Name: Génération de lignées stables de cellules humaines avec inductible par la tétracycline (Tet-on) shRNA ou expression dADNc (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Apprenez à générer des lignées stables de cellules humaines avec expression inducible par tétracycline de shRNA ou d'ADNc. Cette méthode permet un contrôle réversible de l'expression génique pour étudier la fonction des gènes.

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Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire pour des discussions utiles. Nous remercions Joanna et Christina Lisztwan Gewinner pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le BBSRC BB/I021248/1 subvention et le Wellcome Trust est une subvention 090090/Z/09/ZAH Wellcome Research Trust carrière collègue de développement à l&#39;Institut du cancer UCL.

1. Clonage de pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol><li> Comme le montre la figure 3, effectuez un condensé partielle du plasmide pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) avec les enzymes de restriction Xba I et Nco I pour éliminer le gène TetR et le promoteur de la résistance blasticidine (BlastR) gène. Isoler le fragment de 4,6 kb vecteur. </li><li> Pour supprimer la séquence de polyadénylation du gène TetR, introduit par PCR un site Xho I immédiatement après le codon stop de l&#39;ADNc TetR tout en conservant le site Xba I à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;ADNc. Sous-cloner le fragment résultant dans pMigR1 17 en utilisant les enzymes de restriction Xbal et Xhol pour générer le plasmide pMigR1_TetR. </li><li> Digérer le vecteur pMigR1_TetR avec les enzymes de restriction Xba I et le Nco I pour libérer le fragment TetR_IRES. Isoler le fragment de 1,25 kb insert. </li><li> Ligaturer le 4,6 kb pcDNA6/TR et de 1,25 ko fragments TetR_IRES. Transform le produit de ligation dans E.coli compétentes et d&#39;identifier la construction pcDNA6_TetR_IRES_blast souhaité à l&#39;aide des techniques classiques de biologie moléculaire. </li></ol> 2. Génération de lignées cellulaires exprimant de façon stable TetR <ol><li> Au jour 1, semences 1x10 6 cellules par 10 cm de plaque de culture tissulaire en utilisant votre milieu de croissance standard (par exemple DMEM supplémenté avec 10% de SVF). Semences deux plaques, une pour la transfection avec pcDNA6_TetR_IRES_blast, et l&#39;autre en tant que témoin négatif pour la sélection blasticidine. Vérifiez que vous utilisez le plus possible le passage et le milieu de croissance recommandé. </li><li> Le jour 2, transfecter une plaque avec 2 ug de pcDNA6_TetR_IRES_blast utilisant Fugene 6 (E2691, Promega) selon les instructions du fabricant. Ne transfecter la seconde plaque. </li><li> Au jour 3, ajouter du milieu de croissance standard contenant 5 pg / ml blasticidine aux deux plaques. S&#39;il vous plaît noter que la concentration sélection optimale peut varier d&#39;une lignée cellulaire donnée et la puissance nEED à être déterminé à l&#39;avance. </li><li> Au jour 4, diviser les cellules à 1/5, 1/25, 1/50 et 1/100 en utilisant des plaques de 10 cm et milieu de croissance standard contenant 5 mg / ml blasticidine. Assurez-vous d&#39;étiqueter correctement les plaques contenant des cellules non transfectées ou transfectées. Préparer deux plaques à l&#39;étape de dilution. </li><li> Vérifiez cellules quotidien, veiller à ce que toutes les cellules sur les plaques non transfectées sont morts pendant la première semaine. Changer milieu de sélection tous les 2-3 jours. </li><li> Après 1-2 semaines, blasticidine colonies résistantes devraient commencer à apparaître. Sélectionner des plaques contenant de 5 à 50 colonies afin de s&#39;assurer que seules les colonies peuvent être récupérés. </li><li> Lorsque les colonies ont atteint un diamètre d&#39;environ 5 mm (ou plus), d&#39;isoler au moins 12 clones indépendants utilisant des cylindres de clonage pour ramasser des colonies isolées. Transférer chaque clone dans un puits séparé d&#39;une plaque de 24 puits de culture de tissu. Lorsque confluentes, diviser les cellules de chaque puits en un seul puits d&#39;une plaque à 6 puits de culture de tissu. </li><li> Continuer à cl cultureceux de milieux de sélection. Lorsque confluentes, les cellules divisées de chaque puits dans deux puits individuels d&#39;une plaque à 6 puits de culture de tissu. </li><li> Pour chaque clone à tester, ainsi geler une des cellules confluentes et les cellules de capture dans le puits pour les autres essais ultérieurs par immuno-empreinte. </li><li> Détecter TetR par Western blot en utilisant l&#39;anticorps monoclonal anti-TET02 anticorps (Mobitec GmbH). Oublier d&#39;inclure un lysat de la lignée cellulaire parentale comme contrôle négatif. </li><li> Sélectionnez 3 clones avec la plus haute expression TetR et développer chaque culture clonale. Geler les stocks de chaque clone prometteur dès que possible. Enfin, examinez les paramètres moléculaires et cellulaires biologiques d&#39;intérêt en comparant les lignées cellulaires parentales avec les clones exprimant TetR. Sélectionnez le &quot;meilleur&quot; clone avec la plus haute expression TetR qui n&#39;affiche pas de changements dans les paramètres moléculaires et cellulaires biologiques d&#39;intérêt. </li></ol> 3. Mise à l&#39;essai de PTER et pT-Rex DEST30 Vecteurs Exprimez-ment shRNA ou des ADNc, respectivement <ol><li> Générer pter plasmide avec inserts shRNA comme décrit 12. Construire pT-Rex DEST30 vecteur (12301-016, Invitrogen) contenant l&#39;ADNc d&#39;intérêt en utilisant la technologie de passerelle (Invitrogen). Dans le cas d&#39;expression d&#39;ADNc, plus de un pour l&#39;ADNc sera ultérieurement faciliter la détection de la protéine exprimée de manière exogène. </li><li> Transfecter de manière transitoire la ligne de mire des parents cellule avec PTER ou pT-Rex DEST30 plasmides shRNA (exprimant soit ou ADNc d&#39;intérêt) en utilisant le réactif de transfection de choix. Pour le test de plasmides d&#39;expression shRNA, assurer l&#39;efficacité de transfection élevées peuvent être obtenues. </li><li> Récolte des cellules transfectées et le processus d&#39;immunoblot en utilisant les anticorps appropriés, s&#39;attendant à détecter un épuisement ou la surexpression de votre gène d&#39;intérêt. </li></ol> 4. Génération de lignées cellulaires stables avec inductible par la tétracycline (Tet-on) Expression de shRNA ou d&#39;ADNc à l&#39;aide PTER ou pT-Rex DEST30 Vecteurs </p&gt; <ol><li> Au jour 1, semences 1x10 6 cellules de la «meilleure» TetR exprimant clone par plaque de 10 cm en utilisant votre milieu de croissance standard complétée par la tétracycline certifié exempt de sérum (par exemple pour FBS chez Invitrogen, 16000-014). Une plaque de semence pour la transfection avec pter (ou pT-Rex DEST30), et une plaque en tant que témoin négatif pour la double sélection. Assurez-vous d&#39;utiliser le moins possible le passage. </li><li> Le jour 2, transfecter une plaque avec 2 ug de PTER (ou pT-Rex DEST30) en utilisant Fugene 6. Ne transfecter la seconde plaque. </li><li> Au jour 3, ajouter du milieu de croissance standard contenant 5 pg / ml blasticidine et 500 pg / ml de zéocine (ou 1 mg / ml de G418). </li><li> Au jour 4, diviser les cellules à 1/5, 1/25, 1/50 et 1/100 en utilisant des plaques de 10 cm et milieu de croissance standard contenant 5 ug / ml blasticidine et 500 pg / ml de zéocine (ou 1 mg / ml G418). Préparer deux plaques à l&#39;étape de dilution. </li><li> Vérifiez les cellules quotidien, faire en sorte que dans la première semaine toutes les cellules sur les plaques non transfectées sont morts.Changer le milieu de croissance standard contenant blasticidine et la zéocine (ou G418) tous les 3-4 jours. </li><li> Après 2-3 semaines, blasticidine / zéocine (ou blasticidin/G418) double colonies résistantes devraient commencer à apparaître. Sélectionner des plaques contenant de 5 à 50 colonies de choisir des colonies isolées. </li><li> Lorsque les colonies ont atteint un diamètre d&#39;environ 5 mm (ou plus), utiliser des cylindres de clonage pour ramasser des colonies isolées. Isoler au moins 24 clones individuels. Transférer chaque clone dans un puits séparé d&#39;une plaque de 24 puits de culture de tissu. </li><li> Clones culture dans du milieu contenant des concentrations de maintenance de blasticidine (5 ug / ml) et la zéocine (250 pg / ml) [ou G418 (0,5 mg / ml)]. Lorsque confluentes, diviser les cellules de chaque puits en un seul puits d&#39;une plaque à 6 puits de culture de tissu. </li><li> Pour chaque clone à tester, diviser un confluent puits d&#39;une plaque à 6 puits dans trois puits individuels d&#39;une plaque à 6 puits. Lorsque confluentes, de geler les cellules d&#39;un puits. Utilisez les deux puits restants pour tester la tétracyclinee-expression inductible. Ajouter tétracycline à une concentration de 1 pg / ml à un puits, tout en laissant la tétracycline deuxième puits libre. </li><li> Après 24 à 96 h d&#39;incubation avec des cellules de tétracycline, la récolte et le processus d&#39;immunoblot en utilisant des anticorps appropriés. Réduction des temps d&#39;incubation tétracyclines sont recommandés lors du dépistage de l&#39;induction de l&#39;expression d&#39;ADNc, alors que des traitements plus longs tétracycline sera nécessaire pour déterminer shRNA médiée par l&#39;épuisement des protéines endogènes. </li><li> Sélectionnez au moins deux clones avec l&#39;épuisement désiré / surexpression et développer chaque culture. Geler les stocks de chaque clone prometteur dès que possible. En grandissant Tet-on clones pour des expériences assurez-vous toujours d&#39;utiliser des milieux supplémentés avec de la tétracycline sans sérum et les antibiotiques de sélection à des concentrations respectives de maintenance. </li></ol>

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<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous croyons que Tet-sur les systèmes facilitera grandement l&#39;analyse de la fonction des gènes, en particulier dans des systèmes cellulaires qui sont difficiles à manipuler et / ou lorsque le gène manipulé est essentielle à la survie cellulaire. En outre, la capacité de contrôler l&#39;expression des gènes très spécifiques par Tet-sur les systèmes offre la possibilité d&#39;étudier la fonction des gènes à des stades différents (par exemple lors de la progression du cycle cellulaire ou des processus de différenciatio...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Sérum foetal bovin (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Testé sans Tet </td></tr><tr><td> Blasticidine </td><td> Invivogen </td><td> ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zéocine </td><td> Invivogen </td><td> ant-zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Laboratoires AAP </td><td> P31-011 </td><td> 100 mg / ml dans les milieux </td></tr><tr><td> anti-TET02 </td><td> Mobitec GmbH </td><td> TET02 </td><td> Utilisez à 1/1000-1/2000 de la BM </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> pT-Rex DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Tétracycline </td><td> Sigma </td><td> 87128 </td><td> 2 mg / ml dans de l&#39;éthanol </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td> 2 mg / ml dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Cylindres de clonage </td><td> Bellco Glass Inc </td><td> 2090-00808 </td><td> réutilisables </td></tr></tbody></table>

génération de lignées stables de cellules humaines avec inductible par la tétracycline (tet-on) shrna ou expression d&#39;adnc

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Une approche majeure dans le domaine de la biologie cellulaire des mammifères est la manipulation de l&#39;expression de gènes d&#39;intérêt dans des lignées cellulaires sélectionnées, dans le but de révéler un ou plusieurs de la fonction du gène (s) en utilisant la surexpression transitoire / stable ou knockdown du gène d&#39;intérêt. Malheureusement, pour diverses enquêtes de cellules biologiques de cette approche ne convient pas lorsque les manipulations de résultat de l&#39;expression de gènes dans des cellules de croissance / prolifération de défauts ou de différenciation cellulaire indésirable. Par conséquent, les chercheurs ont adapté la protéine répresseur tétracycline (TetR), tiré de l&#39;E. résistance à la tétracycline coli opéron 1, de générer très efficaces et serré systèmes réglementaires pour exprimer des ADNc dans des cellules de mammifères 2,3. En bref, TetR a été modifié pour l&#39;initiation ou l&#39;autre bloc (1) de la transcription en se liant à l&#39;opérateur Tet-(A) dans la région du promoteur lors de l&#39;addition de tétracycline (Tet-off appelé système) ou (2) se lient à la TO en til absence de tétracycline (Tet appelée sur-système) (figure 1). Compte tenu de l&#39;inconvénient que le système Tet-off nécessite la présence continue de la tétracycline (qui a une demi-vie d&#39;environ 24 heures dans un milieu de culture des tissus cellulaires) Tet-le système a été plus largement optimisée, ce qui entraîne le développement des très serré et des systèmes de vecteurs efficaces pour l&#39;expression d&#39;ADNc utilisée ici. Peu de temps après l&#39;établissement de l&#39;interférence ARN (ARNi) pour abattre des gènes dans les cellules de mammifères 4, des vecteurs exprimant des ARN en épingle à cheveux court (shRNA) ont été décrits qui fonctionnent très similaire à siRNA 5-11. Cependant, ces approches knockdown shRNA médiées par la même restriction que les stratégies conventionnelles huitièmes de finale, puisque l&#39;épuisement stable n&#39;est pas possible lorsque les gènes cibles sont essentiels à la survie cellulaire. Pour contourner cette limitation, van de Wetering et al. 12 a modifié le shRNA vecteur d&#39;expression pSUPER 5 </su&gt; p en insérant un A dans la région promotrice, ce qui leur a permis de générer des lignées cellulaires stables avec inductible par la tétracycline épuisement de leurs gènes cibles d&#39;intérêt. Ici, nous décrivons une méthode pour générer efficacement humaine stable Tet-sur lignées cellulaires qui conduisent surexpression inductible de manière fiable l&#39;un ou l&#39;épuisement du gène d&#39;intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons réussi à générer Tet-sur des lignées cellulaires a considérablement facilité l&#39;analyse de la cascade de MST / hMOB / NDR de 13,14 centrosome et l&#39;apoptose de signalisation 15,16. Dans ce rapport, nous décrivons nos vecteurs de choix, en plus de décrire les deux étapes consécutives de manipulation qui sont nécessaires pour générer efficacement des humains Tet-sur des lignées cellulaires (figure 2). Par ailleurs, outre décrivant un protocole pour la génération de l&#39;homme Tet-sur des lignées cellulaires, nous allons discuter des aspects critiques concernant les procédures techniques et la caractérisation des cellules Tet-on.

Un exemple pour la caractérisation initiale de l&#39;EPR-1 lignées cellulaires exprimant de façon stable TetR est illustré à la figure 4. Notez que tous les clones EPR-1 expriment différents niveaux de TetR (comparer les pistes 2 et 5), tandis que la lignée cellulaire parentale (qui sert de témoin négatif) n&#39;exprime pas la protéine exogène TetR (figure 4, ligne 1). Cette variation de l&#39;expression TetR entre RPE-1-Tet sur des clones de cellules est prévu, puisque l&#39;expression...

Un moyen simple et rapide pour générer des lignées de cellules humaines avec inductible et réversible surexpression d&#39;ADNc ou shRNA médiée par le knock-down du gène d&#39;intérêt. Cette méthode permet aux chercheurs de lignées cellulaires de manière fiable et reproductible de manipuler très difficiles à modifier, par des méthodes classiques de transfection transitoire ou knock-down / KO stratégies.

Génération de lignées stables de cellules humaines avec inductible par la tétracycline (Tet-on) shRNA ou expression d&#39;ADNc

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des lignées cellulaires humaines stables exprimant de façon inductible par la tétracycline un ARNsh ou un ADNc. Transfectez d'abord les cellules cibles avec le plasmide d'expression tétar et sélectionnez les cellules résistantes au blaster. Ensuite, isolez des colonies individuelles et analysez-les afin d'identifier les cellules exprimant de façon stable la protéine répresseur Tet.Ensuite, transfectez le meilleur clone exprimant teta avec des plasmides conçus pour moduler l'expression du gène cible sous le contrôle de l'élément régulateur de la culture Tet. Après la double sélection des cellules transfectées, isolez des colonies individuelles et sélectionnez les clones Teton souhaités par immunotransfert. En fin de compte, les clones Teton obtenus peuvent être utilisés pour examiner l'impact de cibles spécifiques sur certains paramètres biologiques.La procédure sera démontrée par un postdoctorant en laboratoire. Marty Gomez Martinez génère un vecteur permettant l'expression du répresseur Tet et du gène de résistance à la Blaine à partir du même promoteur CMV. Dans deux plaques de culture tissulaire de 10 centimètres, ensemencez une fois à une densité de six cellules par centre, en milieu de croissance standard : une plaque pour la transfection avec un plasmide d'expression Tatar, l'autre servant de témoin négatif pour la sélection à la Blaine. Le jour suivant, transfectez une plaque avec deux microgrammes de plasmide d'expression TTA en utilisant FU Gene six.Suivant les instructions du fabricant, incuber ensuite la culture toute la nuit à côté des deux plaques. Ajouter, après 24 heures, le milieu de croissance standard contenant la concentration optimale de blastine pour la lignée cellulaire expérimentale utilisée, récolter les cellules, puis étiqueter des plaques de 10 centimètres pour une dilution en série et procéder au semis en double de la dilution en série en utilisant un milieu de croissance standard contenant cinq microgrammes par millilitre de blastine, en veillant à étiqueter correctement les plaques contenant les cellules non résectées ou les cellules transfectées. Surveiller les cellules, en notant particulièrement que toutes les cellules présentes sur les plaques non résectées sont mortes durant la première semaine.Changer le milieu de sélection tous les deux à trois jours après une à deux semaines, lorsque les colonies résistantes au blaster soin apparaissent. Sélectionner les boîtes contenant entre cinq et 50 colonies afin de s'assurer que des colonies individuelles puissent être prélevées lorsque celles-ci auront atteint un diamètre d'environ cinq millimètres. Isoler au moins 12 clones indépendants à l'aide de cylindres de clonage pour prélever des colonies uniques.Transférez chaque clone dans un puits distinct d'une plaque de culture de 24 puits afin d'obtenir une confluence cellulaire. Récoltez et transférez les cellules de chaque colonie dans des puits individuels d'une plaque de culture tissulaire à six puits. Poursuivez la culture des clones dans un milieu de sélection lorsque les cultures sont confluentes.Diviser les cellules de chaque puits en deux puits simples d'une plaque de culture tissulaire à six puits. Pour chaque clone à tester, congeler un puits de cellules confluentes. Récolter les cellules du deuxième puits. Pour l'évaluation de l'expression protéique du tatar.Réalisez un immunotransfert sur les clones en utilisant un lysat de la lignée cellulaire parentale comme témoin négatif pour détecter la protéine tatar. Utilisez l'anticorps monoclonal de souris anti-Tet zero two. Passez ensuite à l'expansion des trois clones présentant la plus forte expression de testar.Conservez gratuitement les stocks de chaque clone prometteur dès que possible. Les cellules clonales sont désormais prêtes à être analysées pour vos paramètres moléculaires et cellulaires d'intérêt. En comparant les lignées cellulaires parentales avec les clones exprimant le tatar, sélectionnez le meilleur clone présentant l'expression la plus élevée de tatar et n'affichant aucune altération des paramètres moléculaires et biologiques cellulaires d'intérêt.Générez des plasmides PTER avec des inserts HRNA d'intérêt. Construisez également un vecteur PT REX desk 30 contenant le CDNA d'intérêt en utilisant la technologie Gateway. Transfectez de façon transitoire la lignée cellulaire cible parentale avec des plasmides PTER ou P T-Rex S 30.À l’aide des réactifs de transfection choisis, récolter ensuite les cellules transfectées et évaluer l’expression du gène cible par immunomarquage. Au jour un, semer deux plaques du meilleur clone exprimant le tétar en utilisant un milieu de croissance standard supplémenté de sérum certifié sans tétracycline, et cultiver pendant la nuit.Le lendemain, transfectez une seule plaque avec deux microgrammes de plasmide d'expression A-S-H-R-N-A ou ADNc en utilisant FU gene six. Au troisième jour, ajoutez le milieu de croissance standard contenant soit cinq microgrammes par millilitre de blastine et 500 microgrammes par millilitre d'éosine, soit de la blastine et de la G quatre 18. Puis, au quatrième jour, fractionnez les cellules afin de créer des plaques dupliquées de dilutions en utilisant le milieu de croissance standard pour une sélection double.Vérifiez quotidiennement les cellules pour observer la réponse à la mort cellulaire induite par le traitement antibiotique et renouvelez le milieu toutes les trois à quatre journées. Après deux à trois semaines, lorsque des colonies résistantes doubles blaster aside dans le zéin ou blaster aside dans le G quatre 18 commencent à apparaître.Sélectionnez les plaques contenant de cinq à 50 colonies afin de prélever des colonies isolées et de les cultiver jusqu’à ce qu’elles atteignent un diamètre d’environ cinq millimètres ou plus. À l’aide de cylindres de clonage, prélèvez et transférez des colonies individuelles dans des puits distincts d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Cultivez les clones dans un milieu contenant des concentrations d’entretien de cinq microgrammes par millilitre de blaster, soin et 50 microgrammes par millilitre.Éosine ou soin blaster et G quatre 18. Lorsque les cellules sont confluentes, diviser les cellules de chaque puits en un seul puits d'une plaque de culture tissulaire à six puits. Lorsque les cellules sont confluentes, diviser les cellules en trois puits d'une plaque à six puits pour les cultiver jusqu'à une confluence de 100 %.Congelez les cellules provenant d'un puits pour tester l'expression inductible, ajoutez un microgramme par millilitre de tétracycline à un puits tout en laissant le second puits de cellules sans tétracycline. Incubez sans tétracycline pendant 24 à 96 heures, en utilisant des durées plus courtes pour le criblage de l'induction de l'expression d'ADNc et des durées plus longues pour déterminer l'épuisement médié par ARNsh des protéines endogènes. Ensuite, récoltez les cellules et traitez-les par immunobuvardage en utilisant les anticorps appropriés.Sélectionnez au moins deux clones présentant la diminution ou la surexpression souhaitée et développez chaque culture. N'oubliez pas de préparer des stocks des chaque clone prometteur dès que possible. Cette caractérisation initiale d'une lignée cellulaire d'épithélium rétinien humain pour l'expression stable de tatar montre que tous les clones RPE un expriment des niveaux variables de tatar.Comme prévu, la lignée cellulaire parentale RPE un n'exprime pas la protéine tatar exogène. La variation de l'expression de Tet R parmi les clones cellulaires RPE un Teton reflète les sites d'intégration du plasmide. Cette expérience caractérise des clones cellulaires stables RPE un Teton exprimant des ARN dirigés contre la kinase MST trois ; trois clones cellulaires ont été choisis pour une analyse ultérieure.Après avoir visionné cette vidéo, vous avez une bonne compréhension de la manière de générer des lignées cellulaires humaines stables avec une expression non régulée de votre ARN ou ADNc d'intérêt.

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Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

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