Embryon de poulet moelle épinière culture Tranche Protocole

L’objectif général de cette procédure est de cultiver des tranches d’embryons de poulet pour maintenir un développement neuronal normal, en particulier des motoneurones de la colonne vertébrale. Ceci est accompli en disséquant d’abord l’embryon de poulet pour enlever les organes viscéraux. La deuxième étape consiste à préparer et à trancher l’embryon nourri dans un bloc d’agarro.

Ensuite, la tranche d’embryon est soigneusement retirée de l’agarro. La dernière étape consiste à transférer la tranche d’embryon dans un milieu de culture, qui est incubé pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence sur des sections minces de la tranche d’embryon est utilisée pour montrer la présence et l’emplacement des motoneurones de la colonne vertébrale après la période de culture.

Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie du développement. Par exemple, les mécanismes et les molécules impliqués dans la migration des motoneurones spinaux. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car beaucoup de soins sont nécessaires pendant les étapes de dissection du protocole.

Placez les 10 œufs fécondés avec le côté le plus long horizontalement dans un incubateur à tirage forcé à 38 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade 24 de hamburger et de Hamilton. Cela nécessite généralement environ quatre jours d’incubation. Le deuxième jour d’incubation, stérilisez la coquille de l’œuf en l’essuyant avec un papier de soie imbibé d’éthanol à 70 %, percez soigneusement l’extrémité plate de la coquille de l’œuf à l’aide d’une aiguille de calibre 21 attachée à une seringue de cinq millilitres et retirez cinq millilitres d’albumine.

Cela abaisse l’embryon loin de la coquille afin que l’embryon ne soit pas endommagé lorsque la coquille est ouverte. Remettez les œufs dans l’incubateur et incubez-les pendant deux jours supplémentaires. Une fois les deux jours écoulés, utilisez émoussé.

Faites-en plus. Numéro cinq, forceps pour percer soigneusement le milieu supérieur de la coquille et retirer environ neuf centimètres carrés de coquille. Coupez autour de l’embryon et soulevez soigneusement l’embryon et placez-le dans HBSS.

Pour la dissection. Tous les embryons utilisés doivent être proches du stade 24. Tous les embryons qui présentent des signes d’anomalie doivent être jetés.

Placez la boîte contenant l’embryon sous un microscope de dissection. Utilisez deux pinces numéro cinq pour retirer la membrane de l’amnion. Le chorio Alan à la membrane, l’Alan Tous et la tête ensuite éviscèrent l’embryon pour enlever tous les organes internes en utilisant des ciseaux de dissection micros pour ouvrir la ligne médiane ventrale de l’embryon.

Tenez ensuite l’embryon autour de la région du tronc rostral avec une paire de pinces. Saisissez la partie rostrale de l’intestin et le cœur et tirez. Trimestriel. Vous devriez être en mesure de voir clairement les somites embryonnaires.

Coupez maintenant la paroi thoracique du corps à l’aide de ciseaux de microdissection. Ensuite, coupez l’embryon en deux transversalement entre les bourgeons des membres supérieurs et inférieurs. Retirez délicatement la moitié lombaire de l’embryon disséqué à l’aide de deux pinces pour bercer l’embryon hors de la solution de dissection et placez-le dans une boîte de Pétri sèche à l’aide d’une pipette à pâtes jetable d’environ cinq centimètres.

Couper par le bas, aspirer environ deux millilitres de fondu 4 % en poids par volume. Aros dans la pipette PBS environ 0,5 millilitres d’aros sur l’embryon, puis aspirez le morceau d’embryon dans la pipette. Transférez l’embryon et les aros dans un moule en plastique décollable sans introduire de bulles dans les aros.

Abaissez doucement l’embryon au fond de l’aros dans le moule en plastique avec la section thoracique vers le bas et utilisez une aiguille de calibre 25 pour vous assurer que l’embryon est droit. L’agros contiendra également une partie du membre en développement et il est important que les embryons positionnés verticalement dans les aros pour permettre cela placent le moule en plastique sur la glace pendant environ deux minutes. Pour régler les aros, veillez à ce que l’embryon ne change pas d’orientation pendant cette période.

Installez un modèle similaire à celui du VT 1000 S de manière à ce que la chambre soit remplie de HBSS et entourée de glace. Eau froide. Utilisez de la super colle pour fixer le bloc aros à la plate-forme Vibram, puis coupez le bloc avec une lame de rasoir pour laisser le morceau d’embryon avec un à trois millimètres d’aros qui l’entourent.

Démarrez le vibrato et commencez à trancher l’embryon. Les tranches qui comprennent des sections de bourgeons de membre avec une crête électrodermale apicale claire sont sélectionnées, puis transférées dans une boîte de HBSS. En général, il n’y a qu’une à deux tranches appropriées par embryon.

Retirez délicatement l’agarose autour des tranches de tissu à l’aide de deux aiguilles. Il est essentiel que cela soit fait de manière approfondie et soigneuse. Ajoutez 500 microlitres de solution de culture au nombre requis de puits d’une culture tissulaire à très faible fixation de 24 puits.

Transférez soigneusement les tranches de la solution HBSS dans le puits, en plaçant deux ou trois tranches dans chaque puits, puis placez la plaque à 24 puits dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures après la période de culture à 500 microlitres de fixation non tamponnée à chaque puits de tranches d’embryons et laissez sur la glace pendant 20 minutes. Ensuite, aspirez soigneusement la solution totale et lavez trois fois dans du PBS à des intervalles de cinq minutes. Ajoutez ensuite 30 % de saccharose dans du PBS dans les puits et placez la plaque à quatre degrés Celsius pendant environ six heures ou plus jusqu’à ce que les tranches coulent.

Une fois que les tranches ont coulé, déplacez-les dans une boîte de Pétri propre de 10 centimètres et tamponnez la solution de saccharose supplémentaire. Ajoutez ensuite un millilitre d’OCT et laissez les tranches s’équilibrer pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Montez chaque tranche à plat dans un moule en plastique décollable rempli d’OCT après le montage.

Placez les moules verticalement sur de la glace carbonique pour solidifier, montez les blocs OCT sur le cryostat et équilibrez les blocs à moins 24 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Ensuite, coupez chaque tranche en sections de 15 microns et montez-la sur des diapositives super frosts plus. Les lames peuvent être stockées à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires pour la coloration immunofluorescente, comme indiqué dans la partie texte du protocole, cette image montre l’état de génération de la colonne motrice latérale au stade 24 du hamburger et de Hamilton.

La division latérale de la colonne motrice latérale est visualisée par une coloration LH X one dans le panneau gauche. La colonne motrice latérale est visualisée par coloration avec Fox P un dans le panneau central et le panneau droit est une fusion des deux canaux. La ligne médiane est représentée par une ligne pointillée et DV désigne ici l’axe ventral dorsal.

L’état de la division latérale de la colonne motrice latérale est à nouveau montré par LH X, une coloration dans le panneau gauche et la colonne motrice latérale par Fox P, une coloration dans le panneau central avec l’image fusionnée à droite. Ces images montrent l’évolution au stade 27. Ces images montrent l’expression de LH X une à gauche et celle de Fox P une expression dans le panneau du milieu en sections d’une tranche cultivée dans un milieu qui soutient la survie dissociée des cellules du motoneurone crânien.

LH X one n’est plus exprimé dans les motoneurones, bien qu’il y ait une certaine survie des cellules LMC mise en évidence par l’expression de Fox P one. DV représente l’orientation de l’axe ventral dorsal de la moelle épinière, et ML représente l’orientation de l’axe latéral médian de la colonne motrice latérale de la moelle épinière. Des cellules de division latérale, à nouveau colorées pour LH X, une dans la corne ventrale dans le panneau gauche et la LMC en général colorée pour Fox P une dans le panneau central, peuvent être observées en tranches, cultivées dans un milieu contenant 4 % de sérum de poulet et 100 nanogrammes par millilitre de CNTF.

Notez que certaines cellules de division latérale de la colonne motrice se trouvent en position latérale dans la corne ventrale, comme l’indique la flèche dans le panneau de gauche. Cette image montre l’état d’expression de LH X one et de Fox P one dans des sections d’un embryon conservé dans OVO pendant la culture en tranches de l’embryon précédemment montrée. Cet histogramme montre les résultats de la quantification du pourcentage de cellules de division latérale de la colonne motrice, qui colorent FOX P un positif et LHX un positif par rapport aux cellules de la colonne motrice latérale, qui colorent FOX P un positif et LHX un.

Des données négatives sont montrées pour les cellules trouvées dans des cultures de tranches dans des conditions différentes par rapport aux embryons témoins conservés in ovo, qui représentent 100 % des données ont été analysées à l’aide du test T des étudiants. Le triple astérisque représente un niveau de signification inférieur à 0,01 lors de la tentative de ce protocole. Il est important de faire attention lors de la dissection de l’embryon et lors du retrait de l’agros des tranches, car il est important de maintenir l’intégrité des axones moteurs dans le bourgeon des membres.