Mesure de transport de cations Na, K et H, K-ATPase dans Xenopus Les ovocytes par spectrophotométrie d'absorption atomique: une alternative à dosages radio-isotopes

La procédure utilise des cytes de grenouille comme système d’expression in vivo. Pour quantifier l’activité de transport du contre-transport du potassium de type P A, TP, ais ou d’autres transporteurs membranaires d’oligo-éléments, exprimez d’abord la protéine de transport en zap lavis. Les cytes induisent ensuite l’absorption de cations en incubant les cellules dans une solution de flux contenant une certaine concentration du cation transporté pendant un temps et une température déterminés.

Vous pouvez également réaliser l’expérience d’absorption sous contrôle de potentiel membranaire à l’aide de la technique de la pince de tension à deux électrodes. Après le lavage, les cellules homogénéisent, les ovocytes individuels dans un millilitre d’eau millipore. Ensuite, mesurez les échantillons sur un spectrophotomètre d’absorption atomique équipé d’un four d’atomisation de graphite chauffé transversalement.

Enfin, l’analyse du flux de traceurs par absorption atomique. La spectométrie peut être utilisée pour déterminer la cinétique de transport ou d’inhibiteur, la dépendance de la tension du transport et du transport, la géométrie stoïcienne, et peut éventuellement être utilisée pour le dépistage pharmacologique. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une alternative précise, bon marché et sûre aux expériences conventionnelles de flux de traceurs avec des radio-isotopes.

Il offre également une mesure précise de l’influence du potentiel membranaire sur la fonction de transport. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des relations fonctionnelles de structure des TPA de type P A, elle peut également être appliquée à d’autres protéines de transport membranaire spécifiques pour le puits de cuivre ou d’autres oligo-éléments. Préparez les cytes de l’opus et effectuez l’injection d’ARNcr comme décrit par Richards et Demsky pour augmenter la concentration intracellulaire de sodium pour les mesures fonctionnelles du sodium et du potassium.

Aux TPA. Tout d’abord, transférez les cytes dans un tampon de charge en sodium et incubez sur de la glace pendant 45 minutes. Placez ensuite les cytes à récupérer dans le tampon de post-chargement pendant au moins 30 minutes sur de la glace.

Maintenant, pour bloquer le sodium potassium endogène aux TPA, incubez les cytes dans un tampon de post-charge contenant 100 micromolaires pendant 15 minutes. À température ambiante, préparez les micro-électrodes en tirant les capillaires siliciques Bos à l’aide d’un extracteur de micro-pipette en deux étapes. Remplissez les électrodes en verre par l’arrière avec trois molaires de chlorure de potassium et montez-les sur le fil d’argent et de chlorure d’argent des porte-micro-électrodes de la pince de tension à deux électrodes installée.

Ensuite, insérez les micro-électrodes en verre et deux ponts de gélose au chlorure de sodium dans la chambre d’enregistrement pré-remplie de tampon de mesure. Mettez l’amplificateur de tension en mode arrêt. Vérifiez la résistance de chaque électrode de verre séparément.

Vérifiez également les potentiels de décalage de l’électrode de tension et de courant sur l’écran approprié de l’amplificateur TEVC. En cas d’écart par rapport à zéro, ajustez le décalage avec les régulateurs de décalage correspondants de l’amplificateur. Placez maintenant un ovocyte au milieu de la chambre et pénétrez doucement dans la membrane avec le courant et l’électrode de tension.

Vérifiez la lecture de potentiel de l’amplificateur pour le potentiel de repos de la cellule. Basculez l’amplificateur en mode VC à l’aide du logiciel P clamp. Fixez la cellule à un potentiel de membrane prédéfini.

Surveiller l’amplitude et la stabilité du courant de fuite perfuser l’ovocyte avec une solution contenant du rubidium pendant une durée définie. Et enregistrez le courant de la pompe avec le logiciel p clamp. Assurez-vous que l’absorption de rubidium est complètement arrêtée par la suite en perfusant la cellule avec une solution sans rubidium pendant 30 secondes.

Arrêtez maintenant l’expérience de la pince de tension à deux électrodes. Retirez l’ovocyte de la chambre d’enregistrement et procédez au lavage. Étape 4.4 pour analyser l’absorption de rubidium par absorption atomique.

Spectrométrie avec les données. Effectuez une soustraction de courant de décalage et évaluez l’intégrale temporelle du courant de la pompe à l’aide du programme d’ajustement de la pince P. Pour éviter d’endommager les ovocytes, coupez et faites fondre une pointe de pipette de 200 microlitres à environ deux millimètres de diamètre.

Ensuite, pour chaque ovocyte à mesurer, préparez un tube einor de 1,5 millilitre rempli d’un millilitre d’eau millipore. Disposez trois boîtes de Pétri avec un tampon de lavage sans rubidium et une boîte avec de l’eau millipore. Transférez maintenant cinq cytes pré-incubés simultanément dans une boîte de Pétri de 3,5 centimètres remplie d’un tampon de flux de rubidium incubé sous contrôle de température.

Ensuite, rincez les cytes simultanément dans le premier plat avec un tampon de lavage sans rubidium. Passez aux deuxième et troisième lavages, puis rincez doucement à l’eau millipore. Transférez maintenant chaque ovocyte individuellement dans les tubes eph préparés remplis d’un millilitre d’eau milliporeuse Homogénéisez chaque ovocyte à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres jusqu’à ce que la solution soit uniformément trouble.

Ouvrez la vanne d’alimentation en gaz Argonne. Insérez une lampe à cathode creuse appropriée dans la position arbitraire de la douille et équilibrez l’instrument pendant 15 minutes. Démarrez ensuite le logiciel de contrôle du wind lab 32 et prévoyez 15 minutes pour l’équilibrage des lampes.

Vérifiez que le tube de l’atomiseur en graphite chauffé transversalement est en bon état. Sélectionnez ensuite la technique du four THGA dans wind lab 32. Préparez des échantillons d’étalonnage avec au moins cinq concentrations de rubidium et de lithium comprises entre 10 et 50 microgrammes par litre, dissous dans de l’eau milliporeuse et une sonde à blanc d’eau milliporeuse uniquement.

Choisissez maintenant le fichier d’initialisation approprié appelé fichier de méthode. Entrez les positions et les concentrations des échantillons d’étalonnage et de la sonde à blanc. Sélectionnez l’échantillonneur automatique approprié.

Mesurez les sondes d’étalonnage. Transférez maintenant chaque homogénat d’ovocytes dans des gobelets d’échantillonnage individuels en polypropylène de 1,2 millilitre et placez ces tubes à essai dans le plateau d’échantillonnage automatique. Créez un fichier d’informations d’échantillonnage pour identifier les sondes dans les positions de l’échantillonneur automatique.

Ajustez ensuite le volume de l’échantillon à 20 microlitres et démarrez l’instrument une fois le cycle terminé. Vérifiez les sondes dans lesquelles la quantité mesurée de rubidium dépasse le maximum de la courbe d’étalonnage. Diluez ces échantillons de manière appropriée et mesurez-les à nouveau pour le sodium et le potassium électrogènes.

Les flux de rubidium peuvent être déterminés dans deux expériences de tension d’électrode visant à établir la corrélation entre le transport de charge nette et le transport de rubidium. Ici, l’intégration du signal de courant a donné 7 840 nku de charge totale transportée. Le rapport entre la charge totale et le flux de rubidium était de 0,47, une valeur compatible avec la stœchiométrie de transport de trois sodium à deux potassium des APA sodium-potassium.

La reproductibilité de cette technique sur des expériences sur cellule unique est démontrée par les résultats d’expériences répétées produisant une corrélation linéaire entre la charge totale et le transport du rubidium avec un facteur de pente de 0,49 pour le proton potassium fonctionnant de manière électroneutre. A : la dépendance de la concentration de l’absorption du rubidium et sa sensibilité vis-à-vis de l’inhibiteur spécifique S CH 2, 8, 0, 8, 0, peuvent être déterminées. Ces mesures dans différents lots d’ovocytes montrent une absorption de fond dans les ovocytes injectés de moins de 10 % de l’absorption maximale de rubidium détectée, ce qui est insensible à l’ajout de SCH 2 8 0 8 0.

En revanche, les flux dans les cytes exprimant le proton potassium atpa sont réduits au niveau de fond. Lors de l’addition de 10 micromolaires s CH 2 8 0 8 0 Le tracé des valeurs d’absorption spécifiques permet de calculer les affinités apparentes du proton potassium Le transport du renouvellement de l’ATP pour le rubidium entraîne une diminution de l’affinité apparente pour le rubidium compatible avec la compétition pour la poche de liaison cationique de parement extracellulaire pendant le transport. La combinaison d’expériences d’absorption du rubidium sous contrôle de potentiel membranaire par une pince de tension à deux électrodes et d’une détermination a s peut également être appliquée pour déterminer la dépendance en tension du transport du rubidium par les APA proton-potassium.

Dans différentes conditions de pH, les expériences de flux de rubidium peuvent être utilisées pour étudier les effets fonctionnels des mutations des APA du proton-potassium. Par exemple, l’analyse de l’activité de transport du rubidium des mutants APA protoniques potassium avec différentes délétions C-terminales révèle que l’activité d’absorption du rubidium diminue progressivement avec le nombre d’acides aminés supprimés. Il est intéressant de noter que l’étendue de l’inhibition de l’absorption du rubidium par 10 micromolaires SC 2 8 0 8 0 est nettement réduite pour la construction delta Y, tandis que delta YY et delta Q-E-L-Y-Y ne sont plus sensibles à 10 micromolaires S CH 2 8 0 8 0 à toutes les pages SDS Les analyses indiquent que la quantité totale de protéines dans les fractions membranaires pour les différentes constructions de délétion était similaire.

Cependant, la quantité relative de protéines dans les fractions de la membrane plasmique a diminué avec la délétion C-terminale associée aux résultats d’inhibition du médicament. Ces données ont des implications sur la distribution à l’état stationnaire des intermédiaires du cycle de réaction, comme discuté dans le texte d’accompagnement, les flux de rubidium peuvent également être utilisés pour mesurer des paramètres thermodynamiques tels que les énergies d’activation. L’absorption du rubidium par le proton potassium atpa exprime les ovocytes est fortement dépendante de la température.

Un graphique aous donne une bonne corrélation linéaire des données, ce qui donne une énergie d’activation de 96 kilojoules par mole. Les premiers résultats sur l’absorption du lithium ont montré que l’absorption non spécifique du lithium dans les cytes est faible, tandis que l’absorption par le proton potassium atpa augmente de manière dose-dépendante et semble résistante à SC 2 8 0 8 0. Ces données mettent en lumière les états enzymatiques au cours du cycle stationnaire du proton-lithium.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de sélectionner les cytes pour leur taille homogène et de s’en tenir actuellement aux temps d’incubation et à la température pour chaque expérience de flux. Ensuite, une procédure S. D’autres méthodes telles que le dépistage pharmacologique peuvent être effectuées afin d’identifier de nouveaux médicaments pour le traitement contre les maladies humaines telles que le gaz, l’ostéopathe ou l’hypertension.