La centrifugeuse est un instrument utilisé dans presque tous les laboratoires de recherche à travers le monde. La centrifugation est un procédé par lequel une centrifugeuse est utilisée pour séparer les composants d’un mélange complexe. Par la rotation d’échantillons de laboratoire à des vitesses très importantes, les composants d’un mélange donné sont sujets à la force centrifuge, qui provoque la migration des particules plus dense loin de l’axe de rotation et les plus légères se déplacent vers celui-ci. Ces particules peuvent sédimenter au fond du tube dans ce qui est connu comme le pellet, et cet échantillon isolé, ou la solution restante, le supernageant, peuvent être traités ou analysés.
Cette vidéo est destinée à introduire un étudiant aux principes de base de la centrifugation, ainsi que les opérations de base de l’instrument. Par exemple la vitesse de centrifugation en tours pas minute, ou RPM, est mise en contraste avec la force centrifuge relative, ou RCF, comme une mesure de l’amplitude de la centrifugation, qui est indépendante de la taille du rotor. En plus des concepts et utilisations de base, les précautions de sécurité relatives à la centrifugation sont abordées, ainsi que les types de centrifugeuses et rotors de centrifugeuses qui existent.
La centrifugeuse est un instrument utilisé dans la plupart des laboratoires de recherche à travers le monde.
La centrifugation est un procédé via lequel une centrifugeuse est utilisée pour séparer les composants d’un mélange complexe.
En faisant tourner des échantillons de laboratoire à de très hautes vitesses, les composants d’un mélange donné subissent la force centrifuge, ce qui pousse les particules plus denses à migrer loin de l’axe de rotation et les particules plus légères à se diriger vers lui.
Ces particules peuvent sédimenter au fond du tube dans ce qui est appelé le pellet, et cet échantillon isolé, ou la solution restante – le supernageant, peuvent être par la suite traités ou analysés.
Le composant principal d’une centrifugeuse est le rotor, qui est la partie mobile qui tourne à des vitesses importantes.
Les rotors peuvent être fixés en place, ou une centrifugeuse peut utiliser plusieurs rotors fixés au sommet de la tige.
Généralement, le rotor de la centrifugeuse a un couvercle qui est visé étroitement vers le bas pour empêcher les échantillons de s’envoler.
La majorité des centrifugeuses possède une partie de réfrigération qui permet de contrôler la température interne lors de la rotation.
Elles comprennent aussi des boutons permettant d’entrer les paramètres pour chaque utilisation, ce qui peut inclure:
La durée de la centrifugation, la température, et l’amplitude de la rotation en termes de vitesse et de force relative.
La vitesse de rotation est mesurée en nombre de rotations par minute appelé RPM (revolutions per minute en anglais). RPM est une valeur délicate, parce-que ce n’est pas la vitesse de la centrifugeuse qui provoque la séparation des particules dans un mélange, mais la force qui s’applique sur ces particules.
La force agissant sur une particule est fonction du rayon du rotor de la centrifugeuse, et vu que des centrifugeuses différentes ont des tailles de rotor différentes, différentes forces peuvent être appliquées à la même vitesse, ou RPM.
La force de centrifugation peut aussi être quantifiée comme la force centrifuge relative ou RCF (Relative centrifugal force en anglais). La RCF est généralement présentée comme un multiple de l’accélération de la pesanteur de la terre.
La RCF est exprimée comme le produit du rayon du rotor par le carré de la vitesse angulaire divisé par l’accélération de la pesanteur terrestre.
La RCF peut être mise en relation avec le RPM par l’équation suivante, où r est le rayon de la centrifugeuse mesuré en centimètres.
L’utilisation de cette équation peut faire la différence entre une expérimentation ratée ou réussie, mais vous ne devez pas nécessairement réaliser ce calcul pour chaque nouvelle procédure. Les centrifugeuses sont souvent livrées avec des abaques qui peuvent aider à convertir la RCF en RPM assez facilement. Utilisez une règle pour connecter le rayon de la centrifugeuse et une valeur de RPM donnée, en vue d’obtenir la RCF.
Pour commencer à centrifuger vos échantillons considérez d’abord la température. Si vous utilisez une centrifugeuse réfrigérée, vous attendrez que la température interne de la machine atteigne la valeur désirée avant de commencer la rotation, ou, vous pouvez trouver d’autres moyens pour refroidir le rotor.
Immédiatement avant la rotation, vérifiez que tous les capuchons de vos tubes sont serrés et sécurisés.
Lorsque vous chargez les tubes, faites en sorte que chaque échantillon soit contrebalancé avec un autre échantillon directement en face de lui.
Si vous avez seulement un tube, placez alors un autre tube qui peut jouer le rôle de contrepoids.
Si vous avez trois tubes d’échantillons de même poids, vous pouvez les placer en triangle afin qu’ils soient équidistants l’un de l’autre.
Equilibrer les poids dans la centrifugeuse est critique. Les rotors de centrifugeuses atteignent des vitesses importantes et ont énormément d’énergie cinétique. Si l’ensemble n’est pas correctement équilibré, il peut être propulsé de sa place et faire de sérieux dégâts ou blessures.
Une fois que vous avez vérifié que le rotor et le couvercle sont sécurisés, commencer la centrifugation et attendez qu’elle atteigne la vitesse désirée. Si vous constatez un problème, appelez un membre expérimenté du laboratoire pour venir vous aider.
Lorsque votre centrifugation est finie, vous devriez être capable de voir votre spécimen biologique au fond du tube dans un pellet, qui est séparé du reste de la solution, ou supernageant.
Le supernageant peut être retiré soit par soutirage (un nom chic pour dire renverser), soit par aspiration (un nom chic pour dire succion pour le retirer).
L’échantillon purifié peut alors être remis en solution via un procédé appelé “remise en suspension”. La répétition de centrifugations, ou rotation des cellules, suivi par l’aspiration des cellules et leur resuspension dans un tampon, est souvent référencé comme “lavage des cellules”.
Maintenant que vous avez vu quelques bases de la centrifugation, il est temps de jeter un oeil à quelques uns des types de centrifugeuses et les procédures que vous pouvez effectuer avec elles.
Les centrifugeuses à rotor à angle fixe sont probablement le type le plus commun de cet instrument que vous rencontrerez dans un laboratoire. Beaucoup des centrifugeuses de dessus de table rentrent dans cette catégorie.
Ces centrifugeuses, dans lesquelles les tubes sont placés dans une position fixée et inclinée, sont utilisées dans des protocoles de centrifugation différentiels. Dans ces procédures, une série de centrifugations à différentes vitesses peut être utilisée pour purifier des échantillons biologiques comme des cellules animales. Typiquement, ces protocoles impliquent plusieurs étapes de lavage de cellules.
Contrairement aux rotors à angle fixe, les rotors à godets mobiles ont des portes-tubes souples qui permettent aux échantillons de tourner vers l’extérieur. Ces rotors sont avantageux dans des utilisations comme la centrifugation en gradient de densité, où les échantillons biologiques migrent en couches distinctes en gradient de milieu. Ce type de centrifugation est utile pour l’isolation rapide d’un type de cellule par rapport a un autre, ou pour l’isolation de cellules organite individuelles.
Enfin, l’ultracentrifugeuse est la grande soeur de toutes les centrifugeuses que vous trouverez dans le labo. Elle peut tourner à plus de 70 000 tours par minute, ce qui la rend bien adaptée pour l’isolation de petites particules, comme l’ADN ou les virus.
A cause des vitesses importantes de cette centrifugeuse une attention supplémentaire doit être appliquée, pour assurer que les charges soient correctement équilibrées, et que le rotor et le couvercle soient sécurisés.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la Centrifugation. Dans cette vidéo nous avons vus: ce qu’est une centrifugeuse et comment elle fonctionne, comment préparer et exécuter une centrifugation, quelques précautions de sécurité, et différentes utilisations de la centrifugation. Merci de nous avoir regardé et souvenez-vous d’équilibrer vos tubes!
The centrifuge is an instrument used in nearly every biomedical research lab across the globe.
Centrifugation is a process by which a centrifuge is used to separate components of a complex mixture.
By spinning laboratory samples at very high speeds, the components of a given mixture are subjected to centrifugal force, which causes more dense particles to migrate away from the axis of rotation and lighter ones to move toward it. These particles can sediment at the bottom of the tube into what’s known as a pellet, and this isolated specimen, or the remaining solution, the supernatant, can be further processed or analyzed.
The principle component of a centrifuge is the rotor, which is the moving part that spins at high speeds.
Rotors can be fixed in position, or a centrifuge can use multiple rotors fixed atop part called the spindle.
Usually, the centrifuge rotor will have a lid that is screwed down tightly to prevent samples from flying out.
Many centrifuges will have a refrigeration unit that allows the internal temperature to be controlled during the spin.
They also have knobs or buttons for inputting the parameters for each run, which can include the duration of the spin, the temperature, and the magnitude of the spin in terms of speed or relative force.
Spin speed is measured as RPM, or revolutions per minute. RPM is tricky value, because it’s not the speed of the centrifuge that causes particles to separate from a mixture, but the force acting on these particles.
The force acting on a particle is related to the radius of the centrifuge rotor, and since different centrifuges have different rotor sizes, different forces can be applied at the same speed, or RPM.
Centrifugation strength can also be quantified as Relative centrifugal force, or RCF. RCF is generally presented as a multiple of earth’s gravitational acceleration.
RCF is expressed as the product of the radius of the rotor and the square of the angular velocity divided by earth’s gravitational acceleration.
RCF can be related to RPM by the following equation, where r stands for the radius of the centrifuge measured in centimeters.
Using this equation can mean the difference between a failed or successful experiment, but you don’t have to apply this calculation for every new procedure. Centrifuges often come with nomograms that can help convert RCF to RPM quite easily. Use a ruler to connect the radius of the centrifuge and a given RPM value, in order to obtain RCF.
To begin spinning your samples consider temperature. If you are using a refrigerated centrifuge, then you will want the machines internal temperature to reach the desired value before starting the spin, or you can find other ways to cool the rotor.
Immediately before a spin ensure all of the caps on your tubes are tightened and secure.
When you loading your tubes, ensure that each sample is counterbalanced with another sample directly across from it.
If you’ve only got one tube, then make another tube that can act as a counterweight.
If you’ve got three tubes, you can arrange them in a triangle so they are equidistant from each other.
Balancing weights in a centrifuge is critical. Centrifuge rotors reach high speeds and have a lot of kinetic energy. If improperly balanced, the entire centrifuge unit can be propelled from its resting place and do serious damage.
Once you confirm that the rotor and lid are secure, start the centrifuge and hang around until it’s reached the desired speed. If you notice a problem call and experienced member of the lab to come help you.
When your centrifugation is complete, you should be able to see your biological specimen at the bottom of the tube in a pellet, which has separated from the rest of the solution, or supernatant.
The supernatant can be removed by either decanting it – a fancy name for pouring it off, or it can be aspirated – a fancy term for using suction to remove it.
The purified specimen can then be returned to a solution via a process called, resuspending. Repetitions of centrifuging, or spinning cells, followed by aspirating cells, and resuspending in buffer, is often referred to as, washing cells.
Now that you’ve seen some basics of centrifugation, its time to have a look at some of the types of centrifuges out there and the procedures you can carry out with them.
Fixed angle rotor centrifuges are probably the most common type of this instrument you’ll encounter in the lab. Many table top centrifuges fit in this category.
These centrifuges, in which tubes sit in a fixed and angled position, are used in differential centrifugation protocols. In these protocols, a series of centrifugations at different speeds can be used to purify biological specimens like animal cells. Typically, these protocols involve several cell washing steps.
In contrast to fixed angle rotors, swing rotors have flexible tube holders allow samples to rotate outward. These rotors are beneficial in applications like density gradient centrifugation, where biological samples migrate to distinct layers of gradient media. This type of centrifugation is useful for quickly isolating one cell type from another, or for isolating individual organelles.
Lastly, the ultracentrifuge is the big brother of all the centrifuges you’ll find in the lab. It can spin in excess of 70,000 rpm, which makes it well suited for the isolation of small particles, like DNA or viruses.
Because of the high speeds of this centrifuge extra care should be taken to ensure that the loads are properly balanced and that both the rotor and lid are secure.
You’ve just watched JoVE’s introduction to Centrifugation. In this video we reviewed: what a centrifuge is and how it works, how to operate and run a centrifuge, some safety precautions, and different applications of your centrifugation. Thanks for watching and remember to balance your tubes.
