L'activation des neurones somatosensoriels optogenetic poisson zèbre en utilisant Chef-tdTomato

L’objectif global de cette procédure est d’activer des neurones somatosensoriels uniques chez les larves de poisson-zèbre. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord un câble optique et de le connecter au laser bleu A-D-P-S-S. La deuxième étape consiste à injecter le transgène dans des embryons à un ou deux stades cellulaires.

Ensuite, dépister les embryons gras exprimant C-H-E-F-T-D dans les neurones somatosensoriels et les monter dans les neurones. La dernière étape consiste à délivrer une courte impulsion de lumière bleue pour l’activation d’un seul neurone et à enregistrer le comportement résultant. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes utilisant la racine de canal de la deuxième option est que cette approche pourrait être utilisée pour susciter des réponses comportementales à partir de neurones uniques activés jusqu’à au moins quatre jours après l’hospitalisation.

Bien que cette méthode soit utilisée pour donner un aperçu de la fonction de neurones somatosensoriels spécifiques chez les larves de poisson-zèbre. Cette approche pourrait également être adaptée pour étudier les comportements induits par toute population neuronale de poisson-zèbre, comme les neurones internes ou les motoneurones. Cette approche génétique pourrait être utilisée pour activer des neurones spécifiques in vivo, caractériser le développement fonctionnel, évaluer les effets des mutations ou du blocage phénoménologique de protéines spécifiques sur le comportement et cartographier les réseaux neuronaux en aval conduisant à des réponses comportementales distinctes.

Pour commencer cette procédure, créez une unité de stockage pour le câble optique en faisant fondre le col effilé d’un verre. Pipette à pâtes sur une pince et un brûleur pour faire un angle de 150 degrés. Ensuite, à l’aide d’un coupe-fil ou d’une lame de rasoir, coupez soigneusement le câble optique en deux morceaux.

Chaque pièce doit avoir une extrémité exposée et une extrémité avec un adaptateur PC FC. Ensuite, dénudez le câble optique jusqu’au revêtement en retirant la gaine de fibre, en renforçant les fibres et en recouvrant 5,0 centimètres de l’extrémité coupée du câble. Ensuite, insérez le câble optique dans la pipette à pâtes préparée.

Assurez-vous que le câble peut facilement entrer et sortir de la pointe de la pipette à l’aide d’un coupe-verre diamanté ou d’une pince à pointe fine. Entaillez la fibre de verre et cassez l’extrémité pour créer une coupe nette à l’extrémité de la fibre. Ensuite, rétractez le câble optique dans la pipette à pâtes.

Positionnez ensuite le câble optique dans la pipette à pâtes à l’aide d’un micromanipulateur sous le microscope : COATE 24 à 48 embryons HPF à l’aide d’une pince ; ensuite, anesthésie les larves à l’aide de 0,02 % de trica à l’aide d’un microscope à dissection fluorescente. Identifiez les larves avec l’expression des neurones de Ron Beard ou des neurones trijumeaux Les embryons avec une expression clairsemée dans des cellules facilement identifiables sont optimaux, mais les neurones individuels seront ciblés pour l’activation avec un câble à fibre optique, de sorte qu’une large gamme de densité d’expression est acceptable. Transférez les larves dans un nouveau plat avec de l’eau d’embryon PTU bleu PTU.

Conservez les embryons à 28,5 degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à l’étape expérimentale souhaitée. Dans cette section, préparez de l’eau maltase à faible teneur en maltase et de l’eau distillée deux fois et conservez-la dans un bloc de chaleur à 42 degrés Celsius pour éviter qu’elle ne se solidifie. À l’aide d’une pipette à pâtes en verre, transférez l’une des larves pré-criblées dans un tube d’agarose à faible point de fusion à 1,5 % avec le moins d’eau bleue de l’embryon possible.

Transférez ensuite la larve dans une goutte d’agarose sur une petite boîte de Pétri. Sous un microscope à dissection, positionnez la lave face dorsale vers le haut lorsque l’aros est solidifié. Utilisez une lame de rasoir fine pour couper les aros des deux côtés de la lave.

Remplissez la zone entourant l’aros avec de l’eau bleue embryonnaire. Ensuite, faites deux coupes diagonales des deux côtés du jaune, en faisant attention de ne pas entailler la lave. Ensuite, retirez l’agrow du tronc et de la queue de la lave.

Montez maintenant la caméra haute vitesse sur la lunette de dissection et connectez la caméra à l’ordinateur. Allumez ensuite l’ordinateur et la caméra haute vitesse. Ouvrez le logiciel d’imagerie vidéo et ajustez les paramètres de l’appareil photo.

Ensuite, connectez le câble optique, le laser et le stimulateur ensemble. Allumez ensuite le stimulateur et réglez-le sur un maximum de cinq volts et la durée d’impulsion de cinq millisecondes. Allumez ensuite le laser.

Ensuite, utilisez le microscope de dissection fluorescent pour positionner l’extrémité du câble optique près d’un corps cellulaire neuronal avec une expression de tomate C-H-E-F-T-D. Délivrez une impulsion de lumière bleue pour activer le neurone sensoriel. Enregistrez ensuite les réponses à l’aide d’une caméra à haute vitesse.

Réglez à 500 ou 1000 images par seconde, et répétez l’expérience avec au moins une minute entre les activations pour éviter l’accoutumance, pour libérer la partie préalable de lave, l’Aris avec des pinces, et faites attention à ne pas iner l’animal. Transférez-le ensuite dans de l’eau d’embryon bleu frais. On peut laisser les animaux se développer davantage et la procédure peut être répétée à des stades plus anciens.

L’embryon pourrait également être remonté pour une imagerie confocale à haute résolution de la cellule activée afin de corréler le comportement avec la structure cellulaire. La lave de poisson-zèbre schématisée ici est partiellement montée dans de l’Aris à faible teneur en malt à 1,5 %, représentée par les lignes pointillées entourant sa partie rostrale. Un neurone trijumeau et un neurone de la barbe du Rohan sont représentés par des cellules buccales rouges délimitées par des lignes pointillées sur l’illustration.

Voici une vidéo montrant que l’activation d’un seul neurone de barbe de Rohan exprimant C-H-E-F-T-D dans une lave d’environ 35 HPF provoque une réponse comportementale. Ce film montre l’activation des neurones de la barbe de Rohan exprimant C-H-E-F-T-D dans une lave de 60 HPF, et ce film montre l’activation de l’expression de la tomate C-H-E-F-T-D neurones de la barbe de Rohan dans une lave à quatre DPF Une fois maîtrisée. Cette approche génique peut être réalisée en moins d’une heure.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’activer les neurones individuels et les larves de poissons Balance à différents moments. N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être extrêmement dangereux et que des précautions de sécurité appropriées doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.