Embryon de poulet moelle épinière culture Tranche Protocole

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des tranches d'embryon de poulet afin de maintenir un développement neuronal normal, en particulier celui des motoneurones spinaux. Ceci est réalisé en premier lieu en disséquant l'embryon de poulet pour enlever les organes viscéraux. La deuxième étape consiste à préparer et à découper l'embryon inclus dans un bloc d'agarose.

Ensuite, la tranche d'embryon est soigneusement retirée de l'agar. La dernière étape consiste à transférer la tranche d'embryon dans un milieu de culture, qui est incubé pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Enfin, une microscopie en immunofluorescence sur des coupes minces de la tranche d'embryon est utilisée pour montrer la présence et la localisation des motoneurones spinaux après la période de culture.

Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la neurobiologie du développement. Par exemple, aux mécanismes et aux molécules impliqués dans la migration des motoneurones spinaux. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car une grande attention est requise durant les étapes de dissection du protocole.

Placer 10 œufs fécondés avec le côté le plus long horizontalement dans un incubateur à air forcé à 38 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade 24 de Hamburger et Hamilton. Cela nécessite généralement environ quatre jours d'incubation. Le deuxième jour d'incubation, stériliser la coquille d'œuf en essuyant avec un papier essuie-tout imbibé d'éthanol à 70 %, puis percer soigneusement l'extrémité plate de la coquille d'œuf à l'aide d'une aiguille de calibre 21 fixée à une seringue de cinq millilitres et retirer cinq millilitres d'albumine.

Cela éloigne l'embryon de la coquille afin que l'embryon ne soit pas endommagé lorsque la coquille est ouverte. Remettez les œufs dans l'incubateur et poursuivez l'incubation pendant deux jours supplémentaires. Une fois les deux jours écoulés, utilisez une pointe émoussée.

Faites davantage. Numéro cinq, utilisez une pince pour percer soigneusement le centre supérieur de la coquille et retirer un carré de coquille d'environ neuf centimètres de côté. Découpez tout autour de l'embryon, soulevez délicatement l'embryon et placez-le dans du HBSS.

Pour la dissection. Tous les embryons utilisés doivent être proches du stade 24. Tout embryon présentant des signes d'anomalie doit être éliminé.

Placer la boîte contenant l'embryon sous un microscope stéréo. Utiliser deux paires de forceps n°5 pour retirer la membrane amniotique. Puis la membrane chorioallantoïdienne, l'allantoïde et la tête ; ensuite, éviscérer l'embryon afin de retirer tous les organes internes en utilisant des ciseaux microchirurgicaux pour inciser la ligne médiane ventrale de l'embryon.

Ensuite, maintenez l'embryon autour de la région rostrale du tronc à l'aide d'une paire de forceps. Saisissez la partie rostrale de l'intestin et du cœur, puis tirez. Vous devriez être en mesure de voir clairement les somites de l'embryon.

À présent, découpez la paroi thoracique du corps à l’aide de ciseaux de microdissection. Ensuite, sectionnez transversalement l’embryon en deux moitiés entre les bourgeons des membres supérieurs et inférieurs. Retirez délicatement la moitié lombaire de l’embryon disséqué en utilisant deux pincettes pour soutenir l’embryon hors de la solution de dissection, puis placez-le dans une boîte de Pétri sèche à l’aide d’une pipette en plastique jetable d’environ cinq centimètres de long.

Couper par le bas, aspirer environ deux millilitres de 4 % poids par volume fondu. Dans du PBS, pipeter environ 0,5 millilitre d'aros sur l'embryon, puis aspirer le fragment d'embryon dans la pipette. Transférer l'embryon et l'aros dans un moule plastique démontable sans introduire de bulles dans l'aros.

Abaisser délicatement l'embryon au fond des aros du moule en plastique, la section thoracique orientée vers le bas, et utiliser une aiguille de calibre 25 pour s'assurer que l'embryon est bien droit. Les aros contiendront également une partie du membre en développement, et il est important que les embryons soient positionnés verticalement dans les aros ; pour cela, placer le moule en plastique sur de la glace pendant environ deux minutes. Pour solidifier les aros, veiller à ce que l'embryon ne change pas d'orientation durant cette période.

Installez un dispositif semblable au VT 1000 S foma de manière à ce que la chambre soit remplie d'HBSS et entourée de glace. Eau froide. Utilisez de la colle forte pour fixer le bloc d'aros sur la plateforme Vibram, puis taillez le bloc avec une lame de rasoir afin de laisser la pièce d'embryon entourée d'un à trois millimètres d'aros.

Démarrer le vibratome et commencer à découper l'embryon. Les tranches contenant des sections de bourgeons limbiques avec une crête ectodermique apicale bien visible sont sélectionnées, puis transférées dans une boîte de Pétri contenant du HBSS. Généralement, il n'y a qu'une à deux tranches appropriées par embryon.

Retirer délicatement l'agarose autour des tranches de tissu à l'aide de deux aiguilles. Il est essentiel de procéder de manière minutieuse et soigneuse. Ajouter 500 microlitres de solution de culture dans le nombre requis de puits d'une plaque de culture tissulaire de 24 puits à adhérence ultra faible.

Transférez soigneusement les tranches de la solution HBSS dans le puits en plaçant deux ou trois tranches dans chaque puits, puis placez la plaque 24 puits dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. À l’issue de la période de culture, ajoutez 500 microlitres de fixateur non tamponné dans chaque puits contenant les tranches d’embryon et laissez sur de la glace pendant 20 minutes. Aspirez ensuite complètement la solution et rincez trois fois avec du PBS par intervalles de cinq minutes. Ajoutez ensuite du saccharose à 30 % dans du PBS dans les puits et placez la plaque à quatre degrés Celsius pendant environ six heures ou plus, jusqu’à ce que les tranches coulent.

Une fois les tranches coulées, transférez-les dans une boîte de Pétri propre de 10 centimètres et absorbez l'excès de solution de saccharose. Ajoutez ensuite un millilitre d’OCT et laissez les tranches s'équilibrer pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Montez chaque tranche à plat dans un moule en plastique amovible rempli d’OCT après le montage.

Placer les moules verticalement sur de la glace sèche pour solidifier, monter les blocs OCT sur le cryostat et équilibrer les blocs à moins 24 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Ensuite, couper chaque tranche en sections de 15 micromètres et monter sur des lames super frosts plus. Les lames peuvent être conservées à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires pour la coloration immunofluorescente, comme indiqué dans la partie textuelle du protocole ; cette image montre l'état de la formation de la colonne motrice latérale au stade 24 de Hamburger et Hamilton.

La division latérale de la colonne motrice latérale est visualisée par une coloration au LH X one dans le panneau gauche. La colonne motrice latérale est visualisée par une coloration au Fox P one dans le panneau central, et le panneau droit représente la fusion des deux canaux. La ligne médiane est indiquée par une ligne pointillée et DV désigne ici l'axe dorso-ventral.

L'état de la division latérale de la colonne motrice latérale est de nouveau illustré par la coloration au LH X un dans le panneau gauche et par la colonne motrice latérale marquée au Fox P un dans le panneau central, l'image fusionnée étant présentée à droite. Ces images montrent le développement au stade 27. Elles montrent l'expression du LH X un à gauche et celle du Fox P un au centre, dans des sections d'une tranche cultivée dans un milieu permettant la survie des neurones moteurs crâniens dissociés.

LH X un n'est plus exprimé dans les motoneurones, bien qu'une certaine survie des cellules de la colonne motrice latérale soit mise en évidence par l'expression de Fox P un. DV représente l'orientation de l'axe dorso-ventral de la moelle épinière, et ML représente l'orientation de l'axe médio-latéral de la colonne motrice latérale de la moelle épinière. Les cellules de la division latérale, à nouveau marquées pour LH X un dans la corne ventrale dans le panneau gauche et la CML en général marquée pour Fox P un dans le panneau central, peuvent être observées sur des coupes cultivées dans un milieu contenant 4 % de sérum de poulet et 100 nanogrammes par millilitre de CNTF.

Remarquez que certaines cellules de la division latérale de la colonne motrice latérale se trouvent en position latérale dans la corne ventrale, comme indiqué par la flèche dans le panneau de gauche. Cette image montre l'état d'expression de LH X one et de Fox P one dans des sections d'un embryon maintenu en OVO pendant la culture de tranches de l'embryon précédemment montrée. Cet histogramme présente les résultats de la quantification du pourcentage de cellules de la division latérale de la colonne motrice latérale, qui sont positives pour FOX P one et LHX one, par rapport aux cellules de la colonne motrice latérale, qui sont positives pour FOX P one et négatives pour LHX one.

Des données négatives sont présentées pour les cellules observées dans des cultures de tranches sous différentes conditions par rapport aux embryons témoins maintenus in ovo, qui représentent 100 %. Les données ont été analysées à l'aide du test t de Student. Les trois astérisques indiquent un seuil de significativité inférieur à 0,01. Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de faire preuve de précaution lors de la dissection de l'embryon et lors du retrait des agros des tranches, car il est essentiel de préserver l'intégrité des axones moteurs dans l'bourgeon limbique.