Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels In vivo

L’objectif global de l’expérience suivante est d’activer ou de réduire au silence rapidement des populations neuronales génétiquement définies sur une échelle de temps physiologiquement pertinente. Ceci est réalisé en délivrant un vecteur viral portant des transgènes qui codent le canal d’activation des neurones de lumière bleue opsine ou le neurone de lumière verte silençant le hall de silençage de l’opsine vers des neurones génétiquement définis. Dans un deuxième temps, une route électroluminescente est construite, composée d’une fibre optique fixée à une électrode d’enregistrement, ce qui permet une diffusion simultanée de la lumière et de l’enregistrement électrique.

Ensuite, le TRO est positionné au-dessus et abaissé dans la région cérébrale transduite par l’opsine. Afin d’évoquer les réponses médiées par les canaux opsine et ha opsine, on obtient des résultats qui montrent l’activation et l’inhibition induites par la lumière des neurones transductés par les canaux redsine et ha hallin sur la base de la technique d’enregistrement unitaire unique qui permet l’enregistrement de neurones individuels. Cette méthode répond à un besoin fondamental en neurosciences en nous permettant de déterminer exactement l’efficacité de la lumière pour stimuler l’activité neuronale avec une résolution temporelle de l’ordre de la milliseconde et dans des sous-types neuronaux spécifiques.

S’assurer que les procédures de biosécurité de niveau un sont suivies lors de la préparation et de la manipulation du virus, et que toutes les directives locales et gouvernementales relatives aux animaux sont respectées. Avant l’injection stéréotaxique, laissez une aliquote du virus décongeler sur de la glace, puis tournez brièvement vers le bas. Dans une centrifugeuse de paillasse, remplissez lentement une seringue et une aiguille en verre Hamilton avec une petite quantité de silicone ou d’huile minérale.

Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air visibles dans le corps de la seringue. Insérez la seringue dans une pompe à micro-injecteur et fixez la pompe directement sur le bras stéréotaxique vertical. Après avoir placé le tube aliquote viral en position stable, abaissez le bras stéréotaxique jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille touche le bas du tube aliquote viral.

Utilisez le contrôleur de la pompe du micro-injecteur pour prélever le volume souhaité de virus. Après avoir anesthésié un rat avec de la kétamine et de la xylazine, vérifiez la réponse réflexe à un pincement de l’orteil pour assurer une profondeur d’anesthésie adéquate à l’aide de méthodes aseptiques standard. Placez l’animal dans un appareil stéréotaxique après avoir pratiqué une incision médiane à travers la peau au-dessus du crâne de l’animal avec de petits ciseaux chirurgicaux ou un scalpel.

Séparez doucement le tissu conjonctif et nettoyez le haut du crâne avec un petit grattoir à os. Abaissez l’aiguille et vérifiez que les coordonnées Z pour bgma et lambda sont égales pour établir que la tête est de niveau. Déplacez ensuite le bras stéréotaxique aux coordonnées correspondant à la structure cérébrale d’intérêt.

Marquez le site d’injection prévu avec un stylo chirurgical. Utilisez une perceuse à main pour amincir soigneusement le crâne sur la zone cible. Arrêtez-vous lorsque le foret atteint le bas du crâne et utilisez une paire de pinces extra fines pour retirer l’os aminci.

Une fois la dure-mère exposée, placez l’aiguille de la seringue sur la zone cible et abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche la dure-mère. Et utilisez ce point pour calculer la z. Coordonnez maintenant, abaissez très lentement l’aiguille d’injection dans le cerveau jusqu’à ce que la position Z appropriée soit atteinte.

Dans ce protocole, la région prélimbique du cortex préfrontal médian est ciblée. Injectez le virus à un rythme de 0,1 microlitre par minute. Une fois l’injection terminée, attendez 10 minutes avant de retirer l’aiguille pour éviter le reflux du virus à la surface du cerveau.

Après avoir utilisé une suture de couture avec une aiguille attachée pour sceller la peau, appliquez des antibiotiques sur la plaie. Tout d’abord, fixez une électrode de tungstène d’un à 1,5 méga ohm à un tube capillaire en verre à l’aide de superglue. Ensuite, utilisez un outil de dénudage de fibre pour exposer l’extrémité nue d’une fibre optique multimode et nettoyez très légèrement l’extrémité de la fibre avec de l’éthanol.

Entaillez la pointe de la fibre avec un couteau diamanté en forme de coin et utilisez des pinces fines pour retirer soigneusement l’excès de fibre. La fibre doit se cliver facilement au moment de la rainure. Utilisez un wattmètre optique pour mesurer l’intensité du laser à l’extrémité de la fibre optique.

Pour les enregistrements in vivo, une intensité lumineuse aussi faible que 20 à 100 milliwatts par millimètre carré peut évoquer de manière fiable l’activation ou le silence médié par la redsine ou la halline de l’activité neuronale respectivement. Ensuite, insérez la fibre optique dans le tube capillaire. Positionnez l’extrémité de la fibre à environ 500 microns au-dessus de l’extrémité de l’électrode de tungstène et attachez deux fois un fil de suture mince à quelques points près de l’extrémité afin que l’électrode et la fibre soient droites.

Assurez-vous que la distance entre la pointe de l’électrode et le nœud le plus proche est suffisamment longue pour l’insertion dans la région cible, comme on le voit ici. Préparez l’animal pour la chirurgie comme précédemment. Ensuite, utilisez la craniotomie initiale comme guide pour faire une nouvelle petite fenêtre propre dans le crâne.

Pour positionner le tro. Utilisez une aiguille fine pour faire une petite incision sur la dure-mère. Abaissez soigneusement le TRO à travers la fenêtre du crâne et dans le cerveau jusqu’à la région transduite à l’aide d’un manipulateur microm.

Avancez ensuite lentement le tout-terrain par pas de 10 à 50 microns jusqu’à l’émergence d’une cellule réactive à la lumière. Ici, une interface utilisateur logicielle personnalisée écrite en vue laboratoire est utilisée pour contrôler le laser à diode unique et pour visualiser et enregistrer l’activité neuronale en cours. Les signaux enregistrés sont capturés à l’aide d’un amplificateur ex AMP 20 K filtré de 0,3 à huit kilohertz et d’une carte analogique-numérique d’un instrument national.

L’interface utilisateur neuro lux Pro permet de choisir les entrées analogiques et les sorties numériques. Choisissez deux canaux analogiques pour le neuronal et le transistor, la logique du transistor ou le signal TTL. Réglez la fréquence d’échantillonnage à 20 kilohertz, la période de référence avant l’éclairage à deux secondes et la période après l’éclairage à deux secondes.

Réglez ensuite la largeur d’impulsion de stimulation laser TTL, la fréquence et la période de stimulation. Ici, la fréquence est de 20 hertz et la période de stimulation est de 500 millisecondes, ce qui signifie que 10 impulsions laser avec une largeur d’impulsion définie sont délivrées. L’utilisateur peut choisir soit une distribution continue de la lumière, soit des enregistrements répétés.

Ils peuvent choisir l’intervalle entre les impulsions et le nombre de déformations d’impulsions. Les données peuvent être acquises avec ou sans enregistrement sur disque après l’enregistrement. L’animal est sacrifié selon des procédures approuvées et le tissu cérébral est traité pour vérifier le placement de l’érosion et l’expression de l’opsine, comme indiqué ici.

Cette capture d’écran de l’interface logicielle de Neuro LX Pro configurée pour l’administration simultanée de lumière et l’enregistrement électrophysiologique montre que Hall Rod Dobson a induit le silence de l’activité spontanée de la cellule paramétallique pré-limbique en réponse à 10 secondes de diffusion continue de lumière de 532 nanomètres. Cette photographie montre l’expression représentative de hallo redsin dans l’ulu dorsal. Le schéma de droite représente l’endroit où la photographie a été prise.

La pointe de flèche indique la position de l’électrode de tungstène et la flèche indique la position de la fibre optique. Cette photographie montre l’expression représentative de l’opsine dans le cortex prélimbique. Encore une fois, le schéma de droite représente l’endroit où la photo a été prise.

La pointe de flèche indique la position de l’électrode de tungstène et la flèche indique la position de la fibre optique. Cet exemple de trace enregistrée à partir du cortex prélimbique du rat montre le canal redsin deux potentiels d’action déclenchés en réponse à une livraison de 20 hertz de 473 nanomètres bleus, des impulsions lumineuses de 10 millisecondes chacune, comme indiqué par la barre bleue. Sous. Le graphique matriciel montre le pic induit par le redsin de canal dans six neurones représentatifs.

Chaque activité unitaire est représentée par un point. Cet exemple de trace montre la suppression de l’activité spontanée induite par l’opsine Hall pendant un éclairage continu de lumière verte de 532 nanomètres pendant 10 secondes, comme indiqué par la barre verte dans la même région du cerveau. Le graphique matriciel montre le silence induit par la dosine de Haller dans six neurones représentatifs.

Chaque activité unitaire est représentée par un point. Cette image montre un pic répétitif de 20 hertz induit par l’opsine d’un neurone paramétallique prélimpique chez le rat, des traces de tension in vivo de la lumière évoquée, des pointes, acquises aux points de temps 0, 30, 60, 90 et 120 minutes après le début des enregistrements sont affichées sur le côté gauche. Sur le côté droit, le graphique matriciel montre les 61 répétitions de l’activation induite par la lumière.

Chaque activité unitaire est représentée par un point. Ici, in vivo, des enregistrements électrophysiologiques de Haller Dossin transduits du rat dorsal sicm sont montrés en haut. L’exemple de trace démontre qu’un éclairage continu de 532 nanomètres de 10 secondes indiqué par la barre verte du sous-m dorsal exprimant Hall Dobson élimine l’activité spontanée.

Vous trouverez ci-dessous les formes d’onde moyennes des deux unités enregistrées à partir de la trace ci-dessus. Le seuil d’amplitude a été utilisé pour identifier deux neurones distincts. Enfin, le graphique matriciel montre cinq répétitions de l’inactivation de ces unités induite par la dossine de Haller.

Chaque activité unitaire est représentée par un point. Enfin, cette image montre un pic répétitif de 20 hertz induit par l’opsine d’un neurone subulaire dorsal de rat Traces de tension in vivo de la lumière évoquée, le dopage, acquis aux points temporels 0, 30, 60, 90 et 120 minutes. Une fois que le début des enregistrements est montré à gauche, l’encart ci-dessous montre l’activité d’éclatement typique de cette cellule.

Le graphique matriciel de droite montre les 61 répétitions de l’activation induite par la lumière. Chaque activité unitaire est représentée par un point. Cette technique est importante car elle démontre que des sous-types neuronaux spécifiques peuvent être activés ou réduits au silence pendant de longues périodes.

En fait, nous avons démontré que nous pouvons activer des neurones pendant plus de deux heures et appliqués. En fin de compte, l’objectif serait d’appliquer cela à l’animal qui se comporte chez les animaux qui effectuent des tâches d’attention ou de mémoire afin que nous puissions activer des circuits spécifiques et voir comment cela contrôle différentes fonctions de mémoire.