Essai de préférence la lumière pour étudier innée et circadien Photobehavior Réglementé

L'objectif général de l'expérience suivante est de tester le comportement phototactique inné et circadien des larves de drosophile à l'aide d'un test de préférence lumière-obscurité. Pour ce faire, on élève d'abord les larves expérimentales dans des conditions lumineuses définies alternant lumière et obscurité, afin d'établir une horloge circadienne initiale chez les larves. Ensuite, les larves sont placées en obscurité constante, ce qui permet à l'horloge circadienne larvaire de fonctionner en régime libre.

Une fois parvenus au stade larvaire L3 de nourrissage, les larves sont réparties en groupes afin de tester leurs préférences lumineuses à différents moments circadiens. Les résultats obtenus montrent une préférence innée et circadienne pour la lumière, établie par le calcul d’un indice de préférence et la comparaison entre différents moments et groupes expérimentaux. Bien que cette méthode permette de mieux comprendre la régulation innée et circadienne de la détection de la lumière ainsi que le traitement du comportement photique, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes tels que l’olfaction, la mécanoréception, la chimiotaxie ou la thermotaxie.

De même, il peut être adapté pour des tests d'apprentissage et de mémoire. La procédure sera démontrée par Alina et BMA, étudiants diplômés de mon laboratoire. Pour collecter les œufs, laissez les mouches adultes s'accoupler et pondre pendant 12 heures sur des boîtes fraîches, puis transférez-les dans de nouvelles fioles. Continuez à transférer les adultes toutes les 12 heures selon un cycle de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.

Conserver les collectes d'œufs de 12 heures dans l'incubateur. Pour l'expérience, élever les animaux jusqu'au stade larvaire L3 précoce. Ce sont des larves alimentées disponibles entre 84 et 108 heures après l'œuf.

La ponte Un bon étalonnage des ELA est essentiel pour la réussite de l'expérience. Depuis la fin du troisième stade larvaire, les ELA modifient leur comportement visuel afin de tester les composantes circadiennes du comportement visuel. 48 heures avant le test et juste avant l'aube subjective des larves, placer les larves recueillies dans une boîte en carton.

Ensuite, transférez la boîte dans un incubateur à obscurité constante pendant 48 heures jusqu'à l'expérience ; les larves doivent rester indisturbées dans leur espace dédié. Préparez le couvercle d'une boîte de Petri de neuf centimètres en utilisant un carré de 20 centimètres divisé en quatre quadrants. À titre indicatif.

Collez des carrés de 10 centimètres de papier d'aluminium sur des cadrans opposés et recouvrez-les de ruban noir. Veillez à couvrir le bord du couvercle. Ensuite, collez un carré de 20 centimètres divisé en quatre cadrans sous la source lumineuse sur la table.

Marquez la circonférence d'une boîte de culture sur la feuille afin de servir de guide pour un déplacement constant. Installez une lampe LED au-dessus de la boîte de Petri à l'aide d'un support en fer. Réglez la hauteur de manière à ce que toute la plaque de test soit uniformément éclairée.

Réglez l'intensité lumineuse sur un site de test entre 350 et 760 lux en ajustant davantage la hauteur de la lampe ou en utilisant une alimentation réglable. La salle d'expérience doit être éclairée avec une lumière rouge et présenter la même température que l'endroit où les animaux sont élevés. Les flacons sont élevés pendant deux jours en obscurité constante.

Prélevez la lave présente dans leur nourriture à l’aide d’une spatule dans les cinq millimètres supérieurs de la nourriture. Étalez la nourriture sur la face externe du couvercle d’une boîte de Pétri. Ajoutez un peu d’eau à la nourriture et mélangez délicatement à l’aide de la spatule.

Ajoutez une goutte d'eau du robinet dans une nouvelle boîte à culture à l'aide d'un pinceau. Transférez les larves dans la goutte d'eau pour les laver. Utilisez ensuite un pinceau humide pour récupérer les larves.

Sélectionnez uniquement les larves L3 en phase alimentaire précoce et évitez les larves L3 en phase de migration tardive. Transférez les larves sélectionnées au centre d'une plaque de test. Les larves L3 en phase alimentaire présentent des sphériques antérieurs ouverts et proéminents vers l'extérieur.

Sous forme de doigt. Les sphériques postérieurs possèdent chacun trois ouvertures et quatre groupes de longs poils ramifiés. Les glandes salivaires s'étendent jusqu'au deuxième segment abdominal.

Une fois 30 larves placées au centre de la plaque de test, couvrez-la avec le couvercle préparé. Allumez la lampe LED. Démarrez un minuteur et laissez les larves se déplacer librement sur la plaque pendant cinq minutes.

Ensuite, retirez rapidement le couvercle et comptez le nombre de larves dans les quadrants sombres et éclairés. Marquer la position de chaque larve peut faciliter le comptage. Une photographie rapide peut également aider. Les larves présentant une préférence lumineuse peu marquée, comme celles qui rampent sur les parois ou s’enfoncent dans l’agar, doivent être comptabilisées comme ayant une préférence neutre et ajoutées au nombre total de larves lors du calcul de l’indice de préférence pour la lumière.

Après avoir compté les larves, jetez la plaque et utilisez une nouvelle plaque de test pour l'expérience suivante. Après avoir effectué de 10 à 15 essais par génotype, procédez à l'analyse conformément au protocole. La préférence lumière/obscurité des larves Canton ES a été comparée à deux moments circadiens différents.

Les CT zéro et CT 12 correspondent subjectivement aux larves de l'aube et du crépuscule, ou bien celles-ci sont maintenues 48 heures dans des conditions standard avant d'être transférées en obscurité continue pendant trois jours. Un test en lumière-obscurité à 350 lux a révélé que la photosensibilité à la lumière était plus élevée chez les larves testées au CT zéro par rapport à celles testées au CT 12. Selon cette formule, la préférence pour l'obscurité des larves au CT zéro était de 0,52 contre 0,36.

Les larves CT 12 comparées selon les indices à l'aide d'un test de Wilcoxon produisent une valeur P significative de 0,023. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment tester la préférence pour la lumière des larves troph à différents circuits et moments. Vous devriez être en mesure de synchroniser des larves troph au stade F3, tester leur comportement photophobe et calculer l'indice de préférence pour la lumière afin de procéder à des comparaisons statistiques.