Préparation des liposomes de géant pour l'imagerie et de patch-clamp électrophysiologie

L’objectif global de cette procédure est de préparer des vésicules lamellaires géantes d’une manière compatible avec l’intégrité fonctionnelle des protéines membranaires incorporées dans la membrane de la vésicule. Ceci est accompli en déposant d’abord des lipides ou de petits liposomes sur une surface conductrice comme une lame de verre recouverte d’ITO. La deuxième étape consiste à évaporer le solvant de manière contrôlée pour obtenir un film lipidique uniforme sur la surface conductrice.

Ensuite, réhydratez soigneusement le film lipidique dans un tampon approprié et préparez la chambre d’électroformation. La dernière étape consiste à appliquer une tension oscillante à travers le film lipidique pour générer des vésicules de Miller unales géantes. En fin de compte, les vésicules seront imagées pour déterminer leur taille et leur qualité et les comparer aux vésicules formées à l’aide d’une technique classique.

La démonstration visuelle de ce protocole est utile car le dépôt de lipides peut être difficile à maîtriser, dépend de nombreuses variables et est mieux dosé par inspection visuelle. Avant de commencer cette procédure, retirez les lipides du stockage à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius et réchauffez-les à température ambiante. Si possible, effectuez l’expérience dans une atmosphère de gaz inerte telle qu’une boîte à gants.

Ensuite, couvrez les lipides dans de l’argonne sèche ou de l’azote gazeux et, dans toutes les étapes, minimisez l’exposition à l’air. Si les lipides ne sont pas fournis dans un solvant organique, suspendez 0,3 milligramme de lipides dans du chloroforme ou du cyclo-cholestérol à 10 milligrammes par millilitre. Veuillez noter que les concentrations indiquées par les fabricants ne sont généralement que nominales.

Utilisez de l’éthanol pour nettoyer les deux côtés de 2 lames de verre à revêtement ITO de 25 millimètres sur 37,5 millimètres. Ajoutez ensuite 0,1 % de DPPE rouge du Texas supplémentaire aux lipides pour l’imagerie fluorescente. Mesurez la résistance de surface à l’aide d’un multimètre pour vérifier que le côté revêtu d’ITO des lames de verre est orienté vers le haut, ce qui est indiqué par une résistance de quelques centaines d’ohms.

Aspirez les lipides dans une seringue résistante aux solvants, l’aiguille de la seringue ne touchant pas tout à fait la surface de l’ITO. Appliquez lentement le lipide en déplaçant l’aiguille d’avant en arrière sur la lame. Couvrez la surface uniformément, à la recherche d’un éclat arc-en-ciel sur la surface du verre.

Ensuite, le glissement se glisse rapidement dans un vide desséché et pompe la chambre à moins d’un vide pendant 0,5 à une heure. Pour éliminer toute trace de solvant. Relâchez le vide avec un gaz inerte.

Appliquez une fine couche de graisse silicone sur les deux côtés d’un joint en silicone, puis placez le joint sur la glissière. Laissez au moins cinq millimètres de diapositive non couverte exposée à une extrémité de la lame. Ensuite, hydratez soigneusement chaque puits en plaçant une aiguille de seringue de calibre 27 sur le bord du joint et appliquez lentement un tampon pour remplir chaque puits d’étanchéité d’environ 10 % avec trois tas millimolaires.

Une fois les lipides hydratés, passez rapidement aux étapes restantes. Étant donné que les films lipidiques commencent à se délaminer, vérifiez immédiatement le côté conducteur de la lame avec le multimètre. Appliquez ensuite la deuxième face conductrice de la glissière ITO dans le haut du joint.

Assurez-vous d’avoir au moins cinq millimètres de porte-à-faux à l’extérieur de la zone du joint et à l’opposé du premier porte-à-faux, et appuyez doucement pour assurer une bonne étanchéité. Nettoyez les deux porte-à-faux à l’aide d’éthanol. Fixez maintenant le sandwich de glissière ITO aux contacts électriques tels que les barres de cuivre ou la mousse d’étanchéité.

Ce graphique montre une vue éclatée de la chambre et de l’assemblage des contacts comme référence. Les plans détaillés peuvent être trouvés dans le protocole texte à l’aide d’un multimètre. Vérifiez qu’il n’y a pas de court-circuit électrique entre les contacts et que les contacts se connectent correctement aux surfaces ITO.

Ensuite, placez la chambre d’électroformation dans un four et chauffez la chambre à 10 degrés Celsius au-dessus de la température de fusion la plus élevée de tous les lipides présents. Mesurez l’écart entre les deux surfaces revêtues d’ITO pour déterminer l’amplitude de l’onde sinusoïdale. L’amplitude de l’onde sinusoïdale doit être d’environ 0,7 volts RMS Pour chaque espace millimétrique entre les surfaces ITO, appliquez une onde sinusoïdale de 10 hertz pendant 60 à 90 minutes.

Connectez le générateur à la chambre d’électroformation et confirmez la tension à l’aide d’un multimètre. Après 60 à 90 minutes d’électroformation, des vésicules unales géantes auraient dû se former. Utilisez un microscope inversé équipé d’un cube de filtre pour colorant rouge du Texas pour imager les liposomes.

Le liposome doit être sphérique, principalement Ella par l’œil et exempt de défauts tels que des cordes suspendues au liposome. Les étapes précédentes ont couvert la préparation classique de liposomes géants à partir de lipides purs. Une préparation plus difficile utilisant de petits liposomes est présentée.

Ensuite, préparez d’abord une solution saturée de carbonate de potassium à 44 % d’humidité relative à 20 degrés Celsius. Utilisez un contenant en plastique pour le yogourt et le granola avec une tasse supérieure emboîtable qui a été modifiée avec des trous dans la tasse supérieure. Placez la solution saline saturée et l’excès de sel dans un récipient hermétiquement hermétique avec une étagère intérieure.

Replacez l’étagère après l’avoir remplie et assurez-vous que le liquide se trouve à cinq à 10 millimètres sous l’étagère. Placez un capteur d’humidité dans une encoche sur le côté du récipient. Nettoyez les deux côtés des lames de verre revêtues d’ITO avec de l’éthanol.

Utilisez le multimètre pour déterminer quel côté est conducteur et étiquetez le côté non conducteur avec le nom de l’échantillon. Ensuite, graissez légèrement les deux côtés d’un joint en silicone à prise unique ou multiple. Placez le conducteur de la lame, placez-le sur le banc et appliquez les joints en silicone sur chaque lame sur laquelle le lipide sera appliqué.

Assurez-vous qu’il y a au moins cinq millimètres de glissière exposée à une extrémité pour se connecter à l’appareil d’électroformation. Lissez le joint pour assurer une bonne étanchéité, diluez la préparation de la vésicule dans le tampon iso modic à faible teneur en sel à environ un à deux milligrammes par millilitre. Appliquez le lipide sur la lame en gouttes d’une à 10 microlitres.

Placez la diapositive sur l’étagère intérieure au-dessus de la solution saline saturée et fermez hermétiquement le récipient. Laisser à température ambiante pendant trois heures à toute la nuit. La lame peut maintenant être utilisée pour l’électroformation de liposomes géants comme montré précédemment dans le protocole classique.

Notez l’aspect arc-en-ciel des dépôts individuels. Cette image montre des liposomes électroformés à partir de lipides déposés à partir de chloroforme, les flèches pointent vers des liposomes géants. Cette image comporte très peu de zones floues et indique ainsi une bonne préparation.

L’image suivante a de nombreuses régions floues et indique donc une préparation généralement médiocre. Notez que la flèche deux indique une région avec des liposomes difficilement distinguables et qu’aucun liposome ne peut être mis au point dans la zone indiquée par la flèche trois. On voit ici un grossissement de 10 x de liposomes électroformés avec succès à partir de lipides déposés par déshydratation de petits liposomes.

Les flèches indiquent trois liposomes de bonne qualité dont la taille varie d’environ cinq à 20 micromètres à un grossissement de 40 x. Un anneau transparent peut être vu sur le bord du liposome, ce qui indique un liposome uni ou presque lumal. Les courants ioniques TR PV one activés par la capsaïcine enregistrés dans les patchs membranaires lipidiques excisés des liposomes géants formés sont illustrés ici.

Le courant de fuite indiquait une résistance d’étanchéité de 500 méga avant l’ajout de capsaïcine. La capsaïcine saturante a activé un grand courant T RRP V. Le retour actuel à près de la ligne de base lorsque la capsaïcine est éliminée du patch lors de la tentative de cette procédure.

Il est important de rester flexible car de nombreux facteurs affectent la façon dont les lipides se déshydratent et forment un film uniforme sur le substrat de verre. Consultez notre section de dépannage en ligne et faites varier la température, l’humidité, la concentration en lipides et la taille des gouttelettes pour obtenir les meilleurs résultats.