Name: Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de lADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Apprenez l'immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les régions de liaison protéique-ADN en utilisant TCF7L2. Cette méthode de séquençage à haut débit permet d'étudier la régulation génique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le travail est soutenu par un prix de l&#39;Institut de développement de l&#39;Hôpital pour enfants de Philadelphie.

1. Cross-link chromatine <ol><li> Cultiver les cellules dans des boîtes de culture cellulaire 100x20mm. La quantité de cellules peut varier de 1 à 10 millions de cellules par boîte selon le type de cellule. Environ 2 millions de cellules est suffisant pour une immunoprécipitation. </li><li> Cellules Cross-Link 1% de formaldéhyde pendant 10 min à température ambiante avec bascule occasionnelle. </li><li> Étancher la réticulation en ajoutant une concentration finale de 125 mM de glycine et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec du phosphate 1X saline tamponnée (PBS) deux fois, décanter PBS, puis ajoutez 0,2 ml de PBS. </li><li> Récolte des cellules avec un grattoir en plastique cellulaire dans un tube de centrifugation. </li><li> Isoler les cellules à 2000 rpm pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant. Remettre les cellules dans un tampon de lyse SDS (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,1) pour lysat cellulaire ou les garder comme une pastille pour l&#39;extraction nucléaire. </li><li> Les cellules peuvent être sauvegardés à -80 ° C ou l&#39;on peut procéder immediatEly avec ultrasons. </li></ol> 2. Préparer noyaux (Passez à l&#39;étape 3.5 pour lysat de cellules entières) <ol><li> Supplément tampon de lyse cellulaire (5 mm tuyaux pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% de NP-40) avec 1X inhibiteur de la protéinase chaque expérience. </li><li> Reprendre décongelé culot cellulaire dans environ 10 fois le volume de granulés avec le tampon de lyse cellulaire. </li><li> DOUNCE-homogénéiser 10 fois avec un pilon puis incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Centrifuger à 4000 rpm pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et sauver culot nucléaire. </li></ol> 3. Sonication * <ol><li> Réchauffez-vous SDS tampon de lyse et le montant du supplément de tampon pour être utilisé avec l&#39;inhibiteur de la protéinase. </li><li> Remettre en suspension culot nucléaire en SDS Lysis Buffer (environ 0,5 ml de tampon par 1-10000000 cellules) </li><li> Incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Ajouter 0,5 ml d&#39;aliquotes d&#39;échantillons à des microtubes. </li><li> Soniquer sur de la glace à l&#39;aide Misonix ultrasons avec 30 sec sur sec et 45off avec un réglage d&#39;amplitude de 2. Nombre de cycles de taille idéale de fragment peut être déterminée en premier essayer différents nombres de cycles (ex. 2, 4, 8, 12, 16 et 20 cycles ou plus). Une autre marque de sonicator peut être utilisé, cependant, les conditions peuvent varier. L&#39;expérimentation avec le nombre de cycles et la quantité de temps sur et en dehors doivent être effectuées afin de déterminer les conditions idéales. </li><li> Recueillir 20 ul de chaque échantillon pour vérifier les résultats de sonication et faire quantification. Le reste de l&#39;échantillon peut être conservé à -80 ° C. </li><li> Diluer le 20 ul d&#39;échantillon en ajoutant 30 ul de 0,1 X TE Buffer. </li><li> Traiter l&#39;échantillon avec 1 pi de RNase A à 37 ° C pendant 1 heure puis ajouter 1 l de protéinase K et incuber à 62 ° C pendant 2 heures. </li><li> Exécuter 20 pl de l&#39;échantillon sur un gel d&#39;agarose à 2%. </li><li> Purifier le montant restant de l&#39;échantillon avec QIAquick PCR purification kit puis quantifier en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop. </li></ol> * Pour Chi nativeP, microccocal digestion à la nucléase peut être utilisé alternativement pour cisailler l&#39;ADN. 4. Bloquer Agarose perles * <ol><li> Si les perles sont déjà bloqués, passez à l&#39;étape 5.1. </li><li> Utilisez une protéine ou protéine G agarose. Pour 5 immunoprécipitat (IPS), utiliser 600 ul de 50% Billes en suspension (300 pi perle granulés) </li><li> Pour laver les perles, les faire tourner vers le bas à 800 rpm pendant 1 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Ajouter un peu plus de 2 ml ChIP Dilution Buffer (0,01% SDS, 1,2 mM EDTA, NaCl 167 mM, 1,1% de Triton X-100, Tris-HCl 16,7 mM pH 8.1) et mélanger en retournant lentement le tube 10X. Tournez à nouveau à 800 rpm pendant 1 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez les lave 2 fois plus. </li><li> Bloc billes en faisant tourner à 4 ° C pendant une nuit dans une solution de blocage. Reportez-vous au tableau 1 pour la recette de la solution de blocage. </li></ol> 5. Chromatine pré-claire <ol><li> Dégel ultrasons chromatine sur la glace. </li><li> Isoler à 12000 rpm fou 10 min à 4 ° C puis mis sur la glace tout de suite pour éliminer le SDS (blanc boulette). </li><li> Recueillir le surnageant, jetez granulés, et combiner des échantillons si nécessaire. </li><li> Sortez les montants nécessaires pour l&#39;expérience basée sur des calculs (1-10 ug de la chromatine par IP). </li><li> Diluer la chromatine 10X tampon de dilution ChIP complété par un inhibiteur de protéinase. </li><li> Ajouter 100 ul de billes bloqués par IP. </li><li> Tournez à 4 ° C pendant 1 heure. </li></ol> 6. Immunoprécipitation <ol><li> Isoler les échantillons à 800 rpm pendant 1 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Isoler surnageant à 800 rpm pendant 1 min et le transfert à un autre tube propre. </li><li> Economisez 20 pi du surnageant, pour servir de contrôle d&#39;entrée, à -20 ° C. </li><li> Aliquote de la chromatine au nombre d&#39;adresses IP à faire dans l&#39;expérience. </li><li> Ajouter 2 ug d&#39;anticorps par 1-10 ug de la chromatine à chaque échantillon. </li><li> Incuber pendant 4 ° C avec rotation. </li><li> Ajouter 100 ul de billes bloqués pour chaque échantillon IP. </li><li> Incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation. </li><li> Pellet les perles en faisant tourner vers le bas à 800 rpm pendant 1 min et jeter autant de surnageant que possible. </li><li> Lavez perles fois avec du tampon de lavage complexe immunitaire Low Salt. Ajouter 1 ml de tampon à chaque tube, tourner à température ambiante pendant 5-8 min; ralentit à 800 rpm pendant 1 min, puis éliminer le surnageant. Répétez laver une fois avec le tampon de haut sel complexe immun de lavage et un tampon de lavage complexe immunitaire LiCl et deux fois avec du tampon TE pour un total de 5 lavages (tableau 2). </li></ol> 7. Élution <ol><li> échantillons d&#39;entrée de dégel du jour précédent à traiter avec les éluants. </li><li> Faire Elution Buffer frais (tableau 3). </li><li> Faites un mélange maître de suffisamment de tampon d&#39;élution nécessaire pour IPs et les échantillons de contrôle d&#39;entrée plus 1-2 échantillons supplémentaires. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon d&#39;élution à chaque échantillon IP et incuber à température ambiante pendant 15 mdans la rotation. </li><li> Isoler à 800 rpm pendant 1 min et ajouter le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter un autre 100 pi de tampon d&#39;élution à chaque tube de perles et incuber à température ambiante pendant 15 min avec rotation. </li><li> Vortex pendant 15 secondes après incubation, centrifuger à 5000 rpm pendant 1 min, puis les combiner surnageant avec le surnageant de la première élution. (Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas laissés sur des billes dans les surnageants. Cas de doute, ralentit à nouveau surnageant à 5000 rpm pendant 1 minute et recueillir le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter 180 ul de tampon d&#39;élution à la 20 pl d&#39;échantillons de contrôle d&#39;entrée. </li></ol> 8. Inverser la Croix-link <ol><li> Pour les 200 pi de éluants et les contrôles d&#39;entrée, ajouter 8 pi de 5 M de NaCl. </li><li> tubes de sceller avec du Parafilm et incuber dans un bain d&#39;eau à 65 ° C pendant la nuit. </li></ol> 9. Purification de l&#39;ADN <ol><li> Traiter chaque échantillon avec 1 pi de RNase A pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Ajouter 4 μl d&#39;EDTA 0,5 M, 8 pi 1M Tris-HCl, mélanger, puis ajouter 1 l de protéinase K à chaque échantillon et incuber à 45 ° C pendant 2 heures. </li><li> Purifier les échantillons à l&#39;aide QIAquick PCR purification kit. Les échantillons peuvent être enregistrés à -20 ° C et chèque PCR peut être fait à une date ultérieure. </li></ol> * Alternativement, les billes magnétiques ChIP-grade peuvent être utilisés à la place d&#39;agarose pour la partie immunoprécipitation. 10. Chèque PCR <ol><li> Pour le contrôle PCR, utiliser des amorces pour les régions connues pour être lié par la protéine d&#39;intérêt. En outre, utiliser des amorces pour les régions non contraignants que les contrôles négatifs. </li><li> Mélanger les réactifs pour la réaction. Diluer l&#39;échantillon d&#39;entrée à 1:100 (tableau 3). </li><li> Exécuter réaction. Programme PCR: </li></ol> Etape 1: 94 ° C 3 min Étape 2: 94 ° C 20 sec 59 ° C 30 sec 72 ° C 30 sec (Répétez l&#39;étape 2 pour au moins 30 cycles) Etape 3: 72 ° C 2 min <ol start="4"><li> Exécuter des échantillons sur gel agarose 1%. </li><li> L&#39;enrichissement peut aussi être déterminée de manière quantitative par PCR en temps réel. </li></ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+STAT+nuclear+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li>
<li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li>
<li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li>
<li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+message+across%2C+STAT%21+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li>
<li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stats%3A+multifaceted+regulators+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+re-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 16, 545-552 (2006).</li>
<li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li>
<li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14%2C000+cases+of+seven+common+diseases+and+3%2C000+shared+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li>
<li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li>
<li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li>
<li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li>
<li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations%3A+The+DiaGen+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF7L2%3A+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li>
<li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+TCF7L2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet.+Med%22%5BJournal%5D)">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li>
<li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+suspect%3A+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li>
<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
<li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+TCF-4+gene+%28TCF7L2%29+to+human+chromosome+band+10q25.3%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li>
<li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li>
<li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li>
<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Il est désormais possible d&#39;effectuer l&#39;ensemble du génome profil de l&#39;association des interactions protéine-ADN en utilisant ChIP-seq, comme cela a été récemment démontrée avec d&#39;autres facteurs de transcription 2,3. La clé d&#39;un résultat de séquençage réussie est la génération d&#39;un modèle chromatine de l&#39;ADN d&#39;immunoprécipitation de haute qualité. Une fois la matrice d&#39;ADN a été généré et déterminé à être enrichi de manière adéquate, on peut al...

Depuis de nombreuses années, il ya eu un besoin non satisfait pour identifier l&#39;ensemble des gènes liés et réglementée par une protéine échelle du génome entier, en particulier compte tenu de ceux de la classe de facteur de transcription. Odom et al. 1 utilisé immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) combiné avec des puces de promoteurs afin d&#39;identifier systématiquement les gènes occupées par des régulateurs de transcription pré-spécifiés dans le foie humain et îlots pancréatiques. Par la suite, Johnson et al. 2 mis au point un test d&#39;immunoprécipitation de la chromatine à grande échelle basée sur le séquençage direct ultra haut débit ADN (ChIP-seq) afin de cartographier en détail les interactions protéine-ADN dans l&#39;ensemble de génomes de mammifères. En cas de test, ils ont cartographié in vivo la liaison du facteur de silencieux neurones restrictive (CRSN) à 1946 endroits dans le génome humain. Les données affichées résolution forte de position de reliure (+ 50 paires de bases), ce qui a facilité à la fois le iconsolation de motifs et de l&#39;identification des motifs CRSN contraignantes. Ces données ChIP-Seq également eu une grande sensibilité et de la spécificité et de la confiance statistique (p &lt;10 -4), propriétés qui sont importantes pour déduire de nouvelles interactions candidats. Robertson et al. 3 également utilisé ChIP-seq afin de cartographier STAT1 cibles dans l&#39;interféron γ-(IFN-γ)-stimulés et non stimulés cellules HeLa S3 humains in vivo. Par Chip-Seq, avec 15,1 et 12,9 millions de séquence cartographiée unique lit, et un taux de fausses découvertes estimée à moins de 0.001, ils ont identifié 41 582 et 11 004 régions STAT1-putatifs de liaison dans les cellules stimulées et non stimulées, respectivement. Sur les 34 loci connus pour contenir l&#39;interféron STAT1 sensible liaison 4-8 sites ChIP-seq trouvé 24 (71%). Objectifs ChIP-Seq ont été enrichies en séquences similaires à connaître STAT1 motifs de liaison. Les comparaisons avec les données de la puce deux-PCR existants définit suggéréque la sensibilité ChIP-seq se situait entre 70% et 92% et la spécificité était d&#39;au moins 95%. En outre, il était clair que ChIP-seq offre à la fois une faible complexité analytique et une sensibilité qui augmente avec la profondeur de séquençage. Alors que les technologies de séquençage tel, Génome &quot;nouvelle génération&quot; offrent 1-2 ordres de grandeur dans l&#39;augmentation de la quantité de séquence qui peut être rentable généré plus anciennes technologies 9. Méthodes ChIP-Seq fournissent donc directement couverture du génome entier pour le profilage efficace des interactions protéine-ADN de mammifères 3. En 2006, une forte association des variants du facteur de transcription 7-like 2 (TCF7L2) gène du diabète de type 2 a été découvert 10. D&#39;autres chercheurs ont déjà répliqué indépendamment de cette constatation dans différentes ethnies et, curieusement, depuis les premières études d&#39;association génomique échelle du diabète de type 2 publiés dans Nature 11,12 </splace&gt;, Science 13-15 et ailleurs 16,17, la plus forte association était en effet avec TCF7L2, ce qui est maintenant considéré comme le résultat génétique le plus important dans le diabète de type 2 à ce jour 18-20. En outre, TCF7L2 a été liée à un risque de cancer 21,22, en effet, ce lien est devenu plus évident lorsque le locus 8q24 révélé par Génome larges études d&#39;association d&#39;un certain nombre de cancers, y compris les carcinomes colorectaux, s&#39;est révélée être en raison d&#39;une extrême amont TCF7L2 élément contraignant de conduire la transcription MYC 23,24. En tant que tel, il ya un grand intérêt dans la détermination des gènes en aval régulés par ce facteur de transcription clé. Basé sur l&#39;expérience avec TCF7L2 comme un exemple de la méthodologie, ce document décrit comment générer une matrice d&#39;ADN de Morceau de qualité. Puce a été effectuée de la lignée cellulaire de carcinome colorectal, HCT116, pour le séquençage ultérieur afin de construire un haut-résolcarte ution des gènes liés par TCF7L2 25 dans un effort pour donner un meilleur aperçu de son rôle clé dans la pathogenèse de traits complexes.

<table><tbody><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ChIP Kit </td><td>Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Hot Start Polymérase </td><td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Spectrophotomètre </td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Séquences d’amorces de contrôle positif (TCF7L2-1) Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCCTCTGTATCTTCG-3' Séquences d’amorces de contrôle négatif (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGGGGGTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

génération de haute qualité immunoprécipitation de la chromatine patron de l&#39;adn pour le séquençage à haut débit (chip-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-séquençage (ChIP-seq) méthodes offrent directement couverture du génome entier, où la combinaison immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le séquençage massivement parallèle peut être utilisé pour identifier le répertoire de séquences d&#39;ADN de mammifères liés par des facteurs de transcription in vivo. &quot;La nouvelle génération&quot; technologies de séquençage du génome fournissent 1-2 ordres de grandeur dans l&#39;augmentation de la quantité de séquence qui peut être rentable généré plus anciennes technologies permettant ainsi des méthodes ChIP-Seq pour fournir directement la couverture du génome entier pour le profilage efficace des mammifères interactions protéine-ADN. Pour les approches ChIP-Seq succès, il faut générer une matrice d&#39;ADN de Morceau de qualité afin d&#39;obtenir les meilleurs résultats de séquençage. La description est basée sur l&#39;expérience avec le produit protéique du gène le plus fortement impliquée dans la pathogenèse du diabète de type 2, à savoir le facteur de transcription facteur de transcription 7-like 2 (TCF7L2). Ce facteur a également été impliqué dans divers cancers. Décrit est de savoir comment générer une matrice d&#39;ADN de puce de haute qualité issu de la lignée de cellules de carcinome colorectal, HCT116, afin de construire une carte à haute résolution par séquençage de déterminer les gènes liés par TCF7L2, donner un nouvel aperçu de son rôle clé dans la pathogenèse des traits complexes.

Une fois la chromatine a été traité par ultrasons et ont été traités à la RNase et protéinase, les échantillons analysés sur le gel à 2% d&#39;agarose doivent présenter un frottis avec la majeure partie de l&#39;ADN à la taille désirée. Si plusieurs cycles différents sont testés, une diminution progressive de la taille doit être considéré comme le nombre de cycles de hausse (figure 2). Après avoir terminé la partie d&#39;immunoprécipitation du protocole de l&#39;enrichisseme...

La combinaison de l&#39;immunoprécipitation de la chromatine et le séquençage ultra-haut débit (chip-seq) permet d&#39;identifier et de cartographier les interactions protéine-ADN dans une lignée de tissu ou de cellule donné. Décrit est de savoir comment générer un modèle de puce de haute qualité pour le séquençage ultérieur, en utilisant l&#39;expérience avec le facteur de transcription TCF7L2 comme un exemple.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les régions de liaison des protéines par l'intermédiaire de la chromatine. Cela est réalisé en premier lieu par la réticulation croisée de la protéine à l'ADN. La deuxième étape consiste à fragmenter l'ADN.Ensuite, la protéine cible liée à l'ADN est immunoprécipitée, puis élutée. La dernière étape consiste à inverser la réticulation et à isoler l'ADN. En fin de compte, l'immunoprécipitation de chromatine est utilisée pour montrer la localisation des liaisons protéiques à travers le génome.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique fonctionnelle, telles que l'identification et la cartographie des interactions protéine-ADN dans un tissu ou une lignée cellulaire donnés. Les cellules destinées à cette procédure sont cultivées dans des boîtes de culture de 100 par 20 millimètres. La quantité de cellules peut varier de un à dix millions de cellules par boîte, selon le type cellulaire. Environ deux millions de cellules suffisent pour une immunoprécipitation afin de réticuler les protéines et la chromatine dans les cellules.Ajouter du formaldéhyde à 1 % et incuber pendant 10 minutes à température ambiante avec un agitation occasionnelle. Arrêter la réticulation en ajoutant de la glycine à une concentration finale de 125 millimolaire et en incubant pendant cinq minutes. À température ambiante, laver les cellules deux fois avec du tampon phosphate salin à 1 x ; après le deuxième lavage, décantation du PBS, puis ajout de 0,2 millilitre de PBS frais. Récolter les cellules à l’aide d’un racloir à cellules en plastique dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger les cellules à 2000 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Aspirez le surnageant pour l'extraction des noyaux. Conservez les cellules sous forme de culot pour préparer un lysat total de cellules, ce qui sera démontré dans le prochain segment. Resuspendez les cellules dans un tampon de lyse SDS ; les lysats totaux de cellules sont préparés à partir des cellules réticulées par sonication sur de la glace fondante.À l'aide d'un sonicateur, pour obtenir la taille idéale du fragment d'ADN, cette procédure doit être optimisée en testant différentes conditions de sonication. Les échantillons doivent rester sur glace tout au long de la procédure. Sonicater chaque échantillon avec ces paramètres : 30 secondes activé et 45 secondes désactivé, à un réglage d'amplitude de deux.Dans cet exemple, 12 cycles sont nécessaires pour obtenir la taille idéale de fragment. Prélevez 20 microlitres de chaque échantillon pour vérifier les résultats de la sonication et pour la quantification. Le reste de l'échantillon peut être conservé à moins 80 degrés Celsius.Diluez l'échantillon de 20 microlitres en ajoutant 30 microlitres de tampon 0,1 XTE. Ensuite, traitez l'échantillon avec un microlitre de RNAses A à 37 degrés Celsius pendant une heure. Puis, ajoutez un microlitre de protéinase K et incubez à 62 degrés Celsius pendant deux heures.Après le traitement par la protéinase K, déposer 20 microlitres de l'échantillon sur un gel d'agarose à 2 %. Les échantillons doivent présenter un smearing avec la majorité de l'ADN à la taille souhaitée. Si plusieurs cycles différents sont testés, une diminution progressive de la taille doit être observée.À mesure que le nombre de cycles augmente, la quantité restante d'échantillon sera purifiée à l'aide d'un kit de purification rapide PCR kaya et quantifiée en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop du TER pour commencer cette procédure. Fava des échantillons de chromatine soniqués sur glace centrifugés à 12 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Placer immédiatement sur glace.Pour éliminer le SDS, qui apparaît sous forme de culot blanc. Récupérez le surnageant et jetez le culot de chaque échantillon. Combinez les échantillons si nécessaire, et mettez de côté les volumes nécessaires pour l'expérience en fonction des calculs précédents.De un à 10 microgrammes de chromatine sont nécessaires par immunoprécipitation. Diluez la chromatine au 1/10 dans du tampon de dilution supplémenté en inhibiteur de protéinase. Ajoutez 100 microlitres d’Aro Speeds bloqués par immunoprécipitation et incubez sous agitation à quatre degrés Celsius pendant une heure.Commencez la procédure d'immunoprécipitation de la chromatine en centrifugeant les échantillons à 800 tr/min pendant une minute à quatre degrés Celsius, puis en transférant chaque surnageant dans un tube neuf. Centrifugez le surnageant à 800 tr/min pendant une minute et transférez-le dans un autre tube propre. Conservez 20 microlitres du surnageant à moins 20 degrés Celsius pour servir de témoin d'entrée.Par la suite, aliquoter le reste de la chromatine selon le nombre de précipitations immunologiques nécessaires à l'expérience. À chaque échantillon, ajouter deux microgrammes d'anticorps par un à dix microgrammes de chromatine, puis incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius sous agitation. Le lendemain matin, ajouter 100 microlitres de billes aros bloquées à chaque échantillon de précipitation immunologique. Incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius sous agitation après une heure.Centrifuger les billes à 800 tr/min pendant une minute pour former un culot. Éliminer autant que possible le surnageant. Laver les billes.Une fois avec un tampon de lavage du complexe immunitaire à faible concentration saline, ajouter un millilitre de tampon dans chaque tube. Incuber en rotation à température ambiante pendant cinq à huit minutes, puis centrifuger à 800 RPM pendant une minute après avoir éliminé le surnageant. Laver les billes une fois avec un tampon de lavage du complexe immunitaire à haute concentration saline, une fois avec le tampon de lavage au chlorure de lithium, une fois avec le tampon de lavage du complexe immunitaire, puis deux fois avec le tampon TE, pour un total de cinq lavages. Ensuite, l'ADN est élué à partir de chaque échantillon d'immunoprécipitation ainsi que des échantillons témoins d'entrée.Pour inverser la réticulation, ajouter huit microlitres de chlorure de sodium à cinq molar dans 200 microlitres de chaque élué et témoin d'entrée. Fermer les tubes avec du parafilm et incuber toute la nuit dans un bain-marie à 65 degrés Celsius. Le jour suivant, traiter chaque échantillon avec un microlitre de RNAs, a pendant une heure à 37 degrés Celsius.Après une heure, ajouter quatre microlitres de EDTA 0,5 molaire et huit microlitres de tris HCl 1 molaire à chaque échantillon et mélanger. Puis ajouter un microlitre de protéinase K et incuber à 45 degrés Celsius pendant deux heures. Purifier les échantillons à l’aide du kit de purification PCR rapide kaya.Les échantillons peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu'à leur analyse par PCR. L'enrichissement par immunoprécipitation de la chromatine peut être vérifié par PCR ou par PCR en temps réel. Pour les échantillons destinés à la PCR, une électrophorèse sur gel d'agarose doit révéler des bandes dans les pistes « input » et « chip » lorsqu'on utilise un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, à savoir dans ce cas le facteur de transcription TCF7L2. En revanche, il ne devrait y avoir aucune bande, ou tout au plus une bande très faible, dans la piste du témoin négatif IgG pour la région de liaison positive.Pour la région de liaison négative. Il devrait y avoir une bande très faible ou aucune bande du tout pour les témoins IgG et les pistes de puces. Il devrait y avoir une bande dans la piste d'entrée.Cette figure présente les résultats obtenus à partir des mêmes échantillons analysés par PCR en temps réel. Comme pour le résultat précédent, on devrait observer un enrichissement important du nombre de copies de la région de liaison positive pour l'échantillon ChIP par rapport au témoin IgG.En outre, il devrait y avoir très peu, voire aucune, enrichissement dans la région de liaison négative. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réticuler une protéine de liaison à la chromatine dans un tissu ou une lignée cellulaire, puis précipiter votre protéine ciblée et isoler l'ADN pour des analyses ultérieures.

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

La méthode Salut-C permet l'identification sans parti pris, l'ensemble du génome des interactions chromatine (1). Salut-C couples ligature de proximité et le séquençage massivement parallèle. Les données obtenues peuvent être utilisées pour étudier l'architecture génomique à plusieurs échelles: premiers résultats identifié des caractéristiques telles que les territoires chromosomiques, la ségrégation de la chromatine ouverte et fermée, et la structure de la chromatine à l'échelle mégabase.

Salut-C: une méthode d&#39;étude de l&#39;architecture tridimensionnelle des génomes.

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines sur des régions spécifiques de l’ADN génomique des cellules précurseurs d’oligodendrocytes via l’immunoprécipitation sélective de fragments de chromatine liés aux protéines. Cette méthode permet d’étudier l’interaction de plusieurs protéines régulatrices, y compris les facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes.

Immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines cibles sur l’ADN génomique

Les méthodes de cartographie in vivo des interactions protéine-ADN deviennent cruciales pour tous les aspects de la recherche génomique, mais elles sont laborieuses, coûteuses et chronophages. Ici, un système robotisé de manipulation de liquides disponible dans le commerce qui automatise l’immunoprécipitation de la chromatine pour cartographier in vivo les interactions protéine-ADN avec des quantités limitées de cellules est présenté.

Automatisation expériences ChIP-seq pour générer des profils épigénétiques sur 10 000 cellules HeLa

Nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine native mis à jour le séquençage (ChIP-seq) méthodologie pour la production d’ensembles de données de séquence pour un cadre d’analyse des nucléosomes densité ChIP-seq intégrant l’accessibilité nucléase micrococcique (MNase) avec mesures de modification d’histone.

Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Nous décrivons ici un protocole de puce-séquençage haut débit optimisé et pipeline analyses calcul pour la détermination de modèles État pangénomique chromatine de lignées de cellules et tissus tumoraux congelés.

Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur

Nous présentons ici un protocole qui vise à analyser la liaison pangénomique du facteur de transcription oligodendrocyte 2 (Olig2) dans cerveau parfaitement purifiée précurseur oligodendrocytes (OPCs) en effectuant l’immunoprécipitation de la chromatine basse-cellule (ChIP) , préparation de bibliothèque, séquençage haut-débit et des analyses de données bioinformatiques.

Identification des Sites de facteur de Transcription Olig2 génomique fixation aiguë purifiée cellules PDGFRα + par immunoprécipitation de la chromatine Low-cellule analyse de séquençage

Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine efficace (ChIP) suivi par séquençage haut-débit (ChIP-seq) du tissu adipeux brun (TAB) isolé à partir d’une souris. Ce protocole est convenable pour les cartographie des modifications d’histone et enquêter sur tout le génome de localisation des protéines non histones d’intérêt in vivo.

Immunoprécipitation de la chromatine du murin tissu adipeux brun

Cet article décrit un protocole ChIP-Seq semi-automatisé et micro-mis à l’échelle des régions d’ADN associées à une modification spécifique des histones (H3K27ac) à l’aide d’une plate-forme de manipulation de liquide ChIP, suivi d’une préparation de bibliothèque à l’aide de la marquage. La procédure comprend une évaluation du contrôle à des fins de qualité et de quantité et peut être adoptée pour d’autres modifications d’histones ou facteurs de transcription.

Une procédure ChIP-Seq semi-automatisée pour les études épigénétiques à grande échelle

Ce protocole décrit la méthode Capture Hi-C utilisée pour caractériser l’organisation 3D de régions génomiques ciblées de taille mégamétrique à haute résolution, y compris les limites des domaines topologiquement associés (TAD) et les interactions chromatines à longue distance entre les éléments de séquence d’ADN régulateurs et autres.

Déchiffrer l’organisation de la chromatine 3D haute résolution via Capture Hi-C

Apprenez l'immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les régions de liaison protéique-ADN en utilisant TCF7L2. Cette méthode de séquençage à haut débit permet d'étudier la régulation génique.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l'ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

Explorer plus de vidéos