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La centrifugeuse est un instrument utilisé dans presque tous les laboratoires de recherche à travers le monde. La centrifugation est un procédé par lequel une centrifugeuse est utilisée pour séparer les composants d’un mélange complexe. Par la rotation d’échantillons de laboratoire à des vitesses très importantes, les composants d’un mélange donné sont sujets à la force centrifuge, qui provoque la migration des particules plus dense loin de l’axe de rotation et les plus légères se déplacent vers celui-ci. Ces particules peuvent sédimenter au fond du tube dans ce qui est connu comme le pellet, et cet échantillon isolé, ou la solution restante, le supernageant, peuvent être traités ou analysés.
Cette vidéo est destinée à introduire un étudiant aux principes de base de la centrifugation, ainsi que les opérations de base de l’instrument. Par exemple la vitesse de centrifugation en tours pas minute, ou RPM, est mise en contraste avec la force centrifuge relative, ou RCF, comme une mesure de l’amplitude de la centrifugation, qui est indépendante de la taille du rotor. En plus des concepts et utilisations de base, les précautions de sécurité relatives à la centrifugation sont abordées, ainsi que les types de centrifugeuses et rotors de centrifugeuses qui existent.
La centrifugeuse est un instrument utilisé dans la plupart des laboratoires de recherche à travers le monde.
La centrifugation est un procédé via lequel une centrifugeuse est utilisée pour séparer les composants d’un mélange complexe.
En faisant tourner des échantillons de laboratoire à de très hautes vitesses, les composants d’un mélange donné subissent la force centrifuge, ce qui pousse les particules plus denses à migrer loin de l’axe de rotation et les particules plus légères à se diriger vers lui.
Ces particules peuvent sédimenter au fond du tube dans ce qui est appelé le pellet, et cet échantillon isolé, ou la solution restante - le supernageant, peuvent être par la suite traités ou analysés.
Le composant principal d’une centrifugeuse est le rotor, qui est la partie mobile qui tourne à des vitesses importantes.
Les rotors peuvent être fixés en place, ou une centrifugeuse peut utiliser plusieurs rotors fixés au sommet de la tige.
Généralement, le rotor de la centrifugeuse a un couvercle qui est visé étroitement vers le bas pour empêcher les échantillons de s’envoler.
La majorité des centrifugeuses possède une partie de réfrigération qui permet de contrôler la température interne lors de la rotation.
Elles comprennent aussi des boutons permettant d’entrer les paramètres pour chaque utilisation, ce qui peut inclure:
La durée de la centrifugation, la température, et l’amplitude de la rotation en termes de vitesse et de force relative.
La vitesse de rotation est mesurée en nombre de rotations par minute appelé RPM (revolutions per minute en anglais). RPM est une valeur délicate, parce-que ce n’est pas la vitesse de la centrifugeuse qui provoque la séparation des particules dans un mélange, mais la force qui s’applique sur ces particules.
La force agissant sur une particule est fonction du rayon du rotor de la centrifugeuse, et vu que des centrifugeuses différentes ont des tailles de rotor différentes, différentes forces peuvent être appliquées à la même vitesse, ou RPM.
La force de centrifugation peut aussi être quantifiée comme la force centrifuge relative ou RCF (Relative centrifugal force en anglais). La RCF est généralement présentée comme un multiple de l’accélération de la pesanteur de la terre.
La RCF est exprimée comme le produit du rayon du rotor par le carré de la vitesse angulaire divisé par l’accélération de la pesanteur terrestre.
La RCF peut être mise en relation avec le RPM par l’équation suivante, où r est le rayon de la centrifugeuse mesuré en centimètres.
L’utilisation de cette équation peut faire la différence entre une expérimentation ratée ou réussie, mais vous ne devez pas nécessairement réaliser ce calcul pour chaque nouvelle procédure. Les centrifugeuses sont souvent livrées avec des abaques qui peuvent aider à convertir la RCF en RPM assez facilement. Utilisez une règle pour connecter le rayon de la centrifugeuse et une valeur de RPM donnée, en vue d’obtenir la RCF.
Pour commencer à centrifuger vos échantillons considérez d’abord la température. Si vous utilisez une centrifugeuse réfrigérée, vous attendrez que la température interne de la machine atteigne la valeur désirée avant de commencer la rotation, ou, vous pouvez trouver d’autres moyens pour refroidir le rotor.
Immédiatement avant la rotation, vérifiez que tous les capuchons de vos tubes sont serrés et sécurisés.
Lorsque vous chargez les tubes, faites en sorte que chaque échantillon soit contrebalancé avec un autre échantillon directement en face de lui.
Si vous avez seulement un tube, placez alors un autre tube qui peut jouer le rôle de contrepoids.
Si vous avez trois tubes d’échantillons de même poids, vous pouvez les placer en triangle afin qu’ils soient équidistants l’un de l’autre.
Equilibrer les poids dans la centrifugeuse est critique. Les rotors de centrifugeuses atteignent des vitesses importantes et ont énormément d’énergie cinétique. Si l’ensemble n’est pas correctement équilibré, il peut être propulsé de sa place et faire de sérieux dégâts ou blessures.
Une fois que vous avez vérifié que le rotor et le couvercle sont sécurisés, commencer la centrifugation et attendez qu’elle atteigne la vitesse désirée. Si vous constatez un problème, appelez un membre expérimenté du laboratoire pour venir vous aider.
Lorsque votre centrifugation est finie, vous devriez être capable de voir votre spécimen biologique au fond du tube dans un pellet, qui est séparé du reste de la solution, ou supernageant.
Le supernageant peut être retiré soit par soutirage (un nom chic pour dire renverser), soit par aspiration (un nom chic pour dire succion pour le retirer).
L’échantillon purifié peut alors être remis en solution via un procédé appelé “remise en suspension”. La répétition de centrifugations, ou rotation des cellules, suivi par l’aspiration des cellules et leur resuspension dans un tampon, est souvent référencé comme “lavage des cellules”.
Maintenant que vous avez vu quelques bases de la centrifugation, il est temps de jeter un oeil à quelques uns des types de centrifugeuses et les procédures que vous pouvez effectuer avec elles.
Les centrifugeuses à rotor à angle fixe sont probablement le type le plus commun de cet instrument que vous rencontrerez dans un laboratoire. Beaucoup des centrifugeuses de dessus de table rentrent dans cette catégorie.
Ces centrifugeuses, dans lesquelles les tubes sont placés dans une position fixée et inclinée, sont utilisées dans des protocoles de centrifugation différentiels. Dans ces procédures, une série de centrifugations à différentes vitesses peut être utilisée pour purifier des échantillons biologiques comme des cellules animales. Typiquement, ces protocoles impliquent plusieurs étapes de lavage de cellules.
Contrairement aux rotors à angle fixe, les rotors à godets mobiles ont des portes-tubes souples qui permettent aux échantillons de tourner vers l’extérieur. Ces rotors sont avantageux dans des utilisations comme la centrifugation en gradient de densité, où les échantillons biologiques migrent en couches distinctes en gradient de milieu. Ce type de centrifugation est utile pour l’isolation rapide d’un type de cellule par rapport a un autre, ou pour l’isolation de cellules organite individuelles.
Enfin, l’ultracentrifugeuse est la grande soeur de toutes les centrifugeuses que vous trouverez dans le labo. Elle peut tourner à plus de 70 000 tours par minute, ce qui la rend bien adaptée pour l’isolation de petites particules, comme l’ADN ou les virus.
A cause des vitesses importantes de cette centrifugeuse une attention supplémentaire doit être appliquée, pour assurer que les charges soient correctement équilibrées, et que le rotor et le couvercle soient sécurisés.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la Centrifugation. Dans cette vidéo nous avons vus: ce qu’est une centrifugeuse et comment elle fonctionne, comment préparer et exécuter une centrifugation, quelques précautions de sécurité, et différentes utilisations de la centrifugation. Merci de nous avoir regardé et souvenez-vous d’équilibrer vos tubes!
La centrifugeuse est un instrument utilisé dans presque tous les laboratoires de recherche biomédicale du monde.
La centrifugation est un processus par lequel une centrifugeuse est utilisée pour séparer les composants d’un mélange complexe.
En faisant tourner des échantillons de laboratoire à des vitesses très élevées, les composants d’un mélange donné sont soumis à la force centrifuge, ce qui fait que les particules les plus denses s’éloignent de l’axe de rotation et que les particules plus légères s’éloignent de celui-ci et les plus légères s’en rapprochent. Ces particules peuvent se sédimenter au fond du tube dans ce que l’on appelle une pastille, et cet échantillon isolé, ou la solution restante, le surnageant, peut être traité ou analysé plus avant.
Le composant principal d’une centrifugeuse est le rotor, qui est la pièce mobile qui tourne à grande vitesse.
Les rotors peuvent être fixés en position, ou une centrifugeuse peut utiliser plusieurs rotors fixés au sommet d’une partie appelée broche.
Habituellement, le rotor de la centrifugeuse est doté d’un couvercle qui est vissé hermétiquement pour empêcher les échantillons de s’envoler.
De nombreuses centrifugeuses auront une unité de réfrigération qui permet de contrôler la température interne pendant l’essorage.
Ils disposent également de boutons ou de boutons pour saisir les paramètres de chaque course, qui peuvent inclure la durée de l’essorage, la température et l’amplitude de l’essorage en termes de vitesse ou de force relative.
La vitesse d’essorage est mesurée en RPM, ou tours par minute. Le RPM est une valeur délicate, car ce n’est pas la vitesse de la centrifugeuse qui provoque la séparation des particules d’un mélange, mais la force agissant sur ces particules.
La force agissant sur une particule est liée au rayon du rotor de la centrifugeuse, et comme différentes centrifugeuses ont des tailles de rotor différentes, différentes forces peuvent être appliquées à la même vitesse, ou RPM.
La force de centrifugation peut également être quantifiée en tant que force centrifuge relative, ou RCF. La FCR est généralement présentée comme un multiple de l’accélération gravitationnelle de la Terre.
La FCR est exprimée comme le produit du rayon du rotor et du carré de la vitesse angulaire divisé par l’accélération gravitationnelle de la Terre.
La FCR peut être liée à la vitesse par minute par l’équation suivante, où r représente le rayon de la centrifugeuse mesuré en centimètres.
L’utilisation de cette équation peut faire la différence entre une expérience ratée ou réussie, mais vous n’avez pas besoin d’appliquer ce calcul à chaque nouvelle procédure. Les centrifugeuses sont souvent livrées avec des nomogrammes qui peuvent aider à convertir assez facilement la FCR en RPM. Utilisez une règle pour connecter le rayon de la centrifugeuse et une valeur de régime donnée, afin d’obtenir la FCR.
Pour commencer à faire tourner vos échantillons, tenez compte de la température. Si vous utilisez une centrifugeuse réfrigérée, vous voudrez que la température interne de la machine atteigne la valeur souhaitée avant de commencer l’essorage, ou vous pouvez trouver d’autres moyens de refroidir le rotor.
Immédiatement avant un essorage, assurez-vous que tous les bouchons de vos tubes sont serrés et sécurisés.
Lorsque vous chargez vos tubes, assurez-vous que chaque échantillon est contrebalancé par un autre échantillon directement en face de celui-ci.
Si vous n’avez qu’un seul tube, fabriquez un autre tube qui peut servir de contrepoids.
Si vous avez trois tubes, vous pouvez les disposer en triangle de manière à ce qu’ils soient équidistants les uns des autres.
L’équilibrage des poids dans une centrifugeuse est essentiel. Les rotors de centrifugeuses atteignent des vitesses élevées et ont beaucoup d’énergie cinétique. S’il n’est pas correctement équilibré, l’ensemble de l’unité de centrifugation peut être propulsé hors de son lieu de repos et causer de graves dommages.
Une fois que vous avez vérifié que le rotor et le couvercle sont bien fixés, démarrez la centrifugeuse et attendez jusqu’à ce qu’elle atteigne la vitesse souhaitée. Si vous remarquez un problème, appelez un membre expérimenté du laboratoire pour venir vous aider.
Lorsque votre centrifugation est terminée, vous devriez être en mesure de voir votre échantillon biologique au fond du tube dans une pastille, qui s’est séparée du reste de la solution, ou surnageant.
Le surnageant peut être éliminé soit en le transvasant – un nom fantaisiste pour le verser, soit en l’aspirant – un terme sophistiqué pour utiliser la succion pour l’éliminer.
L’échantillon purifié peut ensuite être renvoyé dans une solution via un processus appelé remise en suspension. Les répétitions de cellules de centrifugation ou de rotation, suivies de cellules d’aspiration et de remise en suspension dans un tampon, sont souvent appelées cellules de lavage.
Maintenant que vous avez vu les bases de la centrifugation, il est temps de jeter un coup d’œil à certains des types de centrifugeuses disponibles et aux procédures que vous pouvez effectuer avec elles.
Les centrifugeuses à rotor à angle fixe sont probablement le type d’instrument le plus courant que vous rencontrerez en laboratoire. De nombreuses centrifugeuses de table entrent dans cette catégorie.
Ces centrifugeuses, dans lesquelles les tubes sont placés dans une position fixe et inclinée, sont utilisées dans les protocoles de centrifugation différentielle. Dans ces protocoles, une série de centrifugations à différentes vitesses peut être utilisée pour purifier des échantillons biologiques comme des cellules animales. En règle générale, ces protocoles impliquent plusieurs étapes de lavage cellulaire.
Contrairement aux rotors à angle fixe, les rotors pivotants ont des supports de tube flexibles qui permettent aux échantillons de pivoter vers l’extérieur. Ces rotors sont bénéfiques dans des applications telles que la centrifugation à gradient de densité, où les échantillons biologiques migrent vers des couches distinctes de milieux à gradient. Ce type de centrifugation est utile pour isoler rapidement un type de cellule d’un autre, ou pour isoler des organites individuels.
Enfin, l’ultracentrifugeuse est le grand frère de toutes les centrifugeuses que vous trouverez en laboratoire. Il peut tourner à plus de 70 000 tr/min, ce qui le rend bien adapté à l’isolement de petites particules, comme l’ADN ou les virus.
En raison des vitesses élevées de cette centrifugeuse, des précautions supplémentaires doivent être prises pour s’assurer que les charges sont correctement équilibrées et que le rotor et le couvercle sont sécurisés.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la centrifugation. Dans cette vidéo, nous avons passé en revue : ce qu’est une centrifugeuse et comment elle fonctionne, comment utiliser et faire fonctionner une centrifugeuse, certaines précautions de sécurité et différentes applications de votre centrifugation. Merci d’avoir regardé et n’oubliez pas d’équilibrer vos tubes.
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