrémités de la tubulure attachée au récipient chimiostatique. </li><li> Répétez les étapes 1.2 à 1.8 pour tous les navires. </li><li> Stériliser les navires en leur autoclavage pendant 15 min sur un cycle liquide. </li></ol> 2. Préparation des supports <ol><li> Établir la gamme de limitation des concentrations de nutriments par la croissance des cultures en lots de différentes concentrations d&#39;éléments nutritifs. Le nutriment est limitant dans la plage où la densité cellulaire finale est une fonction linéaire de la concentration des éléments nutritifs initiale (figure 4). Sélectionnez une concentration des éléments nutritifs dans la fourchette de limitation. Des exemples de composition de médias standard pour les études avec Saccharomyces cerevisiae sont disponibles en 11.7. </li><li> Autoclave une bonbonne vide qui est coiffé d&#39;un bouchon de caoutchouc contenant une entrée d&#39;air et une sortie de média après la première assurant que l&#39;extrémité du tube de support est recouvert d&#39;une feuille. </li><li> Dans un récipient séparé préparer 10 litres de médias. </li><li> Fixer un filtre de 500 ml tasse à une bouteille de 100 ml de médias. Retirez le filtre de coton avec des pinces stérilisées dans de l&#39;éthanol et joindre immédiatement au port de filtration sur la bonbonne de médias. </li><li> Fixez la bonbonne de médias à une source de vide et filtre stériliser les médias en l&#39;ajoutant à la coupe du filtre. </li><li> Lorsque la filtration des médias est terminée, fermer le port de filtration avec une pince métallique. </li></ol> 3. Calibrage faire 2 sondes et Configuration Chemostat <ol><li> Après les vaisseaux chémostat ont été autoclave et laisser refroidir endroit du navire dans son enveloppe de chaleur correspondant. Connectez la sonde de température, sonde de pH et DO 2 sonde. Laissez lenavire s&#39;asseoir avec le pouvoir pendant au moins 6 heures pour permettre aux DO 2 sondes à polariser. </li><li> Placez l&#39;extrémité de chaque tube effluents dans un récipient de collecte séparée. Connectez l&#39;alimentation en air via un filtre autoclave et tourner sur la circulation d&#39;air. L&#39;eau dans chaque récipient doit s&#39;écouler des tubes des effluents, ce qui indique que tous les joints sont correctement formés. </li><li> Ajuster la hauteur du tube d&#39;effluent en fonction du volume de travail désirée (par exemple, 300 ml). Nous utilisons une règle qui est marqué avec des stages de tubes calibrés pour différents volumes de travail. </li><li> Connectez la bonbonne de médias dans le récipient de chemostat. Utiliser de l&#39;éthanol afin de maintenir les extrémités des tubes aussi stérile que possible. Enfiler le tuyau de la pompe à travers la pompe et la pince ouverte. Appuyer manuellement sur la pompe jusqu&#39;à ce que les médias commencent à s&#39;écouler dans le récipient chimiostatique. Relâchez tube de la pompe, les médias doivent circuler librement dans le récipient chemostat. Lorsque le support atteint le tube effluent, rattacher tube à la pompe et serrer. </li><li> Lancer running le programme de base avec roue ensemble à 400 tours par minute et la température réglée à 30 ° C. </li><li> Pour calibrer faire 2 sondes, couper l&#39;arrivée d&#39;air et passer au gaz d&#39;azote. Attendez au moins une heure et enregistrer la valeur de mesure comme «faible en lecture&quot;. Revenez à alimentation d&#39;air (c&#39;est à dire contenant la concentration en oxygène ambiante), attendez au moins une heure supplémentaire et la mesure d&#39;enregistrement comme &quot;une grande lecture». </li><li> Lancer l&#39;enregistrement de données en utilisant le logiciel Iris. </li></ol> 4. Inoculation <ol><li> Utiliser 70% d&#39;éthanol pour stériliser la partie supérieure de la cuve de culture. </li><li> Retirez la vis sur le dessus de la cuve et pipette 1 ml d&#39;une culture de la nuit dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis. </li><li> Indiquer le moment de l&#39;inoculation dans Iris. </li><li> Attendez environ 24 h pour les cultures d&#39;atteindre la phase stationnaire précoce. Comme la culture se développe, l&#39;oxygène dissous et le pH diminue. Dans le cas des milieux de glucose limitatif, l&#39;oxygène dissous va revenir à ~ 100% en pha stationnairese. Pour les autres restrictions de nutriments oxygène dissous restera &lt;100% en phase stationnaire. </li></ol> 5. Lancement de pompes et d&#39;atteindre l&#39;état d&#39;équilibre <ol><li> Le taux de dilution est calculé en divisant le débit (la quantité de support s&#39;écoule dans la cuve par heure) par le volume de la culture. Par exemple, en utilisant un volume de 300 ml, un taux de dilution de 0,1 signifie que 30 ml de milieu est ajouté à la culture par heure. Parce que le système est sous pression positive le même volume est retirée de la cuve en sorte que la culture est diluée de manière continue. Une gamme de taux de dilution (D) peut être utilisé qui ne dépasse pas la vitesse maximale de croissance (μ max) des cellules, les cellules ci-dessus, qui seront éliminés par lavage du chemostat. </li><li> Choisissez réglages de la pompe, qui précisent le nombre de secondes, la pompe est sur et en dehors, pour établir le débit souhaité. La pompe délivre médias à un taux d&#39;environ 0,11 ml / sec. </li><li> Définir un programme utilisant l&#39;int Sixforserface qui spécifie le calage de la pompe, la température et la vitesse de la turbine. Démarrez le programme. </li><li> Videz les récipients collecteurs de liquide et enregistrer le temps. </li><li> Après au moins deux heures, utiliser un cylindre gradué pour mesurer combien les médias a été retiré de la cuve. Ce sera égal au volume qui a été ajoutée au récipient de chemostat. Calculer le taux (D = V effluents / V culture / heure) dilution. Réglez les paramètres de la pompe si le taux de dilution calculé ne correspond pas à taux de dilution désiré. </li><li> A l&#39;état d&#39;équilibre, la densité des cellules dans le chemostat ne change pas au fil du temps. Ceci peut être mesuré sans perturber la culture en échantillonnant la sortie. Nous définissons opérationnel atteindre l&#39;état d&#39;équilibre que les mesures de densité de cellules identiques qui sont séparés par au moins un doublement de la population. Atteindre l&#39;état d&#39;équilibre prendra environ huit générations de la culture après le début de la culture dilution. A l&#39;état d&#39;équilibre, les cellules se développent de façon exponentielle (i.e. taux de croissance constant au cours du temps) dans des conditions nutritives limitée. Le temps de doublement de la population (temps de génération) est ln (2) / D. </li><li> Continuer à mesurer périodiquement le volume des effluents pour la durée de l&#39;expérience pour s&#39;assurer que le taux de dilution constant est maintenu. </li></ol> 6. Application 1: étude des cellules en croissance à des taux différents dans l&#39;état d&#39;équilibre <ol><li> A l&#39;état d&#39;équilibre dans le chemostat, le taux de la population de cellules de croissance est égal au taux de dilution. En modifiant systématiquement le taux de dilution, il est possible de cultiver des cellules à des vitesses différentes. Ceci permet l&#39;étude systématique des paramètres physiologiques qui varient avec le taux de croissance y compris le volume des cellules, l&#39;étape du cycle cellulaire et de la résistance au stress. En outre, les profils état d&#39;équilibre de l&#39;ARNm mondiale, les protéines et les niveaux de métabolites peuvent être testés dans des cellules en croissance à des taux différents. Il ya deux façons d&#39;acquérir des échantillons: </li><li> Petits échantillons peuvent être passivement obmaintenue en plaçant l&#39;extrémité du tube d&#39;effluent dans un tube de 1,5 ml ou de 15 ml. Un échantillon de 5.1 ml peuvent être obtenus en quelques minutes (en fonction de la vitesse d&#39;écoulement). De nombreux paramètres physiologiques peuvent être mesurées à partir de ces échantillons. </li><li> expression des gènes, ou de métabolites analyses nécessitent des échantillons plus larges qui doivent être obtenus le plus rapidement possible. Placer l&#39;extrémité du tube d&#39;effluent dans un tube conique de 15 ml. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement. A ~ 10 ml d&#39;échantillon remplira rapidement votre tube. Garder à l&#39;esprit que le volume dans le récipient chimiostatique a changé. Si plusieurs échantillons consécutifs sont prises, il peut être nécessaire de réduire le débit pour maintenir un taux de dilution constant. </li></ol> 7. Application 2: la mesure précise des différences de taux de croissance entre les génotypes dans des environnements contrôlés en utilisant des analyses de la concurrence fondée sur cytométrie de flux <ol><li> Chémostats peuvent être utilisés pour quantifier avec précision l&#39;effet de la concentration en éléments nutritifssur les différences de taux de croissance (c&#39;est à dire de remise en forme) entre différents fonds génétiques. Par des souches de co-culture marquées avec différentes protéines fluorescentes de la vitesse de variation de l&#39;abondance relative pendant la croissance exponentielle est déterminée. Réalisation de ce test à différents taux de dilution (D) permet l&#39;étude des effets de la concentration (s) nutriment sur ​​les différences de remise en forme. </li><li> Établir les cultures des deux souches dans les vaisseaux chémostat séparées avec des taux de dilution identiques et un volume de 300 ml état d&#39;équilibre. </li><li> Passivement échantillon de 1 ml de chaque navire. Spin bas cellules, remettre en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS) et le lieu à 4 ° C. Ces échantillons contiennent des échantillons de cellules homogènes, qui sont des commandes pour l&#39;analyse de cytométrie de flux subséquente. </li><li> Placer le tube effluent d&#39;un navire dans une éprouvette graduée autoclave. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement vers le bas pour expulser les cellules du chemostat. Quandle volume atteint 150 ml, retourner l&#39;extrémité métallique du tube effluent à sa position initiale (300 ml). Répéter l&#39;opération avec le second navire, en utilisant une éprouvette graduée différente. </li><li> Utilisation éthanol à 70% pour maintenir la stérilité tout en enlevant les vis sur la partie supérieure du récipient chimiostatique. Placez l&#39;entonnoir dans l&#39;ouverture et versez 150 ml de l&#39;autre culture dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis. Répéter l&#39;opération avec le second navire, en utilisant le second entonnoir. Chaque récipient chimiostatique contient maintenant un mélange des deux souches. </li><li> Obtenir un échantillon de 1 ml de chaque navire par échantillonnage passif chaque 2-6 h. Isoler les cellules, remettre en suspension dans du PBS et conserver à 4 ° C. Continuez à prendre des échantillons pour l&#39;enregistrement 2-3 jours soigneusement le temps de chaque échantillon a été prélevé. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, traitement par ultrasons et diluer les échantillons à ~ 2 x 10 6 cellules / ml. En utilisant la cytométrie en flux, de mesurer la proportion des deux souches dans chaque échantillon. Comme les deux souches sont en croissance exponentielle, la différence de taux de croissance relative estdéterminé par régression linéaire de ln (strain1/strain2) en fonction du temps (mesuré dans les générations). La pente de la régression est proportionnelle à la différence dans le taux de croissance (c&#39;est à dire l&#39;avantage de gym) d&#39;une souche par rapport à l&#39;autre. </li><li> Comme la culture mixte peut prendre un certain temps pour atteindre un nouvel état d&#39;équilibre, des points de temps au début peuvent s&#39;adapter mal à la régression. Ce problème est résolu meilleur en permettant 2-3 générations s&#39;écouler avant le début de l&#39;échantillonnage ou de retirer début points qui sont aberrantes claires. Inversement, une fois une souche a surpassés l&#39;autre, les données ne sont plus utiles et ces points doivent être exclus. </li></ol> 8. Application 3: Evolution expérimentale <ol><li> Évolution expérimentale effectuée dans chémostats sélectionne des mutants qui augmentent dans la forme physique dans l&#39;environnement des éléments nutritifs limités. La sélection est généralement effectuée sur des centaines de générations. </li><li> Établir une culture chimiostatique l&#39;état d&#39;équilibre en utilisant une souchegénotype connu (et la séquence du génome de préférence connu) et un nutriment limitation définie. </li><li> Pour maintenir un «fossiles» de la population d&#39;adaptation passive échantillon chemostat tous les 2-3 jours et stocker l&#39;échantillon dans 15% de glycérol à -80 ° C. </li><li> Surveiller le réservoir de médias et de reconstituer des milieux frais comme nécessaires. </li><li> Maintenir la culture en croissance exponentielle pour plusieurs centaines de générations. </li><li> Après l&#39;achèvement de la plaque de sélection d&#39;un échantillon de cellules sur des plaques de gélose solide. Après que les cellules ont grandi dans les colonies, choisir un échantillon biaisé de colonies à l&#39;aide de cure-dents et inoculer clones dans les puits individuels d&#39;une plaque de 96 puits contenant 100 pi de milieu. Permettre aux échantillons de clones de croître pendant la nuit, ajouter 100 ul de 30% de glycérol et en magasin -80 ° C. </li><li> Caractériser clones par séquençage du génome entier et effectuer des dosages phénotypiques y compris l&#39;évaluation de la condition physique, en utilisant une souche de référence marqué par fluorescence commun, tel que décrit dans la demande 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

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<li>Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+hopf+bifurcation+in+a+live+predator-prey+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system.</a> Science. 290, 1358-1360 (2000).</li>
<li>Cohen, E. P., Eagle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+chemostat+for+the+growth+of+mammalian+cells%3A+characteristics+of+cell+growth+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture.</a> J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Chémostats permettent la culture de microbes dans des conditions stables de croissance contrôlée. Les cellules se développent en continu à un débit constant résulte en un environnement externe invariant. Ceci est en contraste aux méthodes de culture du lot dans lequel l&#39;environnement extérieur est en constante évolution et le taux de croissance des cellules est déterminé par l&#39;interaction complexe de l&#39;environnement et le génotype. Ainsi, un avantage majeur de la mise en culture des microbes dans chémostats ...

La croissance des cellules est régulée par des réseaux complexes d&#39;interaction des facteurs génétiques et environnementaux 1,2. Le règlement multifactorielle de la croissance cellulaire nécessite une approche au niveau du système à son étude. Cependant, l&#39;étude rigoureuse de la croissance cellulaire régulée est contestée par la difficulté de contrôler expérimentalement la vitesse à laquelle les cellules se développent. En outre, même dans les expériences les plus simples conditions extracellulaires sont souvent dynamique et complexe que les cellules modifient en permanence leur environnement comme ils prolifèrent. Une solution à ces problèmes est proposée par le chemostat: un procédé de culture de cellules qui permet un contrôle expérimental des taux de croissance de cellules dans des milieux définis, invariantes et contrôlées. La méthode de culture en continu en utilisant un chemostat a été décrite de façon indépendante par Monod 3 et Novick et Szilard 4 en 1950. Conçu à l&#39;origine, les cellules sont cultivées dans un volume fixe de médias qui est concontinuellement dilué par ajout de nouveaux médias et l&#39;élimination simultanée des médias traditionnels et des cellules (Figure 1). Équations différentielles ordinaires couplées (figure 2) décrivent la vitesse de variation de la densité de cellules (x) et la concentration d&#39;un nutriment (s) limitant la croissance dans le récipient chimiostatique. Surtout, ce système d&#39;équations prédit un seul (non nul) stable à l&#39;état d&#39;équilibre (figure 3) avec l&#39;implication remarquable à l&#39;état d&#39;équilibre, le taux de croissance spécifique des cellules (c&#39;est à dire la constante de taux de croissance exponentiel) est égal au taux au cours de laquelle la culture est diluée (D). En faisant varier le taux de dilution, il est possible d&#39;établir des populations à l&#39;état stable de cellules à différents taux de croissance et dans différentes conditions de limitation en nutriments. Le contrôle expérimental des taux de croissance à l&#39;aide chémostats était essentielle pour le développement d&#39;une compréhension de la façon dont les changements de la physiologie cellulaireavec des taux de croissance de 5,6. Cependant, cet ancien pilier de méthodes microbiologiques est devenu de plus en plus obscure lors de l&#39;explosion dans la recherche en biologie moléculaire au cours de la fin du XXe siècle. Aujourd&#39;hui, un regain d&#39;intérêt dans le contrôle de la croissance dans les deux microbes et les organismes multicellulaires et l&#39;avènement de méthodes échelle du génome pour l&#39;analyse au niveau des systèmes a renouvelé motivation pour l&#39;utilisation de chémostats. Ici, nous décrivons trois applications qui tirent sur le contrôle précis des taux de croissance de cellules et l&#39;environnement extérieur qui sont uniquement possible en utilisant chémostats. Tout d&#39;abord, nous décrivons l&#39;utilisation de chémostats d&#39;étudier comment l&#39;abondance de milliers de biomolécules - tels que les transcriptions et des métabolites - sont réglementés de manière coordonnée avec les taux de croissance. Deuxièmement, nous décrivons comment chémostats peuvent être utilisées pour obtenir des estimations précises des écarts de taux de croissance entre les différents génotypes dans des environnements peu fertiles en utilisant des expériences de compétition. Troisièmement, nous décrivons comment peut chémostatsêtre utilisé pour étudier l&#39;évolution adaptative des cellules en croissance dans des environnements pauvres en éléments nutritifs constants. Ces exemples illustrent la façon dont les chémostats activez enquêtes au niveau des systèmes de régulation de la croissance cellulaire, génique par des interactions de l&#39;environnement et l&#39;évolution adaptative.

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>Appropriate Technical Resources, Inc.</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bouteille en verre 9,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-887-1</td><td>Pour récipient multimédia et</td></tr> tuyau <tr><td>Pinchcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-867</td><td>Pour récipient multimédia et bouchon de tuyau</td></tr><tr><td>, taille 12, néoprène vert</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-62991-42</td><td>Pour récipient multimédia et</td></tr><tr><td>tuyau Connecteur droit</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30703-02</td><td>Pour récipient multimédia et tuyau</td></tr><tr><td>Général 4 po</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9557052</td><td>Pour cuve de média et tube de tuyau</td></tr><tr><td>,</td><td>Petites pièces</td> en caoutchouc de silicone <td>B000FMWTDE</td><td>Pour cuve de média et tube de tuyau</td></tr><tr><td>, silicone, 3/8 po de diamètre extérieur</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>Pour récipient de média et tube de tuyau</td></tr><tr><td>, silicone, 7/32 po de diamètre extérieur</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>Pour récipient de média et tuyau</td></tr><tr><td>Tubes, acier inoxydable, 3/16 po OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td><td>Pour cuve de média et tube de tuyau</td></tr><tr><td>, acier inoxydable, 3/8 po OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>Pour cuve de média et</td></tr><tr><td>connecteurs de crochet</td> de tuyau <td>Fisher Scientific</td><td>14-66-18Q</td><td>Pour cuve de média et</td></tr><tr><td>tuyau Pince à cliquet</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06403-11</td><td>Pour cuve de média et tuyau</td></tr><tr><td>Luer, Femelle</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45512-34</td><td>Pour Récipient de Média et Tuyau</td></tr><tr><td>Luer, Mâle</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45513-04</td><td>Pour Récipient de Média et</td></tr><tr><td>Tuyau Millipore Aervent MTGR05010 Filtre de 62 mm, 0.2 &mu ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010</td><td>Pour cuve de média et tuyau</td></tr><tr><td>Filtres PTFE Acrodisc CR 13 mm, 0,2 &mu ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9131037</td><td>Pour récipient de média et tuyau</td></tr><tr><td>Tube d’écoulement à lecture directe pour l’air</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32047-77</td><td>Pour la configuration de l’azote</td></tr><tr><td>gazeux Tube d’écoulement à lecture directe pour l’azote</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32048-63</td><td>Pour la configuration de l’azote</td></tr> gazeux <tr><td>Proportionneur de gaz Cadres multitubes</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-50</td><td>Pour la configuration de</td></tr> <tr><td>l’azote gazeuxRégulateur, airgas analytique à deux étages</td><td></td><td>Y12-N145D580</td><td>pour la configuration de l’azote Adaptateur</td></tr> de <tr><td>tuyau, acier inoxydable</td><td>Airgas</td><td>Y99-26450</td><td>Pour la configuration de l’azote</td></tr><tr><td>Adaptateur mâle</td><td>Airgas</td><td>WES544</td><td>Pour la configuration de l’azote gazeux</td></tr><tr><td>Tube Norprene</td><td>US Plastics</td><td>57280</td><td>Pour la configuration de l’azote Gaz</td></tr><tr><td>Base de trépied</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-58</td><td>Pour l’installation de l’azote</td></tr><tr><td>gazeux Cartouches de soupape</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03217-92</td><td>Pour l’installation de l’azote gazeux</td></tr><tr><td>Carboy 10 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-963-2A</td><td>Pour la préparation des médias</td></tr><tr><td>Steritop Filtres stériles pour bouteilles sous vide, 1 000 ml, membrane PES ; pour un col de 45 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP-T10-RE</td><td>Pour la préparation des médias</td></tr><tr><td>Flacon de média 100 ml, taille du</td> <td>col de 45 mmFisher Scientific</td><td>FB-800-100</td><td>Pour la préparation des milieux chlorure</td></tr><tr><td>de calcium &middot ; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Réactifs</td></tr> de <tr><td>média chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Réactifs de</td></tr><tr><td>média sulfate de magnésium&middot ; Médias 230391 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Réactifs Média</td></tr> Phosphate <tr><td>de potassium monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423400010</td><td>Réactifs Chlorure</td></tr><tr>de<td>potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>Milieux Réactifs</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Réactifs de</td></tr><tr><td>milieu sulfate de cuivre & middot ; 5H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Media Réactifs</td></tr><tr><td>iodure de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60400</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>chlorure ferrique&middot ; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td><td>Réactifs de média</td></tr><tr><td>sulfate de manganèse &middot ; H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Media Reagents</td></tr> sodium <tr><td>molybdate&middot ; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Réactifs de milieu</td></tr><tr><td>sulfate de zinc&middot ; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td>Réactifs de média</td></tr><tr><td>biotine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td>Réactifs de</td></tr><tr><td>pantothénate de calcium</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC24330-1000</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>d’acide folique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td>Réactifs de média</td></tr><tr><td>inositol (alias myo-inositol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12226-1000</td><td>Réactifs de média</td></tr><tr><td>niacine (alias acide nicotinique)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td>Réactifs de média</td></tr><tr><td>acide p-aminobenzoïque</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14621-2500</td><td>Réactifs de média</td></tr><tr><td>pyridoxine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9755</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>de média riboflavine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500-25G</td><td>Réactifs de</td></tr><tr><td>média thiamine HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP892-100</td><td>Réactifs de média</td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td>Réactifs de média</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich U0750</td><td></td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>de média Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0155-08-5</td><td>Réactifs de média</td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Les cellules régulent leur taux de croissance en réponse à des signaux provenant du monde extérieur. Comme la cellule se développe, divers processus cellulaires doivent être coordonnés y compris la synthèse macromoléculaire, le métabolisme et, finalement, de l&#39;engagement avec le cycle de la division cellulaire. Le chemostat, une méthode de contrôle expérimentalement le taux de croissance de la cellule, fournit un puissant moyen d&#39;étudier systématiquement la façon dont les impacts des taux de croissance les processus cellulaires - y compris l&#39;expression des gènes et le métabolisme - et les réseaux de régulation qui contrôlent le taux de croissance des cellules. Lorsque maintenue pendant des centaines de générations chémostats peut être utilisé pour étudier l&#39;évolution adaptative des microbes dans des conditions environnementales qui limitent la croissance des cellules. Nous décrivons le principe des cultures chémostat, démontrer leur fonctionnement et de fournir des exemples de leurs diverses applications. Après une période de désuétude après leur introduction dans le milieu du XXe siècle, la convergence des méthodologies échelle du génome d&#39;un renouvellement enintérêt dans la régulation de la croissance cellulaire et la base moléculaire de l&#39;évolution adaptative est de stimuler une renaissance de l&#39;utilisation des chémostats dans la recherche biologique.

Un avantage majeur de chémostats est la capacité de contrôler le taux de croissance des cellules expérimentalement en faisant varier le taux de dilution. Chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, la morphologie d&#39;une cellule est informative de la phase dans le cycle de la division cellulaire. Populations avec des taux de croissance plus élevés contiennent une proportion plus élevée de division active des cellules tel que déterminé par la mesure de la fraction de cellules unbudded (figure 5A).</s...

taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l&#39;étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Les objectifs généraux de la présentation suivante sont de décrire le principe du chimiostat, de démontrer son fonctionnement et de fournir des exemples d'applications utilisant des chimiostats. Cela est réalisé en assemblant d'abord le récipient du chimiostat, en l'ensachant, puis en ajoutant continuellement du nouveau milieu tout en éliminant l'ancien milieu et les cellules à un débit constant. Un modèle mathématique décrit la variation de la densité cellulaire et la variation de la concentration d'un nutriment limitant la croissance dans chaque chimiostat.L'utilisation de ces équations permet de prédire un unique état stationnaire stable non nul, auquel les concentrations cellulaires et nutritionnelles sont constantes, et où la vitesse spécifique de croissance des cellules est égale à la vitesse à laquelle les cellules sont éliminées. En combinant le contrôle précis de la croissance cellulaire et de l'environnement au sein des chémostat avec d'autres technologies, il est possible d'obtenir des résultats permettant des études à l'échelle du système sur la régulation de la croissance cellulaire, les modifications génétiques et l'évolution adaptative. Le principal avantage de cette méthode de culture cellulaire par rapport à d'autres techniques réside dans le fait que la vitesse de croissance est contrôlée et que l'environnement externe des cellules reste constant.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et de l'évolution, comme quelle est la base moléculaire de la régulation de la croissance cellulaire et de l'évolution adaptative dans des environnements définis. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la mise en place et le maintien de cultures en chimostat sont difficiles en raison du grand nombre d'étapes et de composants impliqués. Commencez cette procédure en allumant d'abord le système six four à l'aide de l'interrupteur principal.Ensuite, rincez soigneusement le récipient hémostatique, l'ensemble d'agitation et les tubulures attachées avec de l'eau déionisée. Vérifiez toutes les tubulures et les joints toriques, et remplacez les pièces usées ou ayant un aspect détérioré. Une fois l'ensemble d'agitation et l'arbre d'entraînement assemblés, remplissez le récipient avec 300 millilitres d'eau DI.Vérifiez le niveau d'électrolyte de la sonde à oxygène dissous, en vous assurant que le boîtier inférieur est rempli à moitié de solution d'électrolyte. Ensuite, étalonnez la sonde de pH. Une fois l'étalonnage terminé, détachez la sonde du fermenteur.Rincez à l’eau DI et insérez-la dans le port du récipient hémostatique. Vissez jusqu’à ce que ce soit serré avec les doigts. Une fois les sondes connectées, placez le récipient hémostatique dans le support en notant clairement sur le récipient avec quel fermenteur la sonde de pH a été étalonnée. Enfin, préparez les sondes et les tubulures pour la stérilisation à l’autoclave en mettant le capuchon sur la sonde de pH et en recouvrant la sonde d’oxygène dissous ainsi que toutes les extrémités libres des tubulures avec du papier aluminium adapté à l’autoclave.Une voiture vide fermée par un bouchon en caoutchouc comportant une entrée d'air et une sortie de milieu. Veillez à ce que l'extrémité du tube de milieu soit recouverte de papier d'aluminium. Fixez un gobelet filtrant de 500 millilitres à une bouteille de milieu de 100 millilitres.Retirer le filtre en coton du filtre à l’aide de pinces, stérilisées à l’éthanol, puis l’attacher immédiatement au port de filtration sur la voiture de milieu. Fixer la voiture de milieu à une source de vide et filtrer. Stériliser 10 litres de milieu fraîchement préparé en l’ajoutant au récipient du filtre.Lorsque la filtration du milieu est terminée, fermez le port de filtration à l’aide d’une pince métallique. Une fois que les récipients hémostatiques ont été stérilisés en autoclave et laissés refroidir, placez le récipient dans son manchon chauffant correspondant. Connectez la sonde de température, la sonde de pH et la sonde d’oxygène dissous.Laisser le récipient en marche pendant au moins six heures afin de permettre la polarisation des sondes d'oxygène dissous. Ensuite, relier le carbo-milieu au récipient hémostatique. Utiliser de l'éthanol afin de maintenir les extrémités des tubes aussi stériles que possible.Ensuite, passez le tube de la pompe à travers la pompe et ouvrez le collier. Puis, placez l'extrémité de chaque tube d'effluent dans un récipient de collecte séparé. Connectez l'alimentation en air à l'aide d'un filtre autoclave et activez le débit d'air.L'eau dans chaque muscle doit s'écouler par les tubes de sortie, ce qui indique que tous les joints sont correctement formés. Ajustez la hauteur du tube de sortie au volume de travail souhaité de 300 millilitres. Appuyez manuellement sur la pompe jusqu'à ce que le milieu commence à s'écouler dans le récipient hémostatique.Ensuite, relâchez le tube de la pompe. Lorsque le milieu atteint le tube de sortie, réattachez le tube à la pompe et serrez-le avec le milieu amorcé. Lancez le programme de base avec l'agitateur réglé à 400 tr/min et la température fixée à 30 degrés Celsius.Ensuite, étalonnez les sondes à oxygène dissous en coupant l'alimentation en air et en passant au gaz azote. Attendez au moins une heure et enregistrez la valeur mesurée comme lecture basse. Revenez à une alimentation en air contenant une concentration ambiante d'oxygène et attendez au moins une heure supplémentaire.Enregistrez cette mesure comme la valeur de lecture élevée. À ce stade, lancez l'enregistrement des données à l'aide du logiciel iris avant l'inoculation. Stérilisez le dessus du récipient de culture avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, ouvrez le port du récipient à l’aide d’un tournevis et pipetez un millilitre d’une culture de nuit dans le récipient, puis remplacez la vis une fois terminé. Une fois que les cultures ont atteint leur phase stationnaire précoce, démarrez les pompes et établissez un débit souhaité. En précisant le nombre de secondes pendant lesquelles la pompe est activée et désactivée, réglez le débit et le volume de culture.Déterminez le taux de dilution. À l'aide de l'interface six fours, définissez un programme qui précise la température de temporisation de la pompe et la vitesse de l'agitateur. Ensuite, démarrez le programme après au moins deux heures.Enregistrez l'heure et utilisez un cylindre gradué pour mesurer la quantité de milieu retirée du récipient. La quantité prélevée sera égale au volume ajouté au récipient muni d'un hémostat et peut être utilisée pour calculer le taux de dilution, prélever le flux sortant et l'utiliser pour mesurer la densité cellulaire. La croissance en régime permanent est atteinte lorsque la densité cellulaire ne varie pas dans le temps.Une fois l'état stationnaire atteint, prélevez de petits échantillons en les recueillant depuis le tube effluent pendant quelques minutes, en laissant le liquide s'écouler passivement dans un tube de collecte. Les analyses d'expression génique et de métabolites nécessitent des échantillons plus volumineux. Ceux-ci peuvent être obtenus rapidement en desserrant la vis, en tenant l'extrémité métallique du tube effluent et en abaissant lentement le tube.Lorsqu'un grand volume est prélevé, le débit doit être réduit afin de maintenir le même taux de dilution. Commencez par établir des cultures en état stationnaire de deux souches de levures ayant des taux de dilution et des volumes identiques. Prélevez un millilitre de chaque récipient afin d'obtenir des témoins destinés à une analyse ultérieure par cytométrie en flux. Centrifugez les cellules pendant une minute à 6 000 tr/min, resuspendez-les dans un millilitre de PBS et conservez le tube à quatre degrés Celsius.Ensuite, placez le tube d'effluent d'un récipient à la fois dans un cylindre gradué autoclave. Relâchez la vis de fixation du tube d'effluent et poussez doucement vers le bas pour expulser 150 millilitres de cellules du chémostat, puis remettez l'extrémité métallique du tube d'effluent en position initiale. Une fois terminé, après avoir stérilisé la zone, ouvrez le port du récipient situé en haut du chémostat.Placer un entonnoir stérile à l'ouverture et ajouter 150 millilitres de l'autre culture. Ensuite, fermer le port et répéter l'opération avec le second récipient. Chaque récipient contient maintenant un mélange 50/50 des deux souches ; prélever éventuellement des échantillons toutes les deux à six heures pendant deux à trois jours.Conserver les échantillons dans du PBS et analyser les proportions de souches dans chaque échantillon par cytométrie en flux. Après avoir établi une culture en régime permanent à l’aide d’une souche de génotype connu soumise à une limitation nutritionnelle définie, maintenir la culture non perturbée pendant plusieurs centaines de générations, en renouvelant le réservoir de milieu avec du milieu frais selon les besoins. Conserver un enregistrement fossile de la population en adaptation en prélevant passivement le flux de sortie tous les deux à trois jours.Conserver l'échantillon à 15 % de glycérol à moins 80 degrés Celsius après la fin de la sélection, prélever un échantillon de cellules sur des boîtes de gélose solide. Une fois que les cellules ont formé des colonies, choisir un échantillon non biaisé de colonies à l'aide de bâtonnets et ensemencer les clones dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits contenant 100 microlitres de milieu. Laisser les échantillons clonaux croître toute la nuit.Ensuite, ajouter 100 microlitres de glycérol à 30 % dans chaque puits et conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation pour l'analyse génomique. Un avantage majeur des chemostats est la possibilité de contrôler la vitesse de croissance des cellules. Le pourcentage de cellules de levure, qui bourgeonnent comme indiqué ici sur l'axe des Y, constitue une bonne représentation de leur vitesse de croissance.Comme observé ici. Ce pourcentage augmente de manière presque linéaire avec un taux de dilution accru. Des taux de dilution plus rapides entraînent des taux de croissance plus élevés, ce qui peut conduire à des augmentations systématiques de l'expression génique, représentées ici par une augmentation de l'abondance des ARNm de la région UTR deux.Cependant, des diminutions systématiques de l'expression génique peuvent également survenir avec une augmentation de la vitesse de croissance, comme dans le cas du MAS un. La capacité de survie relative de différents génotypes peut être déterminée en réalisant des tests de compétition en chimostat à l'aide de cellules marquées par fluorescence et d'une analyse par cytométrie en flux ; le résultat présenté ici est un exemple représentatif dans lequel un mutant a été mis en compétition avec une souche sauvage marquée par fluorescence. Dans cet exemple, la souche mutante présente un avantage de 40 % par génération en termes de vitesse de croissance.L'analyse de la séquence du génome entier peut être utilisée pour identifier des mutations acquises dans des cellules présentant une aptitude accrue, après une sélection à long terme dans des chemostats. Par exemple, l'analyse d'expériences indépendantes d'évolution adaptative en conditions de limitation en azote a révélé différents allèles variants du nombre de copies au locus gap, qui code pour la perméase générale des acides aminés. Suite à cette procédure, d'autres méthodes telles que la spectrométrie de masse, la cytométrie en flux et le séquençage de nouvelle génération peuvent être utilisées afin de répondre à des questions similaires concernant la régulation au niveau du système de la croissance cellulaire et de l'évolution adaptative.Le développement de cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans des domaines allant de la microbiologie à la biologie cellulaire pour étudier comment la physiologie cellulaire et les processus moléculaires sont influencés par la variation de la vitesse de croissance cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de préparer et de maintenir des cultures chimostatiques, ainsi que des différentes façons dont les échantillons sont requis selon les applications.

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