Name: Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez la microscopie vidéo en cellules vivantes pour étudier la phagocytose de Candida albicans par les macrophages. Cette méthode permet d'analyser en temps réel les étapes de migration, reconnaissance et maturation du phagosome.

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LPE est un écossais Senior Fellow clinique et reconnaît le soutien de l&#39;Office scientifique en chef (SCD/03). Ce travail a été financé par le Wellcome Trust subvention de projet de LPE (089 930). NARG a été financé par une subvention du Wellcome Trust programme (080 088) et une subvention d&#39;équipement (075 470) (pour DeltaVision), et par une subvention du 7e PC-2007-2013 (SANTÉ-F2-2010-260338-Allfun). Nous tenons à remercier l&#39;Université d&#39;Aberdeen imagerie installation, en particulier Kevin MacKenzie, pour l&#39;appui et des conseils utiles.

1. C. Croissance albicans et Conditions <ol><li> Préparer des plaques de gélose SC-Ura en ajoutant 6,9 g de base azotée de levure sans acides aminés, 1 ml de NaOH 1 M, 10 ml à 1% (p / v) du sel hémisulfate adénine et 20 g d&#39;agar technique (précédemment décrites en détail dans 11). Make up le volume à 900 ml d&#39;eau distillée H 2 O. Autoclave, laisser refroidir la gélose, mais pas assez pour se solidifier, puis ajouter 50 ml stérile 40% de D-glucose et de 50 ml stérile 4% SC-Ura abandon dans des conditions aseptiques. Mélanger, verser dans des boîtes de Pétri et laisser des boîtes de gélose refroidir et se solidifier. Plaques de gélose Boutique à 5 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li><li> Série C. albicans sérotype A, souche CAI4 + CIP10 des stocks glycérol conservés à -80 ° C sur gélose SC-Ura. </li><li> Incuber la plaque à 30 ° C jusqu&#39;à la formation de colonies et la conserver à 5 ° C. </li><li> Culture d&#39;un seul C. albicans colonie dans 5 ml SC-Ura support (recette comme en 1.1, mais sans gélose technique) et incuber une nuit à 30° C, 200 rpm afin de générer phase stationnaire C. albicans. </li></ol> 2. C Coloration albicans Utilisation isothiocyanate de fluorescéine (FITC) <ol><li> Ajouter 10 ul C. albicans culture d&#39;une nuit à 990 ul de PBS (pH 7,4) et d&#39;effectuer un comptage des cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. </li><li> Pour faciliter la visualisation de C. albicans lors de tests de phagocytose, tache 1 × 10 8 C. albicans en utilisant 1 mg / ml dans 0,05 M FITC tampon carbonate-bicarbonate (pH 9,6) pendant 10 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Pour supprimer FITC non consolidées, se laver C. albicans dans 1 ml de PBS 1 x, centrifugeuse à 3000 xg pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS 1 x. Répétez 3 fois. </li><li> Resuspendre le culot à 1 × 10 6 cellules / ul dans 1 x PBS. </li></ol> 3. Préparation de la Ligne J774.1 macrophages de souris de cellules <ol><li> Maintenir J774.1 macrophages dans le tissu de 75 cm 2des flacons de culture dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau fœtal (SVF), 200 U / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine à 37 ° C avec 5% de CO 2. La préparation des macrophages primaires est décrit ailleurs en détail 12, 13. </li><li> Grattez J774.1 cellules du flacon de culture tissulaire et transférer dans un tube Falcon de 50 ml. Centrifuger à 600 xg pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml préchauffé milieu DMEM supplémenté. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque 1 × 10 6 J774.1 macrophages dans 2 ml du milieu DMEM additionné dans une boîte d&#39;imagerie à base de verre de 35 mm. Incuber une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Avant d&#39;imagerie, remplacez milieu DMEM supplémenté avec 2 ml de pré-chauffé complété CO 2-indépendant moyenne (avec 10% (v / v) de sérum de veau foetal (SVF), 200 U / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) contenant 1 uM Lysotracker Rouge MDN-99.</li></ol> 4. Live Video cellulaire phagocytose Microscopie Assay <ol><li> Le choix d&#39;un microscope dépend de ce qui est disponible localement, mais la configuration de microscope devra inclure une phase inversée, une chambre environnementale chauffé à 37 ° C et d&#39;excitation / émission des filtres pour les taches choisies (FITC et TRITC). </li><li> Allumez le chauffe-microscope avant l&#39;expérience et de laisser suffisamment de temps pour la chambre de contrôle de l&#39;environnement se réchauffer à 37 ° C. Le temps nécessaire pour température de la chambre de stabiliser varie en fonction des réglages différents microscope. </li><li> Allumez le microscope et l&#39;ordinateur et charger le logiciel d&#39;imagerie. Montez l&#39;antenne d&#39;imagerie sur la platine du microscope et la mise au point de trouver les J774.1 macrophages. Optimiser l&#39;apparence des images TRITC et DIC en ajustant le pourcentage de lumière transmise et les temps d&#39;exposition. </li><li> Retirer le plat d&#39;imagerie et ajouter 3 × 10 6 FITC teinté C. albicans à til plat. Noter le temps que C. albicans est ajouté à la cuvette. Remettez le plat de la scène et d&#39;optimiser l&#39;affichage des images FITC si nécessaire. Mettre en place une liste de points si nécessaire. </li><li> Commencer lorsque tous les points d&#39;imagerie sont nets et les canaux sont optimisés. Capturez FITC, TRITC images et DIC chaque minute pendant 6 heures. </li></ol>

<ol><li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li>
<li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li>
<li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li>
<li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li>
<li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li>
<li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen%2C+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , In Press (2012).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li>
<li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li>
<li>Erwig, L. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+%28ERM%29+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler. NG est un bénéficiaire de la pension subvention sans restriction de la recherche fondamentale par Gilead Sciences. LE travaille comme consultant pour GSK dans le développement précoce de médicaments.

Voici la méthode pour l&#39;utilisation de la vidéo-microscopie des cellules vivantes pour étudier la phagocytose des macrophages est décrite. Vidéomicroscopie offre de multiples couches d&#39;informations supplémentaires pour l&#39;analyse. Un avantage essentiel est que les données d&#39;absorption peut être générée (à partir d&#39;une seule expérience) pour tout point dans le temps tout au long de la période de 6 heures d&#39;observation. Plus important encore, la méthode décrite permet une analyse différentielle des différentes étapes de la phagocytose. Nous avons, par exemple, montré que les changements dans l&#39;absorption globale de C. glycosylation albicans et des mutants de la morphogenèse par des lignées cellulaires de macrophages et les macrophages primaires peut être une conséquence de l&#39;évolution de la migration des macrophages vers les cellules cibles ou le taux d&#39;immersion fois contact cellule-cellule est établi 7. Il ya un certain nombre d&#39;écueils à éviter lors de la conduite de ces expériences. Tout d&#39;abord, il est très important de s&#39;assurer des conditions environnementales stables tout au long de la procédure expérimentaleDure. Le meilleur moyen est dans une chambre climatique qui est réglé pour les conditions expérimentales plusieurs heures avant de commencer l&#39;expérience. La qualité vidéo est très dépendante des modules sophistiqués qui utilisent des lasers infrarouges pour maintenir automatiquement l&#39;échantillon position z, indépendamment des changements mécaniques ou thermiques, éliminant ainsi la nécessité pour les corrections mise au point manuelle. Compte tenu de la nature étendue de ces expériences, il est important de limiter l&#39;exposition de lumière laser et effets associés photoblanchiment et photoconversion, qui peut être minimisé en utilisant des marqueurs fluorescents hautement, ce qui facilite les temps d&#39;exposition faible. Le protocole de coloration FITC décrit ici est rapide et fiable. Comme FITC est un très lumineuses et stable tache, temps d&#39;exposition faibles sont nécessaires, ce qui le rend idéal pour les longues FITC time-lapse films. Cependant, nous avons l&#39;habitude d&#39;utiliser une variété de taches cibles différentes, y compris calcofluor blanc et colorants PKH ainsi que les organismes marqués. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La plupart de notre travail publié est réalisé en utilisant un microscope à champ large, mais l&#39;exposition peut être diminuée en utilisant un microscope confocal à disque rotatif et dans nos mains ce qui est essentiel pour la microscopie time-lapse vidéo 3D. Au cours de cette étude, les images ont été capturées à des intervalles de 1 min sur un essai de phagocytose 6 heures. L&#39;intervalle entre les images peut être ajustée en fonction du procédé objet de l&#39;enquête. Par exemple, l&#39;intervalle peut être diminué lorsque l&#39;étude des processus rapides tels que le trafic vésiculaire. L&#39;intervalle de temps minimum sera limitée par les spécifications du microscope et de la caméra. Il ya quelques considérations à prendre en compte lors de l&#39;ajustement des synchronisations. Tout d&#39;abord, diminuer l&#39;intervalle entre les clichés se traduira par moins de points peuvent être visualisés et la taille du fichier sera considérablement augmentée. Au contraire, l&#39;augmentation de l&#39;intervalle image trop se faire le film perd la continuité. Cette approche peut être appliquéeen principe, d&#39;étudier d&#39;autres agents pathogènes et l&#39;absorption de la mort des cellules hôtes. Par exemple, nous avons récemment montré que les macrophages de la moelle osseuse provenant de souris déficientes en sialoadhésine présentent grandement réduit la liaison et la phagocytose des sialylé Campylobacter jejuni 8. Cependant, la taille de la cible est un déterminant important de la faisabilité, comme l&#39;analyse d&#39;images devient de plus en plus difficile avec une réduction de la taille de la cellule cible. Un logiciel sophistiqué d&#39;analyse d&#39;image est essentielle pour l&#39;analyse vidéo microscopie rapide, ce qui devrait aller de pair avec un soutien approprié bioinformatique pour faciliter la génération d&#39;algorithmes pour étudier la migration des cellules individuelles et des populations de cellules entières 7. Vidéo-microscopie des cellules vivantes en combinaison avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image sophistiqué pour l&#39;analyse minute par minute de la migration des macrophages et individuels-C.albicans interactions, offre une perspective unique sur la complexité de C. phagocytose albicans par macrophages. Il ya un énorme potentiel pour élargir ces méthodes pour étudier d&#39;autres agents pathogènes et les phagocytes (cellules dendritiques, les neutrophiles) et de développer la vidéo-microscopie 3D pour l&#39;imagerie interactions cellule-cellule avec plus de détails ou sur des surfaces plus physiologiques tels que des couches de cellules épithéliales et endothéliales. Cette technique fait partie de la prochaine génération d&#39;outils pour l&#39;étude des interactions hôte-pathogène et permettra de générer des informations détaillées spatiale et temporelle sur un large éventail de processus dynamiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Base azotée de levure sans acides aminés </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Sel hémisulfate adénine </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar technique (n ° 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura abandon </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Carbonate de sodium </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> Lysotracker Rouge MDN-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 mm de verre plats </td><td> AAP </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

video microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Jeu phagocytaire des champignons pathogènes et les microorganismes, plus généralement, peut être considéré comme constitué de quatre étapes distinctes: (i) la migration des phagocytes au site où se trouvent des agents pathogènes, (ii) la reconnaissance du pathogène motifs moléculaires associés (PAMP) par modèle récepteurs de reconnaissance (PRR), (iii) l&#39;engloutissement de micro-organismes liés à la membrane cellulaire des phagocytes, et (iv) le traitement des cellules englouti dans les phagosomes maturation et la digestion de la particule ingérée. Des études qui évaluent la phagocytose dans son intégralité sont informatifs 1, 2, 3, 4, 5, mais sont limitées en ce sens qu&#39;elles ne sont normalement pas rompre le processus en migration, l&#39;engloutissement et de la maturation du phagosome, qui peut être affectée différemment. En outre, ces études évaluer l&#39;absorption comme un événement unique, plutôt que comme un processus continu et dynamique. Nous avons récemment mis au point des technologies d&#39;imagerie cellules vivantes, et ont combiné ces derniers avec l&#39;analyse génétique fonctionnelle des deuxcellules pathogènes et hôte de créer une plate-forme interdisciplinaire pour l&#39;analyse de la fonction des cellules immunitaire inné et pathogénie des champignons. Ces études ont révélé de nouveaux aspects de la phagocytose qui ne peuvent être observés en utilisant systématiquement l&#39;analyse temporelle des interactions moléculaires et cellulaires entre les phagocytes humains et des champignons pathogènes et les microorganismes infectieux en général. Par exemple, nous avons commencé à définir les éléments suivants: (a) les composants de la surface cellulaire nécessaire à chaque étape du processus de reconnaissance, l&#39;engloutissement et de destruction des cellules fongiques 1, 6, 7, 8, (b) la façon dont la géométrie de surface influe sur l&#39;efficacité de l&#39;absorption des macrophages et le meurtre de la levure et des cellules des hyphes 7, et (c) la façon dont l&#39;engloutissement entraîne une modification du cycle cellulaire et le comportement des macrophages 9, 10. Contrairement aux simples clichés de points de temps, la vidéo-microscopie des cellules vivantes permet une grande variété de cellules hôtes et des agents pathogènes à étudier en tant que continuous séquences plus longues périodes de temps, fournissant des informations spatiales et temporelles sur un large éventail de processus dynamiques, y compris la migration cellulaire, la réplication et le trafic vésiculaire. Ici, nous décrivons en détail la façon de préparer hôte et les cellules fongiques, et de mener des expériences de microscopie vidéo. Ces méthodes peuvent fournir un guide utilisateur pour les études futures avec d&#39;autres phagocytes et les microorganismes.

Ici, nous montrons des résultats représentatifs pour C. absorption albicans par une lignée cellulaire de macrophages murins J774.1 pendant 6 heures une cellule vivante expérience vidéo-microscopie. Figure 1 est un représentant des cellules vivantes film vidéo microscopie, montrant la phagocytose de C. albicans par murins J774.1 macrophages. Vidéo-microscopie des cellules vivantes permet l&#39;internalisation de C. albicans à être visualisées sans avoir besoin de colorer Candida externe. Cependant, au cours de ces expériences, C. albicans a été coloré avec le colorant sensible au pH FITC (vert), qui est désactivé au cours de l&#39;acidification du phagosome des macrophages, et facilite la confirmation que Candida a été internalisé (figure 1). Pour visualiser l&#39;aide supplémentaire de ingéré C. albicans, les macrophages ont été colorées en utilisant la fluorescence rouge Lysotracker colorant rouge MDN-99, quels compartiments taches acides et sert de marqueur non spécifique de la maturation du phagosome.La figure 2 est une image fixe à partir d&#39;une expérience de cellules vivantes vidéo microscopie et illustre la variation du nombre de C. albicans ingérés par les macrophages J774.1 individuels. Dans cette expérience, 82% des macrophages J774.1 englouti au moins un C. albicans cellule à la fin de l&#39;essai 6 h phagocytose. Dans la figure 3, le nombre de intériorisée C. cellules albicans par des macrophages est signalée. Le nombre moyen de C. albicans repris par des macrophages est de 3,4, mais il est intéressant macrophages peuvent ingérer jusqu&#39;à 16 cellules fongiques. Figure 4 est une séquence d&#39;images fixes à partir d&#39;un représentant des cellules vivantes expérience microscopie vidéo montrant un macrophage phagocytant C. cellules albicans, la croissance hyphe avec le macrophage et la lyse des macrophages en fin de compte. Figure 4 illustre le fait que la vidéo-microscopie permet l&#39;analyse des événements qui ont suivi l&#39;embrasement de cellules cibles, à savoir les données peuvent être générés pour le kiLLING des macrophages par C. albicans hyphes en ce qui concerne le nombre et la morphogenèse des cellules cibles ingérés, et le meurtre des macrophages se rapporte à la façon dont la maturation du phagosome qui peuvent être étudiés en temps réel. Figure 1. Cellules vivantes film microscopie vidéo montrant la phagocytose de C. albicans par murins J774.1 macrophages. Les macrophages sont colorées par le rouge fluorescent Lysotracker colorant rouge MDN-99, et C. albicans sont colorées par FITC (vert). Les macrophages et C. albicans ont été co-cultivées pendant une période de 6 heures à 37 ° C dans le CO 2-complet indépendant milieu. Les images ont été capturées à des intervalles de 1 min pour 6 heures. Les macrophages peuvent être vus établir contact cellule-cellule avec C. albicans, qui est ensuite suivie par l&#39;absorption de C. albicans dans les phagosomes des macrophages. Les flèches indiquent C. albicans avant l&#39;engloutissement par J774.1 macrophages. Cette vidéo montre également que la fluorescence FITC est QuEnched engloutissement suivante de C. albicans. La barre d&#39;échelle, 10 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Figure 2. Variation microscopie vidéo représentative de cellule vivante image fixe représentant le nombre de C.albicans englouties par les macrophages individuels. Macrophages (teinté à l&#39;aide Lysotracker rouge MDN-99) ont été co-cultivées avec FITC teinté C. albicans (vert). Il ya des variations dans le nombre de C. albicans englouti (un nombre à côté d&#39;une flèche indique le nombre de C. albicans englouti), et C. morphologie albicans (levure soit versets hyphes). La barre d&#39;échelle, 20 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Figure 3. Graphique montrant le nombre de C. albicans ingérée par J774.1 macrophage murin à la fin de 6 tests de phagocytose h. Les données représentent les 2 expériences indépendantes. Un total de 100 macrophages ont été comptés à partir de 3 champs de chaque expérience, ce qui donne un total de 600 macrophages individuels. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Figure 4. Une série d&#39;images à partir d&#39;un représentant des cellules vivantes expérience microscopie vidéo montrant un macrophage (M) et C. albicans (C) avant et pendant la reconnaissance (A, B), et pendant et après l&#39;absorption (C, D). C. albicans hyphes continuer à croître dans le macrophage (E, F), ce qui peut entraîner la lyse des macrophages (G). D&#39;autres macrophages sont recrutés au site de rupture et de tentative d&#39;ingérer le libéré C. albicans (H). Les macrophages sont colorées par le rouge colorant fluorescent LysoTracker rouge MDN-99, et C. albicans sont colorées par FITC (vert). Noter que la coloration FITC est éteint après C. absorption albicans par J774.1 macrophages (C). La barre d&#39;échelle, 10 pm.

Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes de<em&gt; Candida albicans</emPhagocytose&gt; par les macrophages. Ces méthodes permettent spécifiques au stade de l&#39;analyse de la migration des macrophages, la reconnaissance, l&#39;engloutissement et de la maturation du phagosome et de révéler de nouveaux aspects de la phagocytose.

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

L’objectif général de cette procédure est d’effectuer une expérience de microscopie vidéo sur cellules vivantes pour étudier la phagocytose de l’agent pathogène fongique humain candida albicans. Ceci est accompli par la première culture chez Candida albicans pendant la nuit, de sorte qu’ils entrent dans leur phase stationnaire. L’étape suivante consiste à plaquer les macrophages J 7 74 dans des boîtes d’imagerie à fond de verre de 35 millimètres et à les cultiver pendant la nuit.Le lendemain, les candida albicans sont colorés avec du Zi sensible au pH et les organites acides des macrophages sont colorés avec du liso tracker red. La dernière étape consiste à faire une vidéo du test de phagocytose où les macrophages J 7 7 4 sont cultivés avec le candida albicans. En fin de compte, la vidéo résultante peut montrer l’analyse du Pacifique de la reconnaissance de la migration des macrophages, de l’engloutissement et de la maturation de la zone FGA.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’immunocytochimie, est que la microscopie vidéo en direct peut être utilisée pour décomposer les différences observées en étapes individuelles, telles que la migration, l’engloutissement et la maturation des phagosomes, qui peuvent être affectées. Différentiellement, bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la phagocytose de Canada Acan. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que d’autres agents pathogènes, les phagocytes, y compris les cellules dendritiques et les neutrophiles.Cette culture nécessite une préparation avancée de plaques de gélose SC moins U. Ils peuvent être conservés au réfrigérateur, en commençant par strier le sérotype de candida albican, une souche CI quatre plus CLP 10 à partir de stocks de glycérol stockés à moins 80 degrés Celsius sur une plaque de gélose SC U. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies se forment, généralement 48 heures.À ce stade, la plaque peut être stockée à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Maintenant, choisissez une seule colonie et cultivez-la dans cinq millilitres, SCU ou medium pendant la nuit à 30 degrés Celsius sur une bascule réglée à 200 tr/min. Cela va générer des candida albicans en phase stationnaire.Ajoutez 10 microlitres de candida albicans culture de nuit à 990 microlitres de PBS à pH 7,4 et effectuez un comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre pour visualiser le candida albicans pendant les tests de phagocytose, colorez 100 millions de candida à l’aide de Zi pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, retirez le fitzy délié en lavant le candida albicans trois fois dans du PBS pour laver centrifuger le candida à 3000 fois G pendant cinq minutes. Retirez le supnatant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS Reese.Mettre en suspension la pastille finale dans du PBS à une concentration de 1 million de cellules par microlitre. Pour ce protocole, nous avons préparé une culture de macrophages J 7 7 4 0,1 dans des flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés dans du DMEM supplémenté à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone provenant du ballon. Jetez les macrophages et transférez-les dans un Centrif à tube Falcon de 50 millilitres.Utilisez les macrophages à 600 fois G pendant cinq minutes pour obtenir un palais cellulaire. Retirez le supinate et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de DM dmm supplémenté d’avant-guerre. Comptez maintenant les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et placez 1 million de cellules dans une boîte d’imagerie à base de verre de 35 millimètres avec deux millilitres de milieu DMM supplémenté.Incuber le plat pendant la nuit à 37 degrés Celsius et avec 5 % de dioxyde de carbone le lendemain. Avant l’imagerie, remplacez le milieu DMM supplémenté par deux millilitres de milieu indépendant du dioxyde de carbone préchauffé contenant une micromolaire de Liso tracker rouge DND 99, et les mêmes suppléments que le DMM. La configuration du microscope doit inclure une platine inversée et une chambre environnementale chauffée à 37 degrés Celsius et des filtres d’émission d’excitation pour les taches choisies étant ajustées et trixy.Dans cet exemple, un noyau de vision delta de précision appliqué est utilisé. Allumez d’abord le chauffage du microscope de manière à ce que la chambre de contrôle soit chaude à 37 degrés Celsius. Ensuite, allumez le microscope et l’ordinateur et chargez le logiciel d’imagerie, montez la parabole d’imagerie sur la platine du microscope et ajustez la mise au point pour trouver les macrophages J 7 74 0.1.Optimisez l’apparence des images trixi et DIC en ajustant le pourcentage de lumière transmise et les temps d’exposition. Retirez la parabole d’imagerie et ajoutez 3 millions de candida albicans tachés de fitsy dans la parabole. Enregistrez le temps et remettez l’antenne sur la scène, optimisez l’apparence des images ajustées si nécessaire, et configurez les points d’intérêt dans le logiciel d’imagerie si nécessaire.Commençons maintenant l’imagerie lorsque tous les points sont nets et que les canaux sont optimisés. Capturez des images fitzy, trixi et DIC toutes les minutes pendant six heures. Il s’agit de l’étape la plus critique de la procédure.Il faut prendre le temps de régler correctement le microscope. Si les films sont sous-exposés ou surexposés ou s’ils sont flous, ils seront inutilisables et l’expérience devra être répétée. Cette vidéo représentative montre l’absorption de candida albicans par la lignée cellulaire de macrophages murins J 7 74 0.1.Au cours d’une expérience de microscopie vidéo sur cellule vivante de six heures, le candida albicans en vert a été coloré à l’aide du colorant sensible au pH fitsi, qui a été éteint lors de l’acidification du phagosome des macrophages. Confirmant ainsi que lorsque les candida ont été internalisés, les compartiments acides des macrophages ont été colorés avec un colorant fluorescent rouge. Remarquez la variation du nombre de candida albicans ingérés par les macrophages J 7 74 0,1 dans cette expérience, 82 % des macrophages J 7 74 0,1 ont englouti au moins une cellule de candida albican dans les six heures.Le nombre moyen de candida albicans absorbés par macrophage était de 3,4, mais il est intéressant de noter que les macrophages pouvaient ingérer jusqu’à 16 cellules fongiques. Les données permettent d’observer les macrophages et les candida albicans avant et pendant la reconnaissance et l’absorption. Candida albicans peut continuer à se développer dans le macrophage, ce qui peut entraîner une lyse des macrophages.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de microscopie vidéo sur cellules en direct à l’aide de candida albicans sur la lignée cellulaire J 7 7 4 0,1 microphage like. Vous devriez être en mesure de mettre en place des cultures nocturnes des deux types de cellules et d’effectuer un test de phagocytose, ce qui permettra une analyse spécifique à l’étape de la reconnaissance de la migration et de l’engloutissement, ainsi que de la maturation des phagosomes.

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