Name: Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels In vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Apprenez le contrôle optogénétique de haute fidélité des neurones pyramidaux individuels in vivo. Cette méthode combine stimulation lumineuse et enregistrement électrique pour activer ou inhiber des populations neuronales avec une résolution milliseconde.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national sur l&#39;abus des drogues (NIDA) subvention R01 DA24040 (CDC), l&#39;Université du Colorado Subvention de démarrage innovant (CDC), et NIDA formation subvention T32 DA017637 (MVB).

Une. Conservation et préparation virus <ol><li> L&#39;utilisation de vecteurs AAV réplication incompétent pour délivrer des gènes opsin pour le cerveau des rongeurs est approuvé pour la sécurité biologique de niveau 1 (BSL-1) et nécessite une protection adéquate et les procédures de traitement tel que décrit dans la publication du gouvernement américain, la biosécurité en microbiologie et biomédicales de laboratoires, disponible à les Centers for Disease Control site à ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> Afin d&#39;éviter des cycles répétés de gel-dégel, le virus de la pipette de la fiole de fabricant en aliquotes de travail plus petits dans un Cabinet et magasin de biosécurité de classe II dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Avant l&#39;injection stéréotaxique, permettent une aliquote de dégeler la glace, puis tourner brièvement vers le bas avec une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Remblayer lentement une seringue en verre et une aiguille Hamilton avec une petite quantité de silicone ou une huile minérale.Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air visibles dans le corps de la seringue. Insérer la seringue dans une pompe à micro-injecteur et fixer la pompe directement sur ​​le bras stéréotaxique verticale (c.-à-manipulateur stéréotaxique). </li><li> Abaissez le bras stéréotaxique jusqu&#39;à ce que la pointe de l&#39;aiguille touche le fond du tube aliquote de virus. Utiliser le dispositif de commande de la pompe de micro-injecteur pour retirer le volume souhaité de virus (1,5 ul pour une injection de 1 ul). </li><li> Toutes les surfaces et matériaux qui entrent en contact avec le virus doivent être décontaminés avec un désinfectant comme l&#39;eau de Javel (10%). </li></ol> 2. La chirurgie et le virus Injection <ol><li> Anesthésier l&#39;animal avec une kétamine (rat, 125 mg / kg, ip) - xylazine (rat, 10 mg / kg, ip) cocktail. Pour évaluer l&#39;efficacité de l&#39;anesthésie, de vérifier une réponse réflexe à une pincée de pieds et de donner des doses supplémentaires de kétamine si nécessaire. En utilisant des méthodes chirurgicales d&#39;asepsie standard, placer l&#39;animal dans un appareil stéréotaxique (Kopf David Dansinstruments). </li><li> Faire une incision médiane à travers la peau sur le dessus du crâne animal avec de petits ciseaux chirurgicaux ou d&#39;un scalpel. Séparez délicatement le tissu conjonctif et nettoyer le dessus du crâne avec un petit grattoir osseuse. </li><li> Vérifiez que la tête de l&#39;animal est telle que le niveau z coordonnées pour bregma et lambda sont égaux. Déterminer les coordonnées stéréotaxiques pour la zone du cerveau cible d&#39;un cerveau atlas tels que le cerveau de rat en stéréotaxique coordonnées (George Paxinos et Charles Watson, Academic Press, 2007) ou le cerveau de la souris dans stéréotaxique coordonnées (Keith BJ Franklin et George Paxinos, Academic Press , 2007). Marquez le site prévu de l&#39;injection avec un stylo chirurgical. </li><li> Mince soigneusement le crâne sur la zone cible à l&#39;aide d&#39;une perceuse à main et arrêter lorsque le foret atteigne le fond du crâne. En utilisant une paire de pinces très fines, retirer l&#39;os aminci afin d&#39;exposer la dure-mère. </li><li> Placez l&#39;aiguille de la seringue sur la cible sontun et abaisser l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;elle touche la dure-mère et utiliser ce point pour calculer la coordonnée z. Très lentement abaisser l&#39;aiguille d&#39;injection dans le cerveau jusqu&#39;à ce que la position correcte de z est atteinte. Dans ce protocole, la région prélimbique du cortex préfrontal médian (2,7 mm antérieur à bregma, ± 0,5 mm latéral de la ligne médiane, et -2,2 mm de durée) ou le subiculum dorsal (-6,0 mm antérieure à bregma, ± 3,0 mm latéral de la ligne médiane, et -2,0 mm de durée) est ciblée dans un Sprague Dawley rat mâle (env. 275 g) adulte. </li><li> Injecter le virus à un débit de 0,1 ul / min. Après l&#39;injection est terminée Attendre 10 min avant de retirer l&#39;aiguille pour éviter le reflux du virus à la surface du cerveau. </li><li> Utiliser un fil de suture à coudre avec une aiguille attachée à la peau et de sceller les antibiotiques appliquer sur la plaie. </li><li> Le décours temporel de l&#39;expression fonctionnelle et ChR2 NPHR de vecteurs AAV sera variable en fonction de la conception expérimentale et le titre viral. Pour cette expérience, in vivo </em&gt; enregistrements ont été réalisés injection 18-21 jours de poste. </li></ol> 3. Livraison lumière et dans l&#39;enregistrement in vivo de ChR2 ou neurones exprimant NPHR <ol><li> Attacher une électrode de tungstène (~ 1-1,5 MQ, microsondes) à un tube capillaire en verre (Fisher Scientific) en utilisant la super glue. </li><li> Utilisez un outil de fibre de décapage (Thorlabs) pour exposer l&#39;extrémité dénudée d&#39;une fibre optique multimode (200 um noyau de diamètre, Thorlabs) et la pointe de fibre propre avec de l&#39;éthanol. Très légèrement marquer pointe de la fibre avec un couteau de diamant en forme de coin (Thorlabs) et retirez soigneusement la fibre excès (par exemple avec une pince fine). La fibre devrait s&#39;attacher facilement à la partition. </li><li> Connecter l&#39;extrémité de la fibre FC sur le connecteur d&#39;un ordinateur sur le port de sortie d&#39;un seul laser à diode de 200 mW ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) avec la longueur d&#39;onde souhaitée. Assurez-vous que des lunettes de protection approprié est porté en tout temps lorsque vous travaillez avec des lasers. </li><li> Mesurer la lintensité aser à l&#39;extrémité de la fibre optique à l&#39;aide d&#39;un mesureur de puissance optique ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Pour les enregistrements in vivo, l&#39;intensité lumineuse aussi peu que 20 à 100 mW / mm 2 de façon fiable peut évoquer CHR2-ou activation ou inactivation médiée NPHR, respectivement, de l&#39;activité neuronale. </li><li> Insérer la fibre optique dans le tube capillaire. Placez la pointe de la fibre d&#39;environ 500 um dessus de la pointe de l&#39;électrode de tungstène et attacher un fil de suture mince deux fois à quelques points près de la pointe de sorte que l&#39;électrode et la fibre sont droites. Assurez-vous que la distance entre la pointe de l&#39;électrode et le nœud le plus proche est assez long pour l&#39;insertion de la région cible. </li><li> Préparer l&#39;animal comme dans les étapes 2.1 et 2.2 ci-dessus. Utilisez la craniotomie initiale comme un guide pour faire une nouvelle petite fenêtre propre dans le crâne pour le positionnement de la optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Faire une petite incision sur la dura aide d&#39;une aiguille fine. </li><li> Abaisser avec précaution la optrode par la fenêtre du crâne et dans le cerveau pour la région transduction utilisant un micromanipulateur (Narishige). Avancez ensuite le optrode lentement 10-50 um étapes jusqu&#39;à l&#39;émergence d&#39;une cellule sensible à la lumière. </li><li> Une interface utilisateur de logiciels personnalisés (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) écrit en LabVIEW (National Instruments) est utilisé pour contrôler la diode laser unique et de visualiser et d&#39;enregistrer l&#39;activité neuronale en cours. Signaux enregistrés sont capturés avec un examp-20K (Kation scientifique) passe-bande de l&#39;amplificateur filtré (0,3 à 8 kHz), et un analogue de National Instruments à bord numérique (NI USB-6009). L&#39;interface utilisateur de Pro NeuroLux permet le choix d&#39;entrées analogiques (choisir deux canaux pour le neuronale et signal TTL) et la sortie numérique. L&#39;utilisateur peut définir la fréquence d&#39;échantillonnage (20 kHz), la période de référence (pré-lumière), et la période post-lumière. L&#39;utilisateur peut définir l&#39;stimulati laser TTLla largeur d&#39;impulsion, la fréquence et la période de stimulation (si la fréquence est de 20 Hz et la stimulation période est de 500 msec, 10 des impulsions laser avec une largeur d&#39;impulsion définie sont fournis). L&#39;utilisateur peut également choisir la livraison de lumière continue (par exemple, la figure 1). Pour les enregistrements répétés, l&#39;utilisateur peut également définir le nombre de trains d&#39;impulsions et l&#39;intervalle entre les trains. Les données peuvent être acquis avec ou sans enregistrement sur le disque. </li><li> À la suite de l&#39;enregistrement, les animaux sont anesthésiés avec le cocktail de kétamine / xylazine et perfusées par voie transcardiaque avec du sérum physiologique et du paraformaldéhyde (4%), afin de vérifier le placement de optrode et l&#39;expression de l&#39;opsine. </li></ol>

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<li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Une large gamme de techniques sont disponibles pour le ciblage des gènes génétiquement opsin microbiennes à des régions discrètes du cerveau chez les rongeurs. Livraison de gène viral fournit une approche relativement peu coûteux et rapide pour la médiation ChR2 et NPHR expression avec un type de cellule spécificité. Les systèmes de vecteurs d&#39;AAV sont un choix courant pour une utilisation dans des expériences optogénétiques dues à des titres élevés de production qui restent stables pendant le stockage, l&#39;absence de pouvoir pathogène, et sa capacité à produire de l&#39;expression 10 génique à long terme. Beaucoup de constructions opsin avec des promoteurs spécifiques de type cellulaire sont disponibles dans le commerce dans une variété de sérotypes d&#39;AAV de vecteur installations de base telles que l&#39;Université de Pennsylvanie ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) ou l&#39;Université de la Caroline du Nord à Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Un inconvénient de la technologie de l&#39;AAV est l&#39;capacité limitée d&#39;emballage (~ 4,7 kb), qui place une limitation sur la taille de la cassette de transgène qui peut être utilisé pour le ciblage spécifique de cellule. En variante, les vecteurs lentiviraux, qui ont une plus grande capacité de conditionnement, sont en mesure d&#39;accueillir l&#39;opsine de ciblage sous le contrôle des séquences promotrices de plus grandes. L&#39;utilisation d&#39;un optrode permet une détection fiable des signaux électrophysiologiques en combinaison avec la livraison de la lumière temporellement précis. Comme décrit ci-dessus, cependant, suffisamment de soin est nécessaire à sa construction. Depuis la fibre optique clivée est fragile, attacher le fil de suture trop serré peut causer la fibre de rompre. Même si le optrode peut être utilisé pour de multiples enregistrements, l&#39;électrode et la fibre optique doivent être nettoyés (ou manuellement clivés dans le cas de l&#39;extrémité dénudée de la fibre optique) avant l&#39;insertion en raison de l&#39;impédance de l&#39;électrode et de la qualité de la lumière délivrée dégradera avec une utilisation répétée. Pendant élémentenregistrements ctrophysiological il est important que la optrode être avancé lentement. Le optrode utilisé ici a une épaisseur d&#39;environ 350 um (de l&#39;électrode de tungstène: 125 um; noyau de fibre optique: 200 pm) et en l&#39;abaissant rapidement pourraient entraîner un mouvement du tissu cérébral. Artefacts induite par la lumière pourraient également être envisagées avec notamment l&#39;enregistrement et la livraison de lumière set-up 11-12. Bien que nous n&#39;avons trouvé aucune artefact induit par la lumière dans notre condition expérimentale, les enregistrements en dehors de la zone du cerveau transduction peuvent potentiellement être utilisés comme contrôle pour les objets légers. Une autre considération lors du processus d&#39;enregistrement est l&#39;intensité lumineuse nécessaire pour observer les changements dans les neurones ChR2 ou NPHR exprimant, en particulier pour les enregistrements de longue durée. L&#39;intensité du laser solide et de longue illumination laser pourraient entraîner des lésions tissulaires et / ou une diminution de la réponse à la suite lumineuse délivrée 12-13. Pour l&#39;expérimentation de comportement de l&#39;utilisation d&#39;un vecteur viral de commande est nécessaire pour eliminating tout effet dû à la chaleur délivrée par la fibre. Pour un grand nombre des constructions optogénétiques disponibles dans le commerce, il existe des constructions de commande complémentaires, dans lequel la séquence du gène de l&#39;opsine a été éliminé. Il convient de noter que conçu ChR2 variantes avec des propriétés et de la cinétique améliorées ont été développées avec d&#39;autres opsins silencieux qui peuvent être mieux adaptés à certaines questions expérimentales 14-15. Par exemple, une nouvelle variante ChR2 établie par mutagénèse ciblée, appelée &quot;CHETA&quot;, peut conduire à haute fidélité dopage neuronale à des fréquences (jusqu&#39;à au moins 200 Hz) supérieur à celui de la ChR2 originale 14. La combinaison de l&#39;administration in vivo de la lumière et l&#39;enregistrement simultané des réponses neuronales est une étape critique dans l&#39;établissement de relations de cause à effet entre l&#39;activité motifs dans des populations cellulaires génétiquement ciblées et événements comportementaux correspondants temps-verrouillé. Les procédures et les hardware décrite ici fournit une approche simple pour la mise en œuvre de optogenetics vivo enregistrements de tête fixe dans les rongeurs.

La capacité d&#39;activer ou de couper un type de cellule spécifique au sein d&#39;un circuit neuronal dans un mode temporel précis est essentiel pour comprendre comment les circuits neuronaux traiter différents types d&#39;informations sous-jacentes émotion et cognition. Contrôle expérimental sur l&#39;activité neuronale intact a utilisé des outils de loss-/gain-of-function (par exemple, la stimulation électrique, la modulation pharmacologique, lésion) qui ne fournissent pas le nécessaire sélective pour le contrôle des populations spécifiques de neurones, soit sur ​​une échelle temporelle ou spatiale. S&#39;adressant directement à ces défis technologiques, le développement et l&#39;application d&#39;outils sensibles à la lumière génétiquement encodables a permis neuroscientifiques de contrôler l&#39;activité électrique de types cellulaires particuliers pendant les événements de comportement bien définies. Beaucoup de ces protéines sensibles à la lumière sont d&#39;origine microbienne, avec le canal de lumière fermée cation, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, et la pompe de chlorure de lumière conduit, halorhodopsin (NPHR) 2,3, dans une utilisation généralisée. Un avantage majeur de optogenetics est la capacité de la population de cellules génétiquement cibles spécifiques dans des régions cérébrales hétérogènes et la technique a été appliquée avec succès à un certain nombre d&#39;organismes modèles (invertébrés aux primates non humains) 4-6. Beaucoup d&#39;animaux transgéniques optogénétiques ont été générés et sont disponibles commercialement 7,8, mais établissant lignées transgéniques peuvent être main-d&#39;œuvre et le coût prohibitif. Nous décrivons ici un protocole de livraison de manière virale médiée par des gènes CHR2 et NPHR sous le promoteur de CaMKIIα dans prélimbique cortex de rat et subiculum dorsal en utilisant un virus adéno-associé recombinant (AAV). Dans le cerveau antérieur, expression CaMKIIα est exclusif à neurones pyramidaux glutamatergiques 9. AAV est couramment utilisé pour la recherche fondamentale en raison de sa relative facilité de production et l&#39;absence de pathogénicité, ainsi que la forte et persil&#39;expression du transgène de stent qui ont été réalisés avec ces vecteurs 10. En outre, nous présentons les étapes et le matériel pour la livraison de la lumière et l&#39;enregistrement simultanés chez des rats anesthésiés tête fixe.

<table><tbody><tr><td>Seringue </td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &mu ; l</td></tr><tr><td>Aiguille amovible</td><td>Hamilton</td><td>7803-03</td><td>Calibre 31, pointe biseautée</td></tr><tr><td>Pompe à micro-injecteur</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur</td><td>de pompe World Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Huile de silicone</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12728</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection laser</td><td>Kentek</td><td>KMT-4501</td><td></td></tr><tr><td>Fibre optique multimode</td><td>Thorlabs</td><td>BFL37-200</td><td>200 &mu ; Noyau de diamètre m, 0,37 NA</td></tr><tr><td>Outil de dénudage</td><td>de fibre Thorlabs</td><td>T12S21</td><td>pour 200 &mu ; Capteur de puissance optique à fibre optique multimode à noyau de m de diamètre</td></tr><tr><td></td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/ » target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Photodétecteur</td><td>Newport</td><td>818-SL/DB</td><td></td></tr><tr><td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com » target="_blank">www.lumiphy.com</a> </td><td>couplé à un 200 &mu ; m fibre multimode avec adaptateur FC/PC </td></tr><tr><td>Laser Vert (532 nm, 100-200 mW)</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com » target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td>couplé à un 200 &mu ; m fibre multimode avec adaptateur FC/PC </td></tr><tr><td>Tungstène/Fibre Optrode</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/ » target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td>Lumitrode</td></tr><tr><td>Tube capillaire en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur hydraulique</td><td>Narishige</td><td>MO-22</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur</td><td>Kation Scientific</td><td>ExAmp-20K</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d’acquisition de données</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td></td></tr><tr><td>Appuie-tête pour rongeurs pour l’enregistrement</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/ » target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Unité stéréotaxique pour petits animaux</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 963</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode pour high fidelity optogénétiques contrôle de pyramidal neurones individuels<em&gt; in vivo</em

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Méthodes optogénétiques ont émergé comme un outil puissant pour élucider l&#39;activité des circuits neuronaux qui sous-tend un ensemble diversifié de comportements à travers un large éventail d&#39;espèces. Outils optogénétiques d&#39;origine microbienne sont constitués de protéines membranaires sensibles à la lumière qui sont en mesure d&#39;activer (par exemple, channelrhodopsin-2, ChR2) ou silence (par exemple, halorhodopsine, NPHR) activité neurale types de cellules ingenetically définis plus comportemental délais pertinents. Nous démontrons d&#39;abord une approche simple pour la livraison de médiation virale adéno-associé de ChR2 et NPHR transgènes au subiculum dorsal et la région prélimbique du cortex préfrontal chez le rat. Parce que ChR2 et NPHR sont génétiquement ciblage, nous décrivons l&#39;utilisation de cette technologie pour contrôler l&#39;activité électrique de populations spécifiques de neurones (ie, les neurones pyramidaux) intégrés dans le tissu hétérogène avec une grande précision temporelle. Nous décrivons ici la, un logiciel personnalisé de matériell&#39;interface utilisateur et les procédures qui permettent la livraison simultanée de la lumière et de l&#39;enregistrement électrique de neurones pyramidaux transduites dans un anesthésié en préparation in vivo. Ces outils sensibles à la lumière offrent la possibilité d&#39;identifier les contributions causales de différents types de cellules pour le traitement d&#39;informations et de comportement.

La figure 1 montre une capture d&#39;écran du logiciel personnalisé (NeuroLux Pro) développé dans l&#39;environnement LabVIEW (National Instruments) utilisé pour l&#39;enregistrement simultané de l&#39;activité neuronale et le contrôle des paramètres d&#39;impulsions de lumière (c&#39;est à dire de fréquence d&#39;impulsion, largeur d&#39;impulsion, période de stimulation). Le logiciel envoie un signal de commande à un dispositif d&#39;acquisition numérique qui génère des impulsions TTL pour le contrôle sur le laser à diode unique. En outre, le programme affiche de logiciels et les magasins l&#39;activité neuronale enregistrée et signaux TTL livrés. Ces signaux sont numérisés par l&#39;intermédiaire du dispositif d&#39;acquisition à une fréquence d&#39;échantillonnage définie (par exemple, 20 kHz). Signaux sont enregistrés comme un tableau à deux dimensions en double précision dans un fichier binaire. La figure 2 montre la optrode personnalisé constitué par une électrode de tungstène fixé à une fibre optique. Une fibre optique est fixée à l&#39;aide de l&#39;électrode mince fil de suture à troisdes points. Si nécessaire, la super glue peut être utilisé pour les faire adhérer. Cependant, éviter de fixer définitivement la fibre optique à l&#39;électrode, car bien que l&#39;électrode peut être réutilisée plusieurs fois, transmission de la lumière à travers la fibre se dégrade avec l&#39;utilisation répétée et devrait être clivé et nettoyé ou remplacé à chaque insertion dans le cerveau. Panneaux gauche de la figure 3 montrent des images fluorescentes de la protéine fluorescente jaune, indiquant ChR2 réelle et l&#39;expression NPHR. Ces photographies montrent l&#39;expression de NPHR représentant chez le rat dorsale subiculum (figure 3A) et expression ChR2 dans le cortex prélimbique (figure 3B). Expression virale a été limitée principalement à la subiculum dorsal et le cortex prélimbique (par exemple, certains fluorescence a été observée dans le gyrus denté (figure 3A, à gauche)). Les pistes de l&#39;électrode (piste mince, tête de flèche) et la fibre optique (piste d&#39;épaisseur, flèche) ont également été observées. la figure 4 montre que ChR2 induite dopage temporellement précis chez le rat cortex prélimbique. figure 4A est un exemple de trace de potentiels d&#39;action ChR2 déclenchés en réponse à la livraison de 20 Hz de 10 ms des impulsions de lumière bleue de rat prélimbique cortex. Raster parcelle (figure 4B) montre l&#39;activation ChR2-induite dans six neurones représentatives. Tous les neurones enregistrés ont montré dopage lumière évoqués avec une fidélité parfaite. Contrairement à ChR2, NPHR rapidement et de façon réversible taire activité spontanée in vivo chez le rat prélimbique cortex (panneau de droite de la figure 4). Figure 4C est un exemple de trace montrant que continue 532 nm éclairage (10 s) du cortex prélimbique exprimer NPHR sous la promoteur de CaMKllα élimine l&#39;activité unitaire spontanée in vivo. A noter que la réduction au silence complète de l&#39;activité des cellules pyramidales prélimbique temps est asservie à la production d&#39;une lumière continue de 10 sec. Faibleer raster parcelle (figure 4D) montre silence NPHR-induite dans six neurones représentatives. Les deux enregistrements in vivo sont typiques de celles obtenues à partir de rats adultes Sprague-Dawley à laquelle la livraison médiée par AAV de gènes microbiens opsin s&#39;est produite 18 à 21 jours avant. La figure 5 montre le résultat d&#39;une stimulation répétée ChR2 d&#39;un neurone pyramidal prélimbique de rat. Impulsion de lumière bleue (10 msec) a été livré à 20 Hz pendant 5 sec (100 impulsions total). traces de tension du dopage lumière évoqués ont été acquis de manière répétée toutes les 2 min pendant une session d&#39;enregistrement de 2 heures (61 répétitions au total). Même lors de l&#39;utilisation de ce protocole de stimulation répétitive, ChR2 induite dopage stable et robuste en réponse à la livraison de la lumière. Les figures 6 et 7 montrent les résultats de photoinhibition NPHR induite par photoactivation et CHR2-entraînée de l&#39;activité du neurone de subicular de rat. Comme c&#39;est le cas dans le cortex prélimbique, NPHR et ChR2 ont pumédiation de l&#39;inhibition et l&#39;activation des neurones subicular opsin transduites avec une grande reproductibilité temps-verrouillé induite lumière. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Figure 1. Capture d&#39;écran de l&#39;interface du logiciel Pro NeuroLux pour la livraison de la lumière et l&#39;enregistrement simultanés électrophysiologique. Trace photo montre silence NPHR induite de l&#39;activité spontanée de rat cellules pyramidales prélimbique en réponse à 10 secondes de la prestation de lumière nm continu 532. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Figure 2. Image haute puissance de optrode personnalisé. Une fibre optique est introduite dans un tube capillaire en verre fixé à une électrode en tungstène et fixé à l&#39;électrode en utilisant un fil de suture. La distance centre-à-centre entreen la pointe de l&#39;électrode et la pointe de la fibre est d&#39;environ 500 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Figure 3. Expression virale et le placement de optrode. (Gauche) Les photographies montrent l&#39;expression de NPHR représentant dorsal subiculum (A) et d&#39;expression dans le cortex ChR2 prélimbique (B). (À droite) Schéma qui représente l&#39;endroit où chaque photo a été prise. La pointe de flèche et la flèche dans chaque photographie indiquent l&#39;emplacement de l&#39;électrode en tungstène et la fibre optique, respectivement. SUB: subiculum, DG: gyrus denté, PL:. Cortex prélimbique <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Figure 4. In vivo des enregistrements électrophysiologiques du ChR2 ou prelimb de rat NPHR transduitescortex ic. (A) Exemple de trace de potentiels d&#39;action ChR2 déclenchés en réponse à la livraison de 20 Hz de bleu (473 nm) des impulsions de lumière (10 ms, bar bleu). (B) parcelle de Raster montrant dopage ChR2-induite dans six neurones représentatives. Chaque unité d&#39;activité est tracée en un point. (C) Exemple de trace de suppression NPHR-induite de l&#39;activité spontanée pendant vert continu (532 nm) de lumière d&#39;illumination (10 sec, barre verte). (D) parcelle de Raster montrant silence NPHR-induite dans six neurones représentatives. Chaque unité d&#39;activité est représentée par un point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Figure 5. Dopage répétitif 20 Hz ChR2-sortie d&#39;un neurone pyramidal de prélimbique de rat in vivo. (A) Tension traces du dopage lumière évoquéeacquise au niveau des points de temps 0, 30, 60, 90, 120 minutes après le début des enregistrements. (B) parcelle de Raster montrant les 61 répétitions (2 min d&#39;intervalle entre les essais, 120 min au total) de l&#39;activation induite par la lumière. Chaque unité d&#39;activité est représentée par un point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Figure 6. In vivo des enregistrements électrophysiologiques du NPHR transduction rat dorsale subiculum. (A) Exemple trace montrant que 10 sec continu 532 nm éclairage (barre verte) du subiculum dorsal exprimer NPHR élimine l&#39;activité spontanée. (B) des formes d&#39;onde moyenne des deux unités enregistrées à partir de la trace ci-dessus. Le seuil d&#39;amplitude a été utilisée pour identifier deux neurones distincts. (C) parcelle de Raster montrant cinq répétitions de silence NPHR-induite de ces unités. Chaque unité d&#39;activité est tracée en un point. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Figure 7. Répétitif 20 Hz entraîné CR2-dopage d&#39;un rat dorsale subicular neurone in vivo. (A) Tension traces de la lumière évoquée dopage acquis aux points de temps 0, 30, 60, 90, 120 min après le début des enregistrements. Encart: activité typique de l&#39;éclatement de cette cellule. (B) parcelle de Raster montrant les 61 répétitions (2 min d&#39;intervalle entre les essais, 120 min au total) de l&#39;activation induite par la lumière. Chaque unité d&#39;activité est représentée par un point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

Le développement récent des outils de neurosciences qui combinent la génétique et de l&#39;optique, appelée &quot;optogenetics&quot;, permet le contrôle de l&#39;activité des circuits neuronaux avec un niveau de résolution spatiale et temporelle sans précédent. Ici, nous fournissons un protocole pour l&#39;intégration dans l&#39;enregistrement in vivo avec la manipulation de sous-ensembles optogenetic génétiquement définies de neurones pyramidaux du cortex préfrontal et subicular.

Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'activer ou de silencer rapidement des populations neuronales définies génétiquement à une échelle de temps physiologiquement pertinente. Cela est réalisé en délivrant un vecteur viral portant des transgènes codant pour l'opsine du canal activant les neurones par la lumière bleue ou l'opsine hall silençant les neurones par la lumière verte à des neurones définis génétiquement. Dans un deuxième temps, on construit une voie ophtalmique émettant de la lumière, constituée d'une fibre optique fixée à une électrode d'enregistrement, ce qui permet une délivrance simultanée de lumière et un enregistrement électrique.Ensuite, le TRO est positionné au-dessus et abaissé dans la région cérébrale transduite par l'opsine. Afin d'évoquer des réponses médiées par l'opsine canal et l'opsine ha, des résultats sont obtenus qui montrent l'activation et l'inhibition induites par la lumière des neurones transduits par l'opsine canal rouge et l'ha halline, selon la technique d'enregistrement unitaire unique permettant l'enregistrement de neurones individuels. Cette méthode répond à un besoin fondamental en neurosciences en nous permettant de déterminer précisément à quel point la lumière peut être efficace pour induire une activité neuronale avec une résolution temporelle de l'ordre de la milliseconde et dans des sous-types neuronaux spécifiques, et c'est Chin Nakamura qui démontrera cela.Un postdoctorant dans mon laboratoire doit s'assurer que les procédures de niveau de biosécurité 1 sont respectées lors de la préparation et de la manipulation du virus, et que toutes les directives locales et gouvernementales relatives aux animaux sont observées. Avant l'injection stéréotaxique, laissez un aliquot de virus dégeler sur de la glace, puis centrifugez brièvement. Dans une centrifugeuse de banc, remplissez lentement une seringue en verre Hamilton et son aiguille avec une petite quantité d'huile de silicone ou d'huile minérale.Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air visible dans le corps de la seringue. Insérez la seringue dans une pompe micro-injecteur et fixez la pompe directement sur le bras stéréotaxique vertical. Après avoir placé le tube d'aliquot de virus en position stable, abaissez le bras stéréotaxique jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille touche le fond du tube d'aliquot de virus.Utilisez le contrôleur de la pompe micro-injecteur pour prélever le volume souhaité de virus. Après avoir anesthésié un rat avec de la kétamine et de la xylazine, vérifiez la réponse réflexe à une pincée des orteils afin de garantir une profondeur d'anesthésie adéquate en utilisant des méthodes aseptiques standard. Placez l'animal dans un appareil stéréotaxique après avoir pratiqué une incision médiane à travers la peau au sommet du crâne de l'animal à l’aide de petites ciseaux chirurgicaux ou d’un bistouri.Séparez délicatement le tissu conjonctif et nettoyez le dessus du crâne à l’aide d’un petit grattoir osseux. Abaissez l’aiguille et vérifiez que les coordonnées Z du bgma et du lambda sont égales afin de confirmer que la tête est bien horizontale. Déplacez ensuite le bras stéréotaxique aux coordonnées correspondant à la structure cérébrale d’intérêt.Marquer l'emplacement prévu pour l'injection à l'aide d'un stylo chirurgical. Utiliser une perceuse portative pour amincir soigneusement le crâne au-dessus de la zone ciblée. S'arrêter lorsque le foret atteint le fond du crâne et utiliser une pince extra-fine pour retirer l'os aminci.Une fois que la dure-mère est exposée, positionnez l'aiguille de la seringue au-dessus de la zone cible et abaissez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche la dure-mère. Utilisez ensuite ce point pour calculer le z. Coordonnée, puis abaissez très lentement l'aiguille d'injection dans le cerveau jusqu'à ce que la position Z appropriée soit atteinte.Dans ce protocole, la région prélimbique du cortex préfrontal médian est ciblée. Injecter le virus à un débit de 0,1 microlitre par minute. Une fois l'injection terminée, attendre 10 minutes avant de retirer l'aiguille afin d'éviter un reflux du virus vers la surface du cerveau.Après avoir utilisé un point de suture continu avec aiguille attachée pour fermer la peau, appliquer des antibiotiques sur la plaie. Fixer d'abord une électrode en tungstène d'une à 1,5 mégohm à un tube capillaire en verre à l'aide de colle cyanoacrylate. Puis, utiliser un outil d'épluchage de fibre pour dénuder l'extrémité d'une fibre optique multimode et nettoyer très légèrement l'extrémité de la fibre avec de l'éthanol.Entailler la pointe de la fibre avec un couteau en diamant de forme en coin et utiliser une pince fine pour retirer délicatement l'excès de fibre. La fibre doit se rompre facilement au niveau de l'entaille. Utiliser un puissancemètre optique pour mesurer l'intensité du laser à l'extrémité de la fibre optique.Pour les enregistrements in vivo, une intensité lumineuse aussi faible que 20 à 100 milliwatts par millimètre carré peut de façon fiable induire respectivement l'activation ou la silenciation médiée par les canaux redsin ou hallin de l'activité neuronale. Ensuite, insérez la fibre optique dans le tube capillaire. Positionnez l'extrémité de la fibre à environ 500 microns au-dessus de l'extrémité de l'électrode en tungstène et nouez un fin fil de suture deux fois en quelques points près de l'extrémité, de sorte que l'électrode et la fibre restent bien droites.Veillez à ce que la distance entre l'extrémité de l'électrode et le nœud le plus proche soit suffisamment longue pour permettre l'insertion dans la région cible, comme illustré ici. Préparez l'animal pour la chirurgie comme précédemment. Utilisez ensuite la craniotomie initiale comme guide pour réaliser une nouvelle fenêtre petite et propre dans le crâne.Pour positionner le tro. Utilisez une aiguille fine pour pratiquer une petite incision sur la dure-mère. Abaissez délicatement le TRO à travers la fenêtre crânienne et dans le cerveau jusqu'à la région transduite à l'aide d'un micromanipulateur.Ensuite, avancez lentement hors route par paliers de 10 à 50 micromètres jusqu'à l'apparition d'une cellule sensible à la lumière. Ici, une interface utilisateur personnalisée développée dans LabVIEW est utilisée pour commander le laser à diode unique et pour visualiser et enregistrer l'activité neuronale en cours. Les signaux enregistrés sont capturés à l'aide d'un amplificateur ex AMP 20 K filtré par un filtre passe-bande de 0,3 à huit kilohertz et d'une carte analogique-numérique de National Instruments.L'interface utilisateur de Neuro Lux Pro permet de choisir les entrées analogiques et la sortie numérique. Sélectionnez deux canaux analogiques pour le signal neuronal et la logique transistor-transistor, ou TTL. Réglez la fréquence d'échantillonnage à 20 kilohertz, la période de base avant l'éclairage à deux secondes et la période après l'éclairage à deux secondes.Ensuite, régler la largeur d'impulsion, la fréquence et la période de stimulation du laser TTL. Ici, la fréquence est de 20 hertz et la période de stimulation est de 500 millisecondes, ce qui signifie que 10 impulsions laser de largeur définie sont délivrées. L'utilisateur peut choisir entre une délivrance lumineuse continue ou des enregistrements répétés.Ils peuvent choisir l'intervalle entre les impulsions et le nombre de trains d'impulsions. Les données peuvent être acquises avec ou sans enregistrement sur disque après l'enregistrement. L'animal est sacrifié selon des procédures approuvées et le tissu cérébral est traité pour vérifier la position de l'électrode et l'expression de l'opsine, comme illustré ici.Cette capture d'écran de l'interface logicielle Neuro LX Pro configurée pour la délivrance simultanée de lumière et l'enregistrement électrophysiologique montre l'inhibition induite par Hall Rod Dobson de l'activité spontanée d'une cellule paramétrique prélimbique du rap en réponse à 10 secondes de lumière continue de 532 nanomètres. Cette photographie montre une expression représentative de hallo redsin dans l'ulu dorsal. Le schéma à droite représente l'emplacement où la photographie a été prise.La flèche indique la position de l'électrode en tungstène et la flèche pointe la position de la fibre optique. Cette photographie montre une expression représentative de l'opsine canal dans le cortex prélimbique. Encore une fois, le schéma à droite représente l'emplacement où la photographie a été prise.La flèche indique la position de l'électrode en tungstène et la flèche la position de la fibre optique. Cet exemple d'enregistrement provenant du cortex prélimbique de rat montre que Channel Redsin déclenche deux potentiels d'action en réponse à une stimulation lumineuse bleue de 473 nanomètres à 20 hertz, avec des impulsions de 10 millisecondes chacune, comme indiqué par la barre bleue ci-dessous. Le diagramme en raster montre la génération de potentiels d'action induits par Channel Redsin dans six neurones représentatifs.Chaque activité unitaire est représentée par un point. Ce tracé exemple montre une suppression induite par l'opsine hall de l'activité spontanée pendant une illumination continue de lumière verte de 532 nanomètres pendant 10 secondes, comme indiqué par la barre verte, dans la même région cérébrale. Le tracé en raster montre le blocage induit par l'haller dosin dans six neurones représentatifs.Chaque activité unitaire est représentée par un point. Cette image montre des décharges répétitives à 20 hertz induites par un canalrhodopsine dans un neurone paramétal pré-limbique de rat in vivo. Les tracés de tension des décharges provoquées par la lumière, enregistrés aux temps 0, 30, 60, 90 et 120 minutes après le début de l'enregistrement, sont affichés sur le côté gauche. Sur le côté droit, le diagramme en raster montre les 61 répétitions de l'activation induite par la lumière.Chaque activité unitaire est représentée par un point. Ici, des enregistrements électrophysiologiques in vivo provenant du SNC dorsal de rat transduit par Haller Dossin sont montrés en haut. L'exemple de trace démontre que 10 secondes d'illumination continue à 532 nanomètres, indiquée par la barre verte du subm dorsal exprimant Hall Dobson, éliminent l'activité spontanée.Voici les formes d'onde moyennes des deux unités enregistrées issues de l'enregistrement ci-dessus. Le seuil d'amplitude a été utilisé pour identifier deux neurones distincts. Enfin, le diagramme en raster montre cinq répétitions de l'inhibition induite par Haller dossin de ces unités.Chaque activité unitaire est représentée par un point. Enfin, cette image montre les décharges répétitives à 20 hertz induites par l'opsine du canal dans un neurone dorsal subulaire de rat in vivo, enregistrées en tension, provoquées par la lumière, acquises aux temps 0, 30, 60, 90 et 120 minutes. À gauche, sont représentées les enregistrements depuis le début ; l'encart ci-dessous montre l'activité en salves typique de cette cellule.Le graphique raster à droite montre les 61 répétitions de l'activation induite par la lumière. L'activité de chaque unité est représentée par un point. Cette technique est importante car elle démontre que des sous-types neuronaux spécifiques peuvent être activés ou silencieux pendant de longues périodes.En fait, nous avons démontré que nous pouvons activer des neurones pendant plus de deux heures et y appliquer des stimulations. L'objectif ultime consisterait à appliquer cette méthode à un animal en comportement, c'est-à-dire à des animaux réalisant des tâches d'attention ou de mémoire, afin de pouvoir activer des circuits spécifiques et observer comment cela régule différentes fonctions mnésiques.

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