Name: Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Découvrez l'isolation de myofibres squelettiques chez Danio rerio embryonnaires et larvaires. Cette technique permet l'analyse détaillée de la morphologie et de la localisation protéique au niveau des fibres musculaires individuelles.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, et William Telfer) qui ont contribué au développement de la technique et de la production du manuscrit. Ce travail a été financé par l&#39;Institut Taubman, le département de pédiatrie de l&#39;Université du Michigan, et en partie par des dons de la Muscular Dystrophy Association (JJD MDA186999) et les National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).

Une. lamelles de préparation de poly-L-lysine couché (Durée: 1 h) lamelles de revêtement permet le tassement des fibres musculaires rapides et l&#39;adhérence. Cela peut être effectué au cours de l&#39;étape de dissociation de l&#39;isolement de fibres musculaires (étape 2 ci-dessous). <ol><li> Couper et placer Parafilm sur le fond d&#39;un plat de 60 mm de Pétri (toute marque). </li><li> Placer des bordereaux de verre de couverture de microscope (diamètre 12 mm) sur Parafilm dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm ou de les placer individuellement dans des puits individuels de plaques à 24 puits. </li></ol> Note 1: Ces petites lamelles rondes aident à concentrer le nombre des fibres musculaires et réduire l&#39;utilisation de l&#39;excès d&#39;anticorps. Note 2: D&#39;autres lamelles de taille vont travailler, mais les volumes de réactifs et d&#39;embryons utilisés devront être ajustés en conséquence. <ol start="3"><li> Introduire à la pipette 50 à 200 ul de solution de poly-L-lysine (0,01%) sur chaque lamelle couvre-objet dans la boîte de Pétri. </li><li> Autoriser les lamelles de s&#39;asseoir au moins un hour à 37 ° C. Incubations plus longues ne seront pas influencer négativement les résultats. </li><li> Retirer poly-L-lysine solution du couvercle en verre et laver deux fois avec un minimum de 100 pi 1x PBS. </li><li> Permettre aux lamelles de sécher. </li><li> Lamelles sont maintenant prêts pour les fibres musculaires. </li></ol> Note 3: Afin de garantir la stérilité, le revêtement peut être fait dans une hotte et sur des lamelles en autoclave. Note 4: Gardez la boîte de Pétri de 60 mm avec du Parafilm sur le fond. Cette configuration sera utilisée pendant myofiber placage et immunomarquage (plus tard étapes). Variante 1: Au lieu de lamelles de revêtement immédiatement avant de les utiliser, une lamelle de papier couché peut être utilisé. Un plat de 60 mm de Pétri contenant un minimum de 2 ml de poly-L-lysine peut être conservé à 4 ° C contenant de nombreuses lamelles. Avec cette alternative commencer à l&#39;étape 1.5 pour traiter les lamelles de fibres musculaires. Alternative 2: Nous avons également des lamelles de manteau en poly-L-ornithine. Tson est plus de travail, mais est utile pour plus de culture terme parce lamelles revêtues de poly-L-ornithine peut être traité anti-UV. Avec un traitement UV et technique stérile attention myofibers vivants peuvent généralement être maintenues en culture provenant 4-7 jours. 2. La dissociation des embryons de poisson zèbre et de placage de fibres musculaires (Durée: 1 à 3 heures) Remarque: le protocole standard s&#39;applique le mieux à 3 dpf (jours après la fécondation) des embryons. <ol><li> Transfert d&#39;embryons de poisson zèbre dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse standard et éliminer autant d&#39;eau de poissons excès que possible. Typiquement, 10 à 20 embryons par tube, bien que moins peuvent être utilisés. Utilisation de plus de 20 à 25 embryons se traduit souvent par une préparation de densité excessive. <ol><li> Retirer chorions avant dissociation, manuellement à l&#39;aide # 5 forceps. En variante, l&#39;élimination du chorion chimique est réalisée avec un traitement Pronase 10-15 min. En règle générale, la suppression de la précédente chorion n&#39;est nécessaire que si la confirmation préalable d&#39;un mutphénotype fourmi ou la morphologie est nécessaire, ou lorsque vous utilisez les stades où les embryons sont naturellement éclosion de leur chorion. </li></ol></li><li> Ajouter 900 pi de CO 2 médias indépendants dans le tube contenant les embryons. </li><li> Ajouter 100 pi de type II de la collagénase, concentration finale de 3,125 mg / ml (solution mère de la collagénase à 31,25 mg / ml dilué dans du PBS 1X) pour commencer la dissociation. Collagénase IV peut également être utilisé pour la dissociation. </li><li> Faire tourner les embryons sur un agitateur orbital, et triturer toutes les 30 min à température ambiante en utilisant un Pipetman P1000 pour la trituration. </li></ol> Note 2: Surveiller attentivement embryon dissociation; plus ou moins de dissociation (surtout plus) sont les raisons les plus fréquentes de l&#39;échec du protocole. Temps pour la digestion varie en fonction de l&#39;intensité de trituration, nombre d&#39;embryons par tube, et l&#39;âge de l&#39;embryon. Il est également souvent moins (par rapport au type sauvage) à partir d&#39;embryons mutants du muscle squelettique. Remarque3: temps de digestion moyen par âge de l&#39;embryon: 1 dpf = 1 h, 2 dpf = 1,5 h, 3 dpf = 2 h et 4 dpf = 2-2,5 h. <ol start="5"><li> Arrêtez la digestion quand aucun des embryons entiers sont visibles, mais des morceaux solides sont encore visibles - ce qui est essentiel pour éviter une digestion excessive. </li><li> Tubes à centrifuger avec des embryons dissociées à 0,8 à 2,3 g pendant 3-5 min à culot de cellules. </li><li> Retirer le surnageant de culot de cellules et laver 2x CO 2 médias indépendants. </li><li> Ajouter CO frais 2 médias indépendants à remettre les cellules. 1 ml est généralement utilisé pour préparations de 10-20 embryons. Le volume peut être adapté en fonction du nombre d&#39;embryons. </li><li> Avec une pipette P1000, passer embryon suspension à travers un filtre de 70 um. Cela permet de supprimer les débris indésirables de la préparation. </li></ol> Note 4: Embryon suspension peut être filtrée une seconde fois à travers un filtre de 40 um pour éliminer davantage les débris indésirables. D&#39;une double filtration, la récupération est approximdiatement 800 ul d&#39;un volume initial de 1 ml. <ol start="10"><li> Ajouter environ 50 à 100 ul de suspension de fibres musculaires à chaque lamelle couvre-objet revêtues de poly-L-lysine. </li></ol> Note 5: Effectuer l&#39;étape 2.9 dans les boîtes de Pétri avec du Parafilm sur le fond, préalablement préparé. Le Parafilm maintient la suspension de fibres musculaires de courir au large des lamelles recouvertes. Gardez boîtes de Pétri couverts pour éviter l&#39;évaporation. <ol start="11"><li> Permettent de régler les fibres musculaires d&#39;environ 1 heure sur les lamelles recouvertes à la température ambiante. </li></ol> Note 6: les fibres musculaires commencent à s&#39;installer dans 5-10 min. Cependant, pour une bonne fixation de fibres musculaires, un minimum de 1 heure (1-2 heures) est recommandé. Permettre fibres musculaires à se contenter de plus ne nuira pas à la préparation. Pour les incubations plus longues (y compris la nuit), les antibiotiques peuvent être ajoutés aux médias. Avec des antibiotiques et technique stérile cultures vivantes peuvent généralement être conservés pendant 1-2 jours. <ol start="12"><li> Direct myofibers peut être observé à ce stade. Fibres musculaires à partir d&#39;embryons 2 dpf et plus tard sera considéré comme cellules striées et allongées (figure 1). À ce stade, les fibres musculaires sont maintenant prêts pour l&#39;analyse en temps réel ou pour immunomarquage. </li></ol> Note 7: Le muscle squelettique de 1 dpf embryons ne pas plaquer les fibres allongées et clairement que striés. Au lieu de cela, les grandes myoballs sont visibles. En outre, au cours de l&#39;après dissociation de phase de granulation (étape 2.6), 1 dpf myoballs doivent être centrifugé pendant un minimum de 8 min à 5000 xg pour obtenir une pastille. Pour l&#39;analyse des embryons à ce stade, il est recommandé d&#39;utiliser la lignée transgénique exprimant EGFP spécifiquement dans le muscle squelettique 23. Ceci permettra l&#39;identification des cellules d&#39;origine musculaire par rapport à d&#39;autres sources. 3. Fluorescence Immunocoloration dissociées de poisson-zèbre fibres musculaires (Durée: environ 1 jour) 3.1. Immunomarquage <ol><li> Retirez une partie demédias de fibres musculaires adhéré à la lamelle enduit </li><li> Fixer les cellules en utilisant 4% de paraformaldéhyde ou le méthanol. Pour PFA, retirez ½ le volume des médias et la remplacer par la même quantité de PFA. Fixer pendant 10 min à température ambiante, puis retirez volume total, le remplacer par 50-100 ul de PFA, et fixer pour 10 min de plus. Pour la fixation de l&#39;alcool, de la glace ou de l&#39;acétone methanol froid peut être appliqué à 4 ° C pendant 10 min ou 5 min, respectivement. </li><li> Laver les fibres musculaires au moins 3-5x avec PBS 1x ou 1x PBS plus 0,1% de Tween. Volume de lavage moyenne est de 50-100 ul par lamelle. </li><li> Ajouter une solution de blocage de fibres musculaires (langue de travail) et incuber 20-60 min à température ambiante. La solution de blocage varie en fonction de l&#39;anticorps primaire et secondaire. Les deux plus couramment utilisé dans le laboratoire sont (1) 1x PBS, 2 mg / ml de BSA, sérum de mouton de 1%, 0,25% de Triton X-100 final et (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) et 5% de sérum ovins / caprins. </li><li> Retirer la solution de blocage et ajouter anticorps primaire dilué dans les deux bsolution PBS ou de verrouillage. Incuber myofibres pendant une nuit à 4 ° C. Assurez-vous que soit Parafilm ou l&#39;envelopper dans du Saran la boîte de Pétri contenant les lamelles de fibres musculaires chargé recouvertes d&#39;anticorps. De petits morceaux de serviettes en papier humidifiées peuvent être ajoutées pour créer une chambre humidifiée. </li><li> Eliminer l&#39;anticorps primaire de lamelles et laver lamelles 3-5x pendant 5 min avec du PBS ou solution de blocage. </li><li> Ajouter anticorps secondaire à une concentration appropriée dilué dans PBS 1x ou solution de blocage pendant 1-2 heures à la température ambiante. </li><li> Eliminer l&#39;anticorps secondaire et laver les fibres musculaires 3-5x dans du PBS pendant 5 min chaque à température ambiante. </li></ol> 3.2. Des lamelles de montage <ol start="9"><li> Appliquer 1-2 gouttes de réactif de antifade sur une lame de microscope. </li><li> Pick-up soigneusement la lamelle enduit et immunolabled aide d&#39;une pince et le lieu (fibres musculaires vers le bas) de la lamelle sur le réactif de antifade sur la lame de microscope. </li></ol> Remarque 1: Attention à l&#39;orientation de la clamelle oated est critique. <ol start="11"><li> Posez 1-2 Kimwipes sur une surface solide dur. Inverser rapidement la lame avec les lamelles recouvertes reposant sur le réactif de antifade et placez-le (lamelle vers le bas) sur la Kimwipes. </li><li> Appliquer une légère pression sur les coins de la lame de microscope pour éliminer l&#39;excès antifade et former un joint étanche entre la lame et lamelle </li><li> Permettre la antifade restant à sécher pendant 5-10 min à température ambiante, puis les fibres musculaires sont prêts à l&#39;image (Figures 2A et B) ou conserver à 4 ° C. </li></ol> 4. Imagerie de cellules vivantes de calcium Utilisation GCaMP3 Expériences sur des cellules vivantes peuvent être effectuées sur les fibres musculaires avant la fixation (ci-après l&#39;étape 2.10). Le protocole suivant décrit l&#39;imagerie en direct dans les fibres musculaires exprimant GCaMP3 24, un indicateur de calcium codé génétiquement, exprimée par le α-actine poisson zèbre promoteur spécifique du muscle squelettique (PSKm) 23. Autrement,cette technique peut facilement être adapté pour utiliser des colorants indicateurs de calcium tels que Fura-2. <ol><li> Injecter embryons de PSKm: GCaMP3 construire au stade 1-2 cellules </li><li> A 3 dpf, recueillir les larves et préparer les fibres musculaires comme décrit dans les sections 1 et 2. Permettre aux fibres musculaires d&#39;adhérer pour un minimum de 1 heure. Pour cette technique, la préparation des lamelles dans des boîtes de 24 puits sont nécessaires. </li><li> Retirez délicatement le support en trop, et ajouter 300 ul de frais CO 2 médias indépendants à la température ambiante. </li><li> Respecter les cellules sous un microscope inversé. Myofibres positives GCaMP3 doivent être visibles sous fluorescence verte. </li><li> Mettre en place la caméra pour l&#39;enregistrement, si vous le souhaitez. </li><li> Préparer une solution de caféine 30 mM de CO 2 médias indépendants. Pour stimuler les cellules, la pipette doucement 300 pi de solution de caféine dans le puits à la loupe. Dans 5-10 sec, les fibres musculaires positives GCaMP doivent répondre à la caféine à une augmentation rapide de la fluorescence (figure 3). Myofibteurs peuvent aussi contracter. Fait à noter, la caféine induit la libération de calcium dans les magasins du réticulum sarcoplasmique 25. D&#39;autres agents, tels que KCl 26 et ryanodine 4, peuvent être utilisés pour étudier la libération de calcium inductible. </li></ol>

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<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li>
<li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li>
<li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li>
<li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li>
<li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Ca2%2B-conducting+Ca2%2B+channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflits d&#39;intérêts.

Le poisson zèbre est un système de modèle vertébré puissant pour étudier le développement musculaire et la fonction in vivo en 25,27,28. Ils ont également vu comme un atout précieux pour la modélisation de maladies musculaires humaines 14,15,20,29. Si de grands progrès ont été prises pour promouvoir l&#39;utilisation et l&#39;application de poisson zèbre pour l&#39;étude de la fonction musculaire et la maladie du muscle, il ya un besoin critique constante de développer des outils qui perme...

Le muscle squelettique est un tissu hautement spécialisé chargé de générer les forces nécessaires à la motilité contractile. Contraction est initiée par un processus connu sous le nom excitation-contraction (CE) de couplage qui convertit les signaux électriques à la libération de calcium des réserves intracellulaires 1,2. La libération de calcium intracellulaire active le sarcomère à raccourcir et à générer de la force. Les nombreux éléments spécifiques de la machinerie moléculaire responsable de la médiation transmission de la jonction neuromusculaire 3, le couplage CE 4,5, et l&#39;actine-myosine contractions dépendantes 6 continuent à être l&#39;objet permanent de recherche intense. En outre, les protéines qui stabilisent la membrane du muscle lors de la contraction de 7,8 et que la signalisation entre le myofiber et la matrice extracellulaire 7,9 médiate ont été identifiés et étudiés dans les moindres détails. Des mutations dans un certain nombre de gènes importants pour la structure d&#39;un musclefonction e ont été identifiés comme causes de maladies musculaires squelettiques humaines ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Ces maladies, classés largement que myopathies squelettiques et les dystrophies musculaires basés sur les caractéristiques cliniques et histopathologiques, sont associées à une faiblesse musculaire, une incapacité permanente, et au début de 10,11 de mortalité. Le poisson zèbre s&#39;est avéré être un excellent système pour la modélisation et l&#39;étude des maladies des muscles squelettiques humains 8,12,13. Il a été utilisé pour valider de nouvelles mutations génétiques 8, définir de nouveaux aspects de la maladie physiopathologie 14,15, et d&#39;identifier de nouvelles approches thérapeutiques 15,16. La puissance de poisson zèbre pour étudier la maladie du muscle humain concerne le grand nombre d&#39;enfants, le développement rapide de la structure musculaire et de la fonction, la clarté optique de l&#39;embryon de poisson zèbre, et la facilité de la manipulation génétique et pharmacologique du zèbre en développementpoissons 17. Nous et les autres 12,18,19 avons récemment développé une technique simple pour l&#39;isolement rapide et efficace des fibres musculaires du poisson zèbre en développement. Cette méthodologie a permis l&#39;examen des fibres musculaires plus en détail que peut être fournie par l&#39;analyse de l&#39;embryon entier. La technique a été exploitée pour la caractérisation de la protéine 20 localisation sous-cellulaire ainsi que pour l&#39;identification des caractéristiques histopathologiques importants dans le cadre d&#39;études de validation dans des modèles de maladie nouvellement mis au point 21. En outre, les fibres musculaires isolées peuvent en outre être utilisés pour l&#39;imagerie en direct et pour les études électrophysiologiques 22, les techniques qui permettent d&#39;interroger les principaux aspects de la fonction musculaire. Le protocole spécifique pour l&#39;isolation des fibres musculaires, ainsi que deux exemples d&#39;expériences analytiques ultérieurs, est détaillé dans les parties restantes de ce manuscrit.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture 24 puits</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Milieu indépendant</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type II</td><td>Worthington</td><td>Biochemical LS004186</td><td>Lot 41H12764</td></tr><tr><td>Collagénase Type IV</td><td>Worthington</td><td>Biochemical L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8 % Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de mouton</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de protection en verre</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; m Filtre</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; m Filtre</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold réactif anti-décoloration</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-&alpha ;-actinine</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-RYR</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor</td><td>anticorps Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 60 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Le poisson zèbre s&#39;est révélé être un système de modèle utile pour explorer la fonction des muscles squelettiques et pour l&#39;étude de maladies musculaires humaines. Malgré les nombreux avantages offerts par l&#39;analyse in vivo du muscle squelettique chez le poisson zèbre, visualiser le milieu complexe de protéines et finement structuré responsable de la fonction musculaire, en particulier dans les embryons entiers, peut être problématique. Cet obstacle tient à la petite taille du muscle squelettique poisson zèbre (60 um) et la taille encore plus petite du sarcomère. Ici, nous décrivons et démontrons une méthode simple et rapide pour isoler les fibres musculaires squelettiques à partir d&#39;embryons de poisson zèbre et de larves. Nous incluons également des protocoles qui illustrent les techniques de préparation soumettre utiles pour analyser la structure et la fonction musculaire. Plus précisément, nous détaillons la localisation immunocytochimique ultérieure des protéines du muscle squelettique et l&#39;analyse qualitative de la libération de calcium stimulée par l&#39;imagerie en direct de calcium de la cellule. Dans l&#39;ensemble, cette vidéoarticle fournit une méthode straight-forward et efficace pour l&#39;isolement et la caractérisation des fibres musculaires squelettiques de poisson zèbre, une technique qui permet une conduite pour des études ultérieures myriade de structure et la fonction musculaire.

Immunomarquage fluorescent de fibres musculaires (figure 2) Images montrant motif de marquage fluorescent attendu de fibres musculaires immunocolorées après isolement succès et le placage. Les fibres musculaires ont été marquées avec soit anti-récepteur de la ryanodine (1:100) (figure 2A) ou l&#39;anti-α-actinine (1:100) (Figure 2B), les anticorps, et révéler l&#39;immunomarquage de la triade et le Z-bande, respectivement. Anticorps...

Poisson zèbre sont d&#39;un nouveau système pour la modélisation de maladies humaines du muscle squelettique. Nous décrivons une méthode rapide et efficace pour isoler les fibres musculaires des muscles squelettiques de poisson zèbre embryonnaire et larvaire. Cette méthode produit une préparation de haute densité myofiber approprié pour l&#39;étude de la morphologie unique de fibres de muscle squelettique, la localisation subcellulaire des protéines, et la physiologie des muscles.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler efficacement des fibres musculaires squelettiques à partir d'embryons et de larves de poisson zèbre. Cette isolation est réalisée en préparant tout d'abord des lamelles recouvertes de poly-L-lysine, puis en dissociant les embryons de poisson zèbre âgés d'un à quatre jours après la fécondation. Ensuite, les fibres myo isolées à partir des embryons dissociés sont mises en culture sur les lamelles de polylysine.Enfin, les fibres myo sont fixées, colorées et observées afin d'analyser les protéines musculaires. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant la localisation subcellulaire des protéines musculaires par microscopie d'immunofluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse de l'embryon entier, réside dans sa capacité à permettre l'étude de la morphologie et de la physiologie des fibres musculaires individuelles avec un plus grand niveau de détail.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine musculaire, notamment celles relatives à la localisation protéique subcellulaire, et elle peut être combinée à l'imagerie calcique en temps réel sur cellules vivantes. Les implications de cette technique s'étendent à la validation de modèles de poisson-zèbre de maladies musculaires, car elle permet de visualiser des anomalies structurelles pathognomoniques associées aux maladies humaines. Elle peut également être utilisée pour aider à identifier de nouveaux aspects des maladies musculaires.La pathogenèse par cette méthode peut fournir des informations sur la structure et la fonction musculaires. Elle peut également être appliquée à d'autres études, telles que les maladies du muscle squelettique humain. Pour se préparer à la dissociation d'embryons de poisson zèbre, préparez des lamelles en les découpant et en plaçant du parfum sur le fond d'une boîte de Pétri de 60 millimètres.Ensuite, placez des lamelles en verre sur le parfum et déposez à la pipette 50 à 200 microlitres de solution de polylysine sur chaque lamelle. Incubez les lamelles à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure avant de retirer la solution de polylysine et de les laver deux fois avec 100 microlitres de PBS. Laissez les lamelles sécher, puis conservez-les dans une boîte couverte.Pour la dissociation des embryons. Transférez les embryons de zebrafish de 10 à 23 jours post-fécondation dans un tube de centrifugeuse standard de 1,5 millilitre et retirez autant que possible l'excès d'eau de poisson. Ajoutez 900 microlitres de milieu indépendant au dioxyde de carbone dans le tube à l’aide d’une pipette.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de collagénase à 3,125 milligrammes par millilitre, solution deux ou quatre, pour commencer la dissociation. Faites tourner les embryons sur un agitateur orbital à température ambiante et, toutes les 30 minutes, utilisez une pipette P1000 pour agiter l'échantillon afin d'éviter une sur-digestion, lorsque plus aucun embryon entier n'est visible, mais que des morceaux solides sont encore présents. Arrêtez la réaction en centrifugeant les échantillons à 0,8 à 2,3 G pendant trois à cinq minutes.Éliminer le surnageant et laver deux fois avec un milieu indépendant de dioxyde de carbone. Faire passer la suspension à travers un filtre de 70 micromètres pour éliminer les débris, en ajoutant environ 50 à 100 microlitres de suspension de myofibres sur chaque lamelle recouverte de poly-L-lysine. Laisser les myofibres se déposer pendant une heure à température ambiante, puis fixer et étiqueter immunologiquement les myofibres selon le protocole décrit dans le texte avant de monter.Les lames couvre-objets en appliquant d'abord une à deux gouttes de réactif Antifa sur une lame. Utilisez une pince pour saisir délicatement une lame couvre-objets, retournez-la et placez-la sur les gouttes de réactif anti-décoloration déposées sur la lame de microscope. Ensuite, posez une à deux feuilles de papier absorbant sur une surface dure et plane, puis retournez rapidement la lame sur le papier absorbant.Appliquez une légère pression sur les coins de la lame pour éliminer l'excès de réactif Antifa et former un joint étanche entre la lame et la lamelle. Laissez sécher les lames de cinq à dix minutes à température ambiante avant l'analyse, ou conservez-les à quatre degrés Celsius. Ce qui est montré ici, des myofibres marquées immunofluorescentes contre le récepteur anodyn et l'alpha-actinine révèlent respectivement le triade et la bande Z.Nous avons utilisé des fibres myop en isolation dans des études antérieures afin de déterminer la localisation subcellulaire des protéines musculaires. L'objectif est d'étudier la localisation de transgènes chimériques exprimés et de définir des paramètres spécifiques des fibres musculaires, notamment leur taille. Cette figure illustre une libération normale de calcium induite par la caféine dans des fibres myop exprimant le construit PSKM GCaMP trois.La technique décrite dans le protocole textuel peut être utilisée pour interroger l'appareil de couplage excitation-contraction par imagerie en direct en suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que l'imagerie calcique en direct, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'existence de défauts dans le couplage excitation-contraction après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les maladies musculaires pour explorer des études de validation de gènes de maladies musculaires récemment identifiés et déterminer de nouveaux aspects de la pathogenèse des maladies musculaires.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler le FBS doux individuel des embryons de poisson zèbre.

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mesures de force peuvent être utilisés pour démontrer les changements de la fonction musculaire en raison du développement, les blessures, la maladie, le traitement ou la toxicité chimique. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour mesurer la force lors d'une contraction maximale du poisson zèbre muscles du tronc larvaire.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Le poisson-zèbre est maintenant un outil établi et puissant pour modéliser les dystrophies musculaires, les myopathies congénitales et les maladies neuromusculaires associées. La biréfringence et le comportement d’évasion évoqué par le toucher sont deux tests non invasifs courants utilisés pour déterminer le degré de désorganisation musculaire et de déficience locomotrice des embryons de poisson-zèbre au cours du développement précoce.

Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile

Dans cette étude, nous décrivons une méthode simple pour effectuer une analyse Evans Blue Dye (EBD) sur des larves de poisson-zèbre.  Cette technique est un outil puissant pour la caractérisation de l’intégrité des muscles squelettiques et la délimitation des modèles de dystrophie musculaire chez le poisson-zèbre, et constitue une méthode précieuse pour le développement de nouvelles thérapies.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

Les poissons-zèbres sont un excellent modèle pour étudier la fonction musculaire et les maladies. Au début de l’embryogenèse, le poisson-zèbre commence à contracter régulièrement ses muscles, produisant un comportement de nage rythmé, qui est modifié lorsque le muscle est perturbé. Nous décrivons ici un test de réponse et de locomotion évoquée par le toucher pour examiner les performances de natation comme mesure de la fonction musculaire.

Utilisation de la réponse tactile évoqué et Locomotion essais pour évaluer la performance de la fonction musculaire et en Zebrafish

L’analyse par éléments finis est un outil fréquemment utilisé pour étudier les performances mécaniques des structures sous charge. Ici, nous appliquons son utilisation à la modélisation de la biomécanique de la mâchoire du poisson-zèbre.

Construire des modèles éléments finis pour enquêter sur Zebrafish Jaw Biomécanique

Marquage immunohistochimique des isoformes de la chaîne lourde de myosine a émergé comme le discriminant de l’état-of-the-art des fibres musculaires squelettiques de type (c'est-à-direde type I, type IIA, tapez IIX, type IIB). Nous présentons ici un protocole de coloration avec un nouvel algorithme semi automatisé qui facilite l’évaluation rapide de la morphologie de type fibre et fibre.

Analyse semi-automatique de souris Muscle squelettique morphologie et la Composition de la fibre de type

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Le présent protocole décrit l’isolement aigu de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires viables provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires (Danio rerio), adaptés aux études électrophysiologiques.

Isolement de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires pour des études électrophysiologiques

La clarté optique est un avantage majeur pour le travail biologique et physiologique cellulaire chez le poisson zèbre. Des méthodes robustes de mesure de la croissance cellulaire chez des animaux individuels sont décrites qui permettent de mieux comprendre comment la croissance des muscles squelettiques et des tissus voisins est intégrée à la croissance du corps entier.

Mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée

Nous décrivons un protocole pour obtenir des fibres dissociées enzymatiquement de différentes longueurs et types à partir de six muscles de souris adultes : trois d’entre eux déjà décrits (fléchisseur des doigts court, extenseur des doigts long, soléaire) et trois d’entre eux dissociés avec succès pour la première fois (extenseur de l’hallucis long, péronier long, péronier des doigts quarti).

Fibres musculaires squelettiques courtes, intermédiaires et longues intactes obtenues par dissociation enzymatique de six muscles des membres postérieurs de souris : au-delà du fléchisseur digitorum brevis

Découvrez l'isolation de myofibres squelettiques chez Danio rerio embryonnaires et larvaires. Cette technique permet l'analyse détaillée de la morphologie et de la localisation protéique au niveau des fibres musculaires individuelles.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

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