Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

L’objectif global de cette procédure est d’isoler efficacement les fibres musculaires squelettiques des poissons zèbres embryonnaires et larvaires. Ceci est accompli en préparant d’abord des lamelles enrobées de poly L lysine un à quatre jours après la fécondation, les embryons de poisson zèbre sont dissociés. Ensuite, les myofibres isolées des embryons dissociés sont plaquées sur les lamelles de recouvrement en polylysine.

Enfin, les myofibres sont fixées, colorées et imagées pour l’analyse des protéines musculaires. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la localisation subcellulaire des protéines musculaires par microscopie d’immunofluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’analyse de l’embryon entier est qu’elle permet d’étudier plus en détail la morphologie et la physiologie des fibres musculaires uniques.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine musculaire, telles que celles relatives à la localisation des protéines subcellulaires, et elle peut être combinée avec l’imagerie calcique de cellules vivantes. Les implications de cette technique s’étendent à la validation des modèles de poissons zèbres de maladies musculaires, car elle peut être utilisée pour visualiser les anomalies structurelles pathognomoniques associées aux maladies humaines. Il peut également être utilisé pour aider à identifier de nouveaux aspects des maladies musculaires.

Pathogenèse Grâce à cette méthode, vous pouvez donner un aperçu de la structure et de la fonction musculaires. Il peut également être appliqué à d’autres études telles que les maladies musculaires du squelette humain. Pour vous préparer à la dissociation des embryons de poisson zèbre, préparez des feuilles de couverture en coupant et en plaçant du parfum au fond d’une boîte de Pétri de 60 millimètres.

Placez ensuite les lamelles en verre sur le parfum et pipetez 50 à 200 microlitres de solution de polylycine sur chaque lamelle. Incuber les lamelles à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure avant de retirer la solution de polylysine et de les laver deux fois avec 100 microlitres de PBS. Laissez sécher les lamelles, puis rangez-les dans un plat couvert.

Pour la dissociation de l’embryon. Transférez 10 à 23 jours après la fécondation des embryons de poisson-zèbre dans un tube à centrifuger standard de 1,5 millilitre et retirez autant d’eau de poisson en excès que possible. Pipette 900 microlitres de milieu indépendant du dioxyde de carbone dans le tube.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de 3,125 milligrammes par millilitre de collagénase, deux ou quatre solutions pour commencer la dissociation. Faites pivoter les embryons sur un agitateur orbital à température ambiante et toutes les 30 minutes, utilisez un tuyau P 1000 Pepin pour itérer l’échantillon afin d’éviter une digestion excessive lorsqu’aucun embryon entier n’est visible, mais que des morceaux solides sont présents. Arrêtez la réaction en granulant les échantillons à 0,8 à 2,3 G pendant trois à cinq minutes.

Retirez le surnageant et lavez-le deux fois avec un milieu indépendant du dioxyde de carbone. Passez la suspension à travers un filtre de 70 micromètres pour éliminer les débris à environ 50 à 100 microlitres de suspension en myofibre à chaque lamelle recouverte de poly L lysine. Laissez les myofibres reposer pendant une heure à température ambiante après la fixation et l’immunomarquage des fibres myo selon le protocole de texte de montage.

Le couvercle glisse en appliquant d’abord une à deux gouttes de réactif Antifa sur une lame. À l’aide d’une pince, prenez soigneusement une lamelle, retournez-la et placez-la sur les gouttes de réactif anti-décoloration sur la lame de microscope. Ensuite, posez un à deux mouchoirs sur une surface solide et dure et inversez rapidement la diapositive sur les tissus.

Appliquez une légère pression sur les coins de la lame pour éliminer l’excès de réactif Antifa et formez un joint étanche entre la lame et la lamelle. Laissez les lames sécher pendant cinq à 10 minutes à température ambiante avant d’obtenir l’imagerie ou de les stocker à quatre degrés Celsius. Montré ici, les myofibres marquées par immuno-fluorescence contre le récepteur anodin et l’alpha-actinine révèlent respectivement la triade et le zand.

Nous avons utilisé des fibres myopes isolées dans des études antérieures pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines musculaires. Étudier la localisation des transgènes exprimés chimériques et définir des paramètres spécifiques des myofibres, y compris la taille. Cette figure démontre la libération normale de calcium induite par la caféine dans les fibres myop exprimant la construction PSKM GCaMP trois.

La technique décrite dans le protocole textuel peut être utilisée pour interroger l’appareil de couplage excitation-contraction via l’imagerie en direct. D’autres méthodes comme l’imagerie calcique en direct peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que, y a-t-il des défauts dans le couplage excitation-contraction après son développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les maladies musculaires pour explorer des études de validation de gènes de maladies musculaires nouvellement identifiés et déterminer de nouveaux aspects de la pathogenèse des maladies musculaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler le FBS léger individuel de l’ems du poisson zèbre.