L'isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les adipocytes primaires et d’induire leur différenciation en culture en cellules beiges ou brillantes. La première étape consiste à disséquer le tissu adipeux de souris. Ensuite, le tissu est digéré avec de la collagénase.

Une fois que la fraction vasculaire du stroma est isolée, les cellules sont plaquées. La dernière étape consiste à induire la différenciation des cellules en cellules beiges ou brillantes. En fin de compte, des méthodes analytiques sont utilisées pour montrer une expression accrue des gènes spécifiques des adipocytes bruns.

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés des tissus adipeux bruns, à savoir quel mécanisme moléculaire régule le développement des cellules brillantes ou be. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de l’obésité et d’autres maladies liées au mode de vie. Étant donné que la manipulation du tissu adipeux brun chez l’homme peut être utilisée comme une intervention thérapeutique potentielle, La première étape consiste à préparer le milieu de digestion.

Ensuite, après l’euthanasie, le tissu adipeux est retiré. Tout d’abord, isolez le tissu adipeux brun interscapulaire ou la chauve-souris en coupant le long du dos de l’animal jusqu’au cou. Deux lobes de tissu adipeux brun se trouvent juste sous la peau entre les épaules.

Ensuite, retirez soigneusement la fine couche de graisse blanche qui recouvre la chauve-souris. Une fois isolé, placez le tissu directement dans du PBS propre. Le tissu adipeux blanc inguinal ou wat se trouve directement sous la peau des deux côtés.

Il s’étend à l’intérieur des cuisses et descend vers les testicules. Retirez le mouchoir et placez-le dans du PBS propre. Les étapes suivantes s’appliquent à la fois aux chauves-souris et aux échantillons humides.

Éliminez rapidement toutes les contaminations telles que les cheveux, les muscles squelettiques et le tissu conjonctif des sections de tissus. Ensuite, séchez rapidement le tissu sur une serviette en papier pour éviter la dilution du milieu de dissection avec le PBS et placez-le sur une plaque sèche. Ajoutez le milieu de digestion et coupez le tissu en petits morceaux.

Ensuite, transférez le tissu dans un tube de 50 millilitres contenant le reste du milieu de digestion. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec une agitation constante pendant 40 à 50 minutes pour digérer. Vérifiez toutes les 10 à 15 minutes pour vous assurer que la digestion se passe bien et pour éviter une surdigestion.

Une fois que le tissu est bien digéré, arrêtez la digestion. En ajoutant cinq millilitres de milieu complet et en mélangeant bien, les cellules doivent être presque complètement homogènes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 700 fois G pendant 10 minutes.

La fraction vasculaire stromale devrait maintenant être visible sous forme de pastille brunâtre au bas du tube qui aspire la couche adipocytaire mature huileuse sur le dessus et la majeure partie de la couche liquide. Ensuite, dissolvez le granulé dans 10 millilitres, complétez le milieu et mélangez bien. Une fois mélangé, placez une crépine de cellules sur un nouveau tube de 50 millilitres et filtrez la suspension de cellules.

Transférez la suspension de cellules filtrées dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 700 fois G pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez le fluide et remettez le granulé en suspension. Dans 10 millilitres de milieu complet, pipetez et mélangez bien plaquez les cellules au besoin.

En général, cinq souris donnent deux plaques de 10 centimètres de wat inguinal et une plaque de chauve-souris. Une ou deux heures après le placage. Aspirez deux fois le lavage moyen avec du PBS et ajoutez du milieu frais.

Cette étape est importante car elle peut éliminer les globules rouges, les cellules immunitaires et d’autres contaminants. Les supports d’entretien et d’induction sont préparés à l’avance. Une fois que les adipocytes primaires ont atteint une confluence de 95 à 97 %, remplacez le milieu complet habituel par un milieu d’induction.

Après 48 heures, remplacez le milieu par un milieu d’entretien contenant 0,5 glitazone osmosée micromolaire. Après 48 heures supplémentaires, passer à un milieu d’entretien frais contenant une glitazone osmosaire micromolaire pendant deux à trois jours supplémentaires. Les gouttelettes apparaîtront environ trois à quatre jours après l’induction, comme on le voit ici, six à sept jours après l’ajout du milieu d’induction.

Les cellules doivent être complètement différenciées en cellules graisseuses matures et doivent être remplies de gouttelettes d’huile. Les cellules peuvent maintenant être récoltées et utilisées pour une analyse plus approfondie. Le brunissement des adipocytes primaires peut être évalué en mesurant l’ARNm des gènes spécifiques ou sélectifs de la graisse brune par Q-R-T-P-C-R comme on le voit ici.

RO glitazone, l’expression de l’ARNm UCP a induit de manière robuste le traitement FORSKOLIN désigné ici comme MP A cyclique. Augmentation supplémentaire de l’expression de l’UCP induite par la glitazone RO. Cdia. Un autre gène sélectif de la graisse brune a également été considérablement augmenté de manière dose-dépendante. Le traitement par glitazone osmosée a également augmenté l’expression de FABP quatre et du marqueur adipogénique pour la graisse brune et blanche.

Cet effet de brunissement n’était pas simplement dû à une augmentation de l’adipogenèse en soi. Étant donné que l’induction de l’expression d’UCP one et de CDIA était toujours significative, même si les niveaux d’ARNm étaient normalisés à ceux de FABP quatre, ce Western blot confirme l’augmentation du niveau de protéine UCP one. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les préadipocytes et de différencier ces cellules en cellules beiges ou brillantes en culture.