Name: Naïve cellules souches adultes Isolation de cultures de fibroblastes humains primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules souches naïves multipotentes (SKP) à partir de cultures primaires de fibroblastes humains. Cette méthode permet d'obtenir des précurseurs cutanés exprimant nestine, OCT4 et Nanog pour la recherche en médecine régénérative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par la Fondation Alexander von Humboldt (5090371), le Centre Kühne Christine de recherche sur les allergies et l&#39;éducation (CK-CARE), et le Bayerischen Staatsministerium (pour KD).

1. Isolation SKP partir des cultures de fibroblastes primaires <ol><li> des cultures de fibroblastes ou l&#39;autre des banques de cellules ou directement obtenu à partir de biopsies de peau sont maintenues en culture en croissance des fibroblastes du milieu DMEM contenant 15% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, 10 mg / ml de pénicilline et 10 mg / ml de streptomycine. </li></ol> Fibroblastes humains GMO3349C et GMO8398A ont été obtenus à partir de l&#39;Institut Coriell pour la recherche médicale (Camden, New Jersey) et ont été utilisés dans cette étude. <ol start="2"><li> Cultures de doublements de population (PPD) 20 à 35 ont été utilisés pour les cultures SKP à une confluence de 80%. Une boîte de 10 cm de culture tissulaire (BD Falcon) contient environ 1,5.10 6 cellules. </li><li> Laver les cellules avec du PBS et incuber avec 2 ml de solution de trypsine (0,25%, Invitrogen) pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Recueillir les cellules à partir de la plaque avec 5 ml de PBS et transférer la suspension de cellules dans un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Incuber les cellules à 4 ° C pendant 24 heures. </li><li> Préparer le milieu de croissance SKP composé de DMEM-F12, 3:1 (V / V) et 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml d&#39;EGF (BD Biosciences), B27 sérique supplément gratuit de 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) et 25 um / ml gentamicine (Invitrogen). </li><li> Pellet les cellules à 1200 rpm pendant 5 min et remettre le culot cellulaire directement dans le milieu de croissance SKP 4 ml. Transférer la suspension cellulaire à un cm2 flacon de culture de tissus 25 (BD Falcon). </li><li> Incuber le ballon à 37 ° C et à surveiller la culture pour la formation de la sphère par jour pendant 3 à 4 semaines. </li></ol> 2. Sphère Conditions de culture <ol><li> les cellules de la culture dans un flacon de 25 cm2 (BD Falcon) à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Agiter le flacon vigoureusement tous les jours pour éviter les cellules d&#39;adhérer au fond du flacon. Si nécessaire, une pipette de haut en bas avec un 2 ml pipette stérile pour détacher les cellules adhérentes et transférer la culture dans un nouveau flacon. </li><li> Premières sphères commencent à construire dans les 3 to 4 jours. </li><li> Soit sphères sédiment au fond du flacon et le changement de la moitié du milieu tous les 3 jours. Pour conserver la même concentration finale de facteurs de croissance les facteurs de croissance ajouter 2X au milieu de croissance de SKP fraîchement préparée. </li><li> Maintenez le volume constant maximum de 4 ml. </li><li> Quand sphères atteignent une taille d&#39;environ 200 mm, ils doivent être repiquées en brisant les sphères de petite taille par vigoureuse pipetage de haut en bas avec une pipette de 2 ml. </li><li> La culture est divisé en deux flacons de 25 cm2 (BD Falcon) et des sphères cultures sont alimentation comme décrit dans l&#39;étape 2.4). </li><li> Sphères sont collectées pour des marqueurs de cellules souches dépistage par jour 16 à 21. </li></ol> La procédure de 2.6) et 2.7) décrivent la propagation des sphères à (1) permet de nutriments et de facteurs de croissance dans du milieu compris SKP d&#39;accéder à toutes les cellules au sein de chaque sphère et (2) pour développer la culture de la sphère SKP avant utilisation. Typiquement cultures Sphère sous nos cuconditions de LTURE maintenir la capacité de croissance sur une période de trois mois et sont repiquées entre 3 à 4 fois. 3. Immunocytochemistry de cellules souches Marqueurs <ol><li> cultures de Sphère sont récoltées dans du PBS par jour 16 à 21. Les cultures sont culottés à 1000 rpm pendant 5 min. </li><li> Sphères sont remises en suspension dans un petit volume de PBS. </li><li> Dessinez deux cercles avec un stylo DAKO d&#39;environ 0,5 m de diamètre sur des lames de microscope (marque Fisher). </li><li> Ajouter 50 ul de suspension de la sphère dans les cercles. </li><li> Voir par microscopie optique la présence de sphères dans chaque goutte. </li><li> Que les gouttes sec sous le capot. </li><li> Soit geler les diapositives à -80 ° C ou procéder avec le protocole de coloration par immunofluorescence. </li><li> Par immunofluorescence, fixer les lames avec du méthanol pré-refroidi (100%) à -20 ° C pendant 10 min. </li><li> Laver les lames avec PBS. </li><li> Bloquer les diapositives avec PBS/10% de sérum de veau fœtal / 0,02% de Triton X100pendant au moins 1 heure. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire (par exemple, anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, les anticorps anti-Nanog, tableau 3) dilué dans du tampon de blocage: PBS/10% de FBS pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver 3 fois avec le tampon de blocage et incuber avec l&#39;anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Laver 3 fois avec le tampon de blocage et 3 fois avec PBS. </li><li> Montage diapositives avec montage moyen Vectashield (Vector Inc.). </li><li> Analyser des échantillons pour l&#39;expression de marqueurs de cellules souches par immunofluorescence. </li></ol> 4. Analyse PCR en temps réel des niveaux d&#39;expression de marqueurs de cellules souches <ol><li> Prenez environ 2-3 cultures Sphère ml de jour de 18 à 21. </li><li> Pellet les sphères à 1200 rpm pendant 5 min et aspirer tout moyen. </li><li> Isoler l&#39;ARN à partir de sphères en utilisant le Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). </li><li> Évaluer l&#39;ARN pureté par spectrométrie et gel d&#39;agarose. &lt;/ Li&gt; <li> Synthétiser l&#39;ADNc (Omniscript de la transcriptase inverse (Qiagen)) en utilisant l&#39;ARN cellulaire total comme matrice. </li><li> Valider les marqueurs de cellules souches par Realtime-PCR utilisant des amorces pour les marqueurs des cellules souches (voir tableau 1) en une puissance SYBR Green Mastermix PCR (Applied Biosystems) avec une concentration de 375 nM de chaque amorce et 50 ng de matrice dans un 20 pi volume de réaction. GAPDH est utilisé comme contrôle endogène. </li><li> Pour l&#39;amplification utilise une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 2,5 min suivie de 40 cycles à 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 20 s. </li><li> Analyser la course avec les 2 (ΔΔCt) méthode 8. </li></ol> 5. Différenciation Réalisé dans les cellules musculaires lisses <ol><li> Sphères du jour 21 à 26 ont été étalées en 6 boîtes de culture puits (BD Falcon) en milieu SKP. </li><li> Les cellules ont été autorisés à adhérer et à dépasser des sphères en milieu SKP pendant 72 heures. </li><li> Les cellules musculaires lisses (CML) differentiation commencé initiée par remplacé le milieu par un milieu de différenciation SMC consistant en haut glucose milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Invitrogen) contenant 5% de SVF, de 5 ng / ml de PDGF-BB (Invitrogen), et de 2,5 ng / ml de TGF-b1 (Invitrogen) . </li><li> Le milieu a été changé tous les 3 jours avec un milieu de différenciation SMC fraîchement préparé pour une période de 3 à 4 semaines dans les cultures. </li><li> Dépistage des marqueurs SMC a été réalisée après 3 à 4 semaines par immunohistochimie. </li><li> Les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 min. </li><li> Les cellules ont été perméabilisées avec du PBS contenant 0,3% de Triton X-100 pendant 30 min. </li><li> Les cellules ont été incubées avec des anticorps contre αSMA (MO851, Dako, 1:100), ou calponine (M3556, Dako, 1:100) pendant 1 heure à température ambiante et traité comme décrit dans 3.12) à 3.15). </li></ol>

<ol><li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849(2003).</li>
<li>Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518(2006).</li>
<li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells%3A+turning+over+new+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445(2007).</li>
<li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+skin-derived+precursors%3A+from+biology+to+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Vurr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522(2009).</li>
<li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778(2001).</li>
<li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082(2004).</li>
<li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Open%22%5BJournal%5D)">Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402(2001).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803(2006).</li>
<li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727(2005).</li>
<li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32(2006).</li>
<li>Hill, lK. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246(2010).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

En utilisant la méthode décrite ici, les cellules souches dermiques naïfs peuvent être isolés à partir de cultures de fibroblastes dermiques primaires. Grâce à cette approche, nous avons récemment signalé l&#39;isolement et la caractérisation des cellules souches adultes à partir de cultures de fibroblastes provenant de patients atteints d&#39;un syndrome génétique rare, Hutchinson-Gilford progeria syndrome 7. Comme le montrent ici les cellules marqueurs de cellules souches expriment précurseurs sont capables...

<table><tbody><tr><td>DMEM haute teneur en glucose</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>DMEM faible teneur en glucose</td><td>Invitrogen</td><td>21885-108</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td>Conc. final : 200 mM</td></tr><tr><td>Pénicilline/ Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Conc. final : 10 mg/ml /10 mg /ml</td></tr><tr><td>solution de trypsine (0,25 %)</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Mélange nutritif (jambon)</td><td>Invitrogen</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>BD Biosciences</td><td>4114-TC-01M</td><td>Concentration finale : 40 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>236-EG-200</td><td>Concentration finale : 20 ng/ml</td></tr><tr><td>PDGFBB</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0043</td><td>Concentration finale : 5 ng/ml</td></tr><tr><td>TGF-b1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9204</td><td>Final conc. : 2,5 ng/ml</td></tr><tr><td>25 cm2 flacon</td><td>Omnilab</td><td>FALC353109</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o CaMg</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage</td><td>Vector Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Minikit</td><td>Qiagen, Valence, CA</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript Transcriptase inverse</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td>Final conc. :1 mg/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques.</td></tr></tbody></table>

naïve cellules souches adultes isolation de cultures de fibroblastes humains primaires

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Au cours de la dernière décennie, plusieurs populations de cellules souches adultes ont été identifiés dans la peau humaine 1-4. L&#39;isolement des précurseurs dermiques adultes multipotentes a d&#39;abord été rapporté par Miller F. D laboratoire 5, 6. Ces premières études ont décrit une population de cellules précurseurs pluripotentes à partir de derme des mammifères adultes 5. Ces cellules - SKP appelés, pour les précurseurs dérivés de la peau - ont été isolés et sont passées de rongeurs et de la peau humaine et différenciées en neurones et deux descendants du mésoderme, y compris les types de cellules jamais trouvés dans la peau, comme les neurones 5. Des études immunocytochimiques sur SKPs culture ont révélé que les cellules expriment la vimentine et la nestine, une protéine de filament intermédiaire exprimé des précurseurs neuronaux et musculaires squelettiques, en plus de la fibronectine et des marqueurs de cellules souches multipotentes 6. Jusqu&#39;à présent, les cellules souches SKPs la population adulte ont été isolés à partir de biopsies de peau de mammifère fraîchement récoltées. ve_content &quot;&gt; Récemment, nous avons mis en place et a indiqué que la population de la peau des cellules précurseurs dérivées pourrait rester présente dans des cultures de fibroblastes primaires établies à partir de biopsies de la peau 7. L&#39;hypothèse selon laquelle un petit nombre de cellules souches somatiques pourraient résider dans des cultures de fibroblastes primaires de doublements de population au début était basées sur les observations suivantes: (1) SKPs et les cultures de fibroblastes primaires proviennent du derme, et donc un petit nombre de cellules SKP pourraient rester présente dans les cultures de fibroblastes dermiques primaires et (2) des cultures de fibroblastes primaires cultivées à partir de portions congelées qui ont été soumis à une température défavorable pendant le stockage ou le transfert contenait un petit nombre de cellules qui sont restées viables 7. Ces cellules rares étaient capables de développer et pourrait être repiquées plusieurs fois. Cette observation suggère qu&#39;un petit nombre de cellules avec une puissance de prolifération élevé et la résistance au stress étaient présents dans les cultures de fibroblastes humains 7. Nous avons profité de ces résultats pour établir un protocole pour l&#39;isolement rapide des cellules souches adultes à partir de cultures de fibroblastes primaires qui sont facilement disponibles à partir de banques de tissus à travers le monde (Figure 1). Cette méthode a une signification importante car elle permet d&#39;isoler des cellules précurseurs lorsque des échantillons de peau ne sont pas accessibles alors que les cultures de fibroblastes peuvent être disponibles à partir de banques de tissus, ainsi, ouvrir de nouvelles opportunités pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les maladies génétiques rares ainsi que les maladies de modélisation dans un Antenne.

Nous montrons qu&#39;une population de cellules qui augmentent de manière sélective pour générer des sphères SKP sous condition d&#39;une croissance maîtrisée, comprenant des EGF et FGF2 sont présents dans les cultures de fibroblastes dermiques primaires (Figure 1) Comme nous l&#39;indiquions récemment 7. des cultures de fibroblastes de PPD 15 à 25, qui correspondent généralement aux souches de fibroblastes primaires disponibles à partir de banques de cellules ont...

Nous rapportons une méthode pour isoler les cellules naïves multipotentes précurseurs dérivés de la peau (SKP) à partir de cultures de fibroblastes humains primaires. Nous montrons que ces SKPs issus de cultures de fibroblastes partagent des propriétés semblables des cellules souches à celles provenant directement de biopsies de peau humaine. Ces cellules expriment le marqueur de la crête neurale, nestine, en plus des marqueurs tels que OCT4 multipotentes et Nanog.

Naïve cellules souches adultes Isolation de cultures de fibroblastes humains primaires

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules précurseurs naïves multipotentes, dérivées de la peau, à partir de cultures primaires de fibroblastes humains. Tout d'abord, établir une culture primaire de fibroblastes et sélectionner les cellules précurseurs naïves dérivées de la peau en fonction de leur résistance à des conditions de stress telles que les variations de température et la privation de nutriments. Ensuite, cultiver les cellules afin de former des sphéroïdes dans des conditions de croissance contrôlées, puis poursuivre la croissance et l'expansion des cultures de sphéroïdes pendant plusieurs semaines, démontrant ainsi que ces cellules précurseurs partagent des propriétés similaires à celles des cellules souches adultes.En fin de compte, les cellules SKP peuvent être orientées vers une différenciation en cellules musculaires lisses. J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode en observant que, dans des OT congelés de structures primaires de fibroblastes soumises à des contraintes dues aux variations de température pendant le stockage ou le transport, quelques cellules conservaient la capacité de se développer. Ceci suggérait qu'un petit nombre

nave-adult-stem-cells-isolation-from-primary-human-fibroblast-cultures

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cet article décrit un protocole pour l'isolement et l'entretien des cultures de fibroblastes primaires de la peau et les tissus pulmonaires de rongeurs sauvages.

Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs

Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

Cet article présente un protocole robuste pour l'isolement et la culture des cellules souches neurales de crête des follicules pileux humains.

Isolement et culture des cellules souches neurales Crête des follicules pileux humains

Malgré les efforts en cours pour les cultures de transition vers d'alimentation sans conditions, la dérivation et la culture de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) restent largement tributaires des co-cultures avec mangeoires embryonnaires de souris (MEF). Ici, nous montrons une nouvelle méthodologie pour éliminer rapidement départs à partir de cultures de CSEh avant l'expérimentation.

Suppression des fibroblastes rapide de haute densité embryonnaires humaines cultures de cellules souches

Cette vidéo présente une technique permettant d’isoler des cellules progénitrices neurales induites (iNPCs) dérivées de fibroblastes humains adultes. Il décrit les étapes à suivre pour isoler les colonies d’iNPC et les cultiver dans des puits à plaques multipuits recouverts de laminine en présence de milieux de culture appropriés qui facilitent la prolifération et l’expansion continues de la population d’iNPC.

Isolement de colonies de cellules progénitrices neurales induites dérivées de fibroblastes humains adultes

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Le comportement des fibroblastes sous-tend un spectre d’entités cliniques, mais ils restent mal caractérisés, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. La recherche traditionnelle sur les fibroblastes repose sur la manipulation in vitro, masquant le comportement des fibroblastes in vivo. Nous décrivons un protocole basé sur FACS pour l’isolement des fibroblastes de peau de souris qui ne nécessite pas de culture cellulaire.

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

La dérivation robuste des cellules de la tige pluripotente induite par l'homme (hiPS) a été réalisée en utilisant une reprogrammation médiée par vecteur de virus Sendai non-intégrant (SeV) des fibroblastes dermiques. La maintenance cellulaire de hiPS et l'expansion clonale ont été réalisées en utilisant des conditions de culture sans xénon et chimiquement définies avec une matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) et un milieu E8 (E8) essentiel.

Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme à l&#39;aide de Laminin 521 Matrix

Ici, nous décrivons une méthode cliniquement pertinente, haute efficacité, exempte d’engraissement pour reprogrammer les fibroblastes humains primaires sur les cellules souches pluripotentes induites à l’aide de mis à jour l’ARNm codant pour des facteurs de reprogrammation et mature microARN-367/302 imite. Est également inclus les méthodes pour évaluer l’efficacité de reprogrammation, développez colonies clonales iPSC et confirmer l’expression du marqueur de pluripotence TRA-1-60.

Base d’ARN reprogrammation des fibroblastes humains de primaires sur les cellules souches pluripotentes induites

Nous présentons un protocole pour isoler les fibroblastes adultes primaires d'une manière facile, rapide et fiable, performable par les débutants (p. ex., les étudiants). La procédure combine la digestion des tissus enzymatiques et l'agitation mécanique avec des ondes ultrasoniques pour obtenir des fibroblastes primaires. Le protocole peut facilement être adapté à des exigences expérimentales spécifiques (p. ex., tissus humains).

Isolement du fibroblaste primaire adulte à ultrasons

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Découvrez l'isolation de cellules souches naïves multipotentes (SKP) à partir de cultures primaires de fibroblastes humains. Cette méthode permet d'obtenir des précurseurs cutanés exprimant nestine, OCT4 et Nanog pour la recherche en médecine régénérative.

Naïve cellules souches adultes Isolation de cultures de fibroblastes humains primaires

Explorer plus de vidéos