La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l'imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser la migration de cellules dendritiques vers le ganglion lymphatique drainant à l'aide d'une imagerie par résonance magnétique fluorée non invasive, ou IRM, combinée à une imagerie par résonance magnétique conventionnelle à proton. Ceci est réalisé en préparant d'abord des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse murine, puis en marquant les cellules entièrement différenciées avec des particules riches en fluor. Lors d'une deuxième étape, les cellules marquées au fluor sont administrées par voie intracutanée dans les membres postérieurs d'une souris, assurant ainsi une transmigration efficace des cellules administrées.

Ensuite, la région anatomique d'intérêt est imagée par résonance magnétique nucléaire au fluor et au proton afin de suivre la migration des cellules dendritiques depuis la peau jusqu'aux ganglions lymphatiques drainants. En fin de compte, la migration des cellules dendritiques depuis le site d'application vers le ganglion lymphatique drainant peut être visualisée par imagerie par résonance magnétique au fluor. Le principal avantage de cette méthode par rapport à d'autres techniques de traçage cellulaire, comme celles faisant appel à des nanoparticules d'oxyde de fer, réside dans le fait que le fluor lié au carbone est pratiquement absent de tous les organismes vivants.

Cela permet d'obtenir des images entièrement exemptes de fond et une sélectivité cellulaire complète après l'administration de cellules marquées au fluor en conditions in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de l'immunologie, comme par exemple quelle est l'influence de candidats moléculaires sur la migration des cellules dendritiques in vivo. La mise en œuvre de la méthode est démontrée par Yulia Kovski, technicienne, et Helma VIIs, scientifique confirmée de mon laboratoire, au jour 10 de la culture de cellules dendritiques à partir de moelle osseuse.

Activer les cellules dendritiques avec du LPS pendant 24 heures. Marquer les cellules dendritiques avec des particules de perfluoro 15 crown cinq éther riches en fluor à une concentration de un millimolaire pendant cette période. Pour confirmer que les cellules dendritiques ont été correctement marquées, analyser les caractéristiques physico-chimiques des cellules par cytométrie en flux. Les cellules marquées au fluor sont représentées ici par des événements rouges sur le diagramme de dispersion avant et latéral, tandis que les cellules non marquées apparaissent en bleu.

Placez ensuite une souris C57 noire six dans un support, puis chargez une seringue tuberculinique de 0,5 ml équipée d'une aiguille de calibre 26 et demi avec des cellules dendritiques marquées au fluorochrome, dans un volume de 50 à 100 microlitres. Insérez maintenant délicatement l'aiguille dans les couches supérieures de la peau de chacun des membres postérieurs de l'animal afin d'administrer les cellules. Après anesthésie de la souris, positionnez l'animal en décubitus ventral sur le lit pour souris du scanner IRM pour petits animaux.

Après avoir fixé l'animal sur le support d'imagerie et raccordé les connexions au système de surveillance, déplacer le support au centre de la bobine RF proton-fluor pour confirmer le positionnement correct de l'animal et du scanner, puis pour planifier ultérieurement la géométrie des coupes d'image. Acquérir des images préliminaires selon trois orientations standard à l'aide de méthodes d'acquisition d'images rapides et à faible résolution dans le logiciel du scanner IRM.

Régler la bobine RF à la fréquence de résonance du proton et à la fréquence de résonance du fluor. Utiliser le moniteur de réglage du scanner IRM pour animaux afin d'ajuster l'impédance caractéristique de la bobine à 50 ohms. Ensuite, configurer les paramètres nécessaires des systèmes automatiques, notamment le shiming pour affiner l'homogénéité du champ magnétique, des ajustements de fréquence du système pour régler la RF à la fréquence spécifique du LA du système IRM pour les protons et le gain de référence.

Pour régler l'amplitude de l'impulsion RF, configurez un protocole turbo rare en 3D pour l'acquisition protonique, en utilisant un TR de 1500 millisecondes et un TE de 53 millisecondes, une matrice de 400 par 200 par 200 et un facteur rare de 16. Ajustez le champ de vision à l'aide des images pilotes. Lancez ensuite l'acquisition.

Chargez une séquence FID à impulsion unique avec un TR d'au moins 1000 millisecondes, puis ouvrez l'analyse et réglez le noyau sur fluor dans la méthode d'édition de la boîte à outils. Désactivez le gain de référence automatique à l'aide de l'option go setup. Démarrez la mesure sans enregistrer les données afin d'afficher un signal IRM en temps réel.

Réglez la fréquence de base afin de centrer le pic spectral du fluor à zéro hertz dans la fenêtre d'acquisition. Ensuite, sélectionnez, appliquez la fréquence de base puis arrêtez maintenant. Clonez le protocole turbo rare 3D à partir du scan proton précédent.

Accédez à la méthode d'édition, puis désélectionnez le gain de référence automatique comme indiqué précédemment dans l'édition du balayage. Sélectionnez le noyau de fluor, puis modifiez la matrice à 1 28 par 64 par 64 et le facteur de rareté à au moins 40. Lorsque les balayages sont terminés, retirez le support de souris du scanner IRM et utilisez le menu Affichage pour superposer les images de fluor aux images de proton.

Après avoir sacrifié la souris, retirer le ganglion lymphatique poplité d'intérêt et le placer dans un tube RMN de cinq millimètres contenant 100 microlitres de PFA à 2 %. Ensuite, insérer le tube à l'intérieur d'une bobine de spectroscopie de fluor et déplacer la bobine au centre ISO de l'aimant. Régler la bobine RF à la fréquence de résonance du fluor, puis, sur le moniteur de réglage du scanner IRM animal, adapter l'impédance caractéristique de la bobine à 50 ohms à l'aide de la boîte à outils de shimming.

Réglez tous les paramètres de shim à zéro et cliquez sur appliquer. Ensuite, chargez une séquence FID à impulsion unique avec un TR d'au moins 1000 millisecondes. Ouvrez l'édition de scan et réglez le noyau sur fluor.

Maintenant, à l'aide de la configuration automatique, démarrez la séquence, réglez la fréquence de base de manière à ce que le pic spectral du fluor soit au centre de la fenêtre d'acquisition à zéro hertz, puis appliquez la fréquence de base. Ensuite, réajustez l'atténuateur d'impulsion afin de maximiser le signal pour atteindre une excitation de 90 degrés. Lorsque le signal est maximal, appuyez sur arrêt.

Enfin, dans la méthode d'édition, réglez les moyennes entre 64 et 256 selon le signal, puis utilisez le pipeline go. Démarrez l'acquisition 18 à 21 heures après l'application intracutanée. Les cellules dendritiques marquées au fluorin migrent vers le ganglion lymphatique poplité drainant.

Le déplacement des cellules dendritiques à travers les canaux lymphatiques vers le ganglion lymphatique drainant peut être observé en superposant les images anatomiques protoniques aux cellules dendritiques fluorées. Sur les images, les cellules dendritiques apparaissent comme un signal fluoré en IRM en rouge, tandis que les ganglions lymphatiques et les canaux lymphatiques sont représentés sur l’image protonique anatomique en IRM en niveaux de gris. Afin de quantifier l’ampleur de la migration des cellules dendritiques vers les ganglions lymphatiques drainants, les ganglions sont extraits et une spectroscopie par résonance magnétique fluorée (RMF) est réalisée comme vient de l’être démontré ; le signal fluoré obtenu à partir de chaque ganglion lymphatique est comparé au signal fluoré provenant de différents nombres de cellules dendritiques marquées par des particules d’éther pentafluorocrown-15, comme illustré par cette courbe d’étalonnage, permettant ainsi de déduire le nombre de cellules dendritiques marquées au fluor qui atteignent le ganglion lymphatique drainant dans cette expérience représentative.

On peut estimer que 7,5 × 10⁴ cellules dendritiques non chargées en antigène ont atteint le ganglion lymphatique gauche, tandis que 3,6 × 10⁵ cellules dendritiques chargées en antigène sont parvenues au ganglion lymphatique droit. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les mécanismes moléculaires de la migration des cellules immunitaires en conditions normales, elle peut également être utilisée dans des modèles animaux, tels que ceux des maladies auto-immunes. En outre, les implications de cette technique s'étendent au domaine de la thérapie anticancéreuse.

Toutes les cibles moléculaires identifiées peuvent être utilisées pour manipuler les cellules dendritiques dans le cadre d'un traitement tumoral.