Name: Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Découvrez une technique de microdissection et d'injection de colorant fluorescent pour tracer sélectivement les fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire d'embryons de poulet. Cette méthode permet une visualisation haute résolution des projections ganglionnaires acoustiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Candace Hsieh des suggestions et de l&#39;aide des techniques d&#39;imagerie et Dr Doris Wu d&#39;expertise sur l&#39;anatomie poussin oreille interne au cours de l&#39;embryogenèse précoce. Ce travail a été soutenu par la NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, et le DOE GAANN P200A120165.

1. Préparer les outils de dissection et réactifs suivants <ul><li> Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF, 130 mM NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM de glucose, 2 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO 4) perfusion continue avec 95% 2/5% de CO 2 à la température ambiante. Pour la perfusion, remplir au 2/3 de 500 ml à large ouverture Nalgene pot avec un trou percé dans le couvercle. Réservoir sera fixé par une tubulure à une tige de verre barboteur, qui pénètre dans la aCSF à travers le trou dans le couvercle du bocal. Régler la pression afin d&#39;obtenir un flux constant de bulles qui atteignent environ 1/3 du liquide, mais ne sont pas suffisamment puissants pour provoquer des éclaboussures au-dessus de la jante. Submerger 5 ml flacons de verre (jusqu&#39;à 6) dans le pot Nalgene pour séparer les échantillons individuels les uns des autres et de la turbulence de l&#39;écoulement de gaz. ACSF doit être oxygéné pendant au moins 20 min avant l&#39;une incubation de tissus. </li><li> Petit plat dissection de silicone (35 x 10 mmPetri mm revêtu en utilisant Sylgard Elastomere Kit) avec deux broches de dissection placés en polystyrène hexagonale petite (47 mm en bas) pèsent bateau. </li><li> Deux pinces à pointe fine, une pointe recourbée-pinces, un bécher de 50 ml, et un récipient pour les déchets de tissu. </li><li> Tiré de verre micropipette (1,2 OD / 0,9 ID) rompu à environ 20-50 um d&#39;ouverture à l&#39;extrémité et rempli avec de la rhodamine dextrane aminé (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) dans une solution de 6,25% avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS . Fixer par un tube fin pour picospritzer et stabiliser à micromanipulateur. </li></ul> 2. Micro-dissection pour révéler Papille basilaire à 4,5 E8 <ol><li> Avec des pinces courbes, couper E8 embryon juste en dessous du tronc cérébral, en plaçant directement sur la tête de dissection plat enduit de silicone à l&#39;intérieur de peser bateau. </li><li> Utilisant des broches de dissection, positionner la tête avec une vue ventrale afin de l&#39;oreille sur le côté de l&#39;intérêt est légèrement visible, la tête légèrement inclinée sur le dos et pointant 10-30 degrés loin de CEnter (figure 2A). Immédiatement fixer la tête avec des épingles. Si bilatérale traçage est désiré, un centre de la tête à 0 degrés, ou une vue plein ventrale afin que les deux côtés peuvent être consultées. De même, pour une injection du côté gauche, fixer la tête de -10 à -30 degrés à partir du centre de sorte que le côté gauche est accessible. </li><li> En utilisant le bécher de 50 ml, 30 ml de transférer aCSF oxygéné dans le plat, entièrement immerger le tissu. </li><li> Saisissez doucement vers le bas et le zeste de la mâchoire inférieure en utilisant une pince fine pointe, puis retirez la paupière inférieure sur le côté de l&#39;intérêt. </li><li> Retirez le tissu vasculaire sus-jacente, y compris tous les palais restant et l&#39;œsophage. Ces tissus mous devrait décoller révélant la surface lisse de développer chondrocrâne avec les artères vertébrales distinctifs à sa surface. À ce stade, la caractéristique masse blanche otoconial doit être visible. </li><li> Disséquer soigneusement la peau autour du conduit auditif externe, le cartilage de l&#39;articulation de la mâchoire et l&#39;oreille moyenne, tout en laissant l&#39;enner l&#39;oreille intacte. Utilisez la pince pour couper délicatement ces structures cartilagineuses. </li><li> Retirer artères vertébrales et l&#39;accumulation de sang à l&#39;aide d&#39;un léger mouvement de balayage avec les extrémités de la pince fine. Le sang peut obscurcir vue et la coagulation peut boucher l&#39;ouverture pipette d&#39;injection. </li><li> Le canal cochléaire avec épithélium sensoriel adjacente (papille basilaire) et le ganglion acoustique se trouve directement sous le chondrocrâne 6 et peut être visualisée comme une forme allongée en forme de doigt saillie s&#39;étendant à partir de l&#39;oreille interne ventralement, avec la pointe la plus distale (apex) près de la partie antérieure médiane 5. Il peut y avoir une petite accumulation de sang (rouge) de la dissection et / ou des calcifications otolithiques (blanc) à l&#39;apex de la cochlée conduit (figure 2B) qui peuvent aider à visualiser. Au sommet se trouve la macula lagenar, un patch sensorielle pensé pour être de la fonction vestibulaire 7,8. </li></ol> 3. Étiquetage sélective des fibres NC VIII auditif <ol><li&gt; Placez la pipette d&#39;injection près de la surface embryon à la région papille basilaire et conduit cochléaire. </li><li> Abaissez lentement la micropipette à première ponction du crâne. Cette région crânienne est plus mince que les zones environnantes et nécessite moins de force pour pénétrer. La micropipette devrait maintenant être à l&#39;intérieur du canal cochléaire. En option: une petite injection de colorant de traçage peut être faite ici pour aider à la visualisation de la papille basilaire. </li><li> Sans avoir à repositionner la micropipette, continuer à baisser jusqu&#39;à ce qu&#39;il seulement à l&#39;atteinte de la frontière profondeur du canal cochléaire (Figure 1). Effectuer une injection ici et répéter dans de multiples régions le long de la longueur de la papille basilaire (figures 2C, 2D), à l&#39;exclusion de la pointe la plus proximale où le lagena vestibulaire est situé. Avec le picospritzer mis entre 10-30 psi, plusieurs injections sont faites. Le volume de fluide injecté de colorant varie, et dépend du degré de marquage souhaitée. Chaque injection doit se traduire par un colorant fluorescent-laBeled place d&#39;environ 200 à 400 um de diamètre (figure 2D). </li><li> Une fois l&#39;injection terminée, utilisez une pince pour sectionner l&#39;échantillon au-dessus du tronc cérébral et d&#39;utiliser une pipette de transfert pour placer la partie caudale dans un petit pot dans le conteneur de aCSF continuellement perfusés avec 95% O 2/5% de CO 2. </li><li> Pour chaque embryon, 20-30 min pour permettre le transfert de colorant, selon la distance du centre de traçage souhaitée. </li><li> Éliminer les tissus et préparer pour la coupe histologique. Dans l&#39;exemple présenté ici, le tissu est immergé dans du paraformaldéhyde à 4% (dans du PBS 1X) pendant une nuit, le saccharose 30% (dans du PBS 1X) pendant une nuit. </li></ol> 4. La contre et analyse <ol><li> La contre est utile pour aider à orienter l&#39;observateur de la localisation anatomique ainsi que d&#39;identifier les régions d&#39;intérêt particulier. Une contre-coloration efficace dans cette préparation est immunomarquage neurofilaments (figures 1, 3b, 3e), où L vivementAbel axones et permet de délimitation des voies axonales dans le SNC. </li><li> L&#39;analyse doit être effectuée dans toute la région étiqueté, comme les saillies peuvent s&#39;étendre sur plusieurs centaines de microns ou plus long de l&#39;axe rostro-caudal. Quelques exemples d&#39;analyses de base sont les suivants: taux d&#39;erreur de ciblage, le calendrier et / ou des changements dans la divergence des modèles de projections. Axones RDA-étiquetés sont visualisées dans le système nerveux périphérique et central à haute résolution (figures 3A, 3D). </li></ol>

<ol><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li>
<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
<li>Molea, D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+nucleus+magnocellularis+innervation+by+the+cochlear+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion.</a> The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).</li>
<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+pattern+formation+in+the+inner+ear%3A+do+compartment+boundaries+play+a+role%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).</li>
<li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellairs%2C+R+%22The+atlas+of+chick+development%22">The atlas of chick development</a>. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).</li>
<li>Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+patterns+and+spontaneous+activity+of+afferent+fibres+to+the+lagenar+macula+and+apical+basilar+papilla+of+the+chick%27s+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea.</a> Hearing Research. 56, 211-226 (1991).</li>
<li>Code, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+neurons+to+the+macular+lagena+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick.</a> Hearing Research. 82, 26-30 (1995).</li>
<li>Maklad, A., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vestibular+afferent+projections+into+the+hindbrain+and+their+central+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets.</a> Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).</li>
<li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+system+development%3A+primary+auditory+neurons+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+inner+ear+cells+using+genomic+tags+for+clonal+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification.</a> Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Appler, J. M., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+ear+to+the+brain%3A+Molecular+mechanisms+of+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly.</a> Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).</li>
<li>Bulankina, A. V., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit+development+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Neural circuit development in the mammalian cochlea.</a> Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).</li>
<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+synaptic+connections+in+the+auditory+system+visualized+with+optical+recording%3A+afferent-evoked+activity+is+present+from+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).</li>
<li>Marrs, G. S., Spirou, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+auditory+circuits%3A+spiral+ganglion+and+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem.</a> The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).</li>
<li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144(2009).</li>
<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
<li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size%2C+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li>
<li>Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profiling+of+spiral+ganglion+neurons+reveals+insights+into+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).</li>
</ol>

Pas de conflit d&#39;intérêts sont déclarés.

Les études sur le développement précoce du nerf VIII ont été limitées, en partie à cause de la difficulté d&#39;identifier les axones embryonnaires provenant de ganglions distincts multiples. Plusieurs études ont exploré les signaux moléculaires directeurs auditif et vestibulaire cellule sensorielle et destins des cellules ganglionnaires au cours du développement précoce, 5,11,12, mais les processus de régulation innervation centrale n&#39;ont pas encore été déterminés. Rapports des acoustiques projections de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Peser vaisselle en polystyrène </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de Pétri, 35 X 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Utilisez-le pour faire la dissection plat en silicone </td></tr><tr><td> Kit Élastomère silicone Sylgard </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td><td> Manteau de Petri plat pour faire la dissection </td></tr><tr><td> Dissection Pins </td><td> Divers </td><td></td><td> Dit embryon en place lors de la dissection </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> Récipient pour aCSF. Proposer translucide à large ouverture Nalgene pot de 500 ml (16 oz) avec couvercle. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Trou de perçage en haut du couvercle pour tige de verre bubling de pénétrer de liquide </td></tr><tr><td> Vider flacon de 5 ml en verre transparent ou comparables flacon </td><td> American Pharmaceutical Partners, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; Utilisation pendant l&#39;incubation aCSF de conserver des échantillons séparés l&#39;un de l&#39;autre et du courant de bouillonnement </td></tr><tr><td> Réservoir de carbogène (95% O 2/5% CO 2) relié par un tube à barbotage </td><td> Divers </td><td></td><td> Fixer par un tube de barbotage tige de verre pour perfusion en aCSF </td></tr><tr><td> Verre à pied barboteur </td><td> Divers </td><td></td><td> Pour infuser dans carbogène aCSF </td></tr><tr><td> Courbé en bout d&#39;une pince </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501008 </td><td> Pour retirer la tête de l&#39;embryon de l&#39;oeuf </td></tr><tr><td> Deux fine pointe de pince </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501985 </td><td> Pour les micro-dissection </td></tr><tr><td> 50 ml Bécher </td><td> divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine dextrane Amine (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> divers </td><td> Fluorescent axone traceur </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline (PBS 1X) </td><td> Divers </td><td></td><td> Réactif de laboratoire standard </td></tr><tr><td> Thin Wall capillaires en verre, 1,2 OD, .9 ID 4 &quot;(100 mm) de longueur </td><td> World Precision Instruments </td><td> TW120F-4 </td><td> Chargez-RDA. Chaque capillaire fait deux micropipettes de verre </td></tr><tr><td> Aiguille / extracteur pipette </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modèle 720 </td><td> Paramètres utilisés: Chaleur 16,4, 2,2 solénoïde </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Instrumentation </td><td> divers </td><td> Fixer par un tube de verre fin pour micropipette </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Narishige </td><td> divers </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection avec la fluorescence </td><td> Divers </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Paraformaldéhyde 4% </td><td> Divers </td><td></td><td> Réactif de laboratoire standard </td></tr><tr><td> anti-neurofilaments anticorps, en option </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Suivre le protocole histologique recommandé par le fabricant </td></tr><tr><td> Cryostat et matériaux associés pour la coupe </td><td> Leica </td><td> divers </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à épifluorescence de formation d&#39;image </td><td> Zeiss, divers </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Le poussin embryonnaire est un modèle largement utilisé pour l&#39;étude des périphériques et centraux projections des cellules ganglionnaires. Dans le système auditif, marquage sélectif des axones du nerf auditif dans VIIIe crânienne améliorerait l&#39;étude du développement central circuit auditif. Cette approche est difficile en raison de multiples organes sensoriels de l&#39;oreille interne contribuer à la VIIIe nerf 1. De plus, des marqueurs qui distinguent de manière fiable contre les groupes auditif vestibulaires des axones dans le nerf VIII aviaire doivent encore être identifiés. Voies auditives et vestibulaires peuvent pas être distinguées fonctionnellement dans les embryons précoces, comme sensorielles-réponses évoquées ne sont pas présents avant que les circuits sont formés. Idéalement saillie axones VIIIe ont été tracées dans certaines études, mais auditives axone étiquetage a été accompagnée par l&#39;étiquetage des autres composants nerveuses VIIIe 2,3. Ici, nous décrivons une méthode de traçage antérograde du ganglion acoustique de façon sélective labeaxones auditives l sein du VIIIe nerf développement. Tout d&#39;abord, après dissection partielle de la région céphalique antérieure d&#39;un embryon de poulet 8-jour immergé dans le liquide céphalorachidien artificiel oxygéné, le canal cochléaire est identifié par des repères anatomiques. Ensuite, une micropipette de verre fine tiré est positionnée pour injecter une petite quantité de rhodamine dextrane aminé dans la région de canal adjacent et profonde, où les cellules ganglionnaires acoustiques sont situés. Dans les trente minutes qui suivent l&#39;injection, les axones auditives sont tracées de manière centrale dans le cerveau postérieur et peuvent ensuite être visualisées après une préparation histologique. Cette méthode fournit un outil utile pour les études sur le développement de la formation auditive périphérique circuit central.

Les composants du nerf VIII et l&#39;anatomie du nerf lui-même sont complexes et alambiquées (figures 1, 3). Par sélectivement le traçage des fibres provenant de cellules ganglionnaires acoustiques, les segments du nerf VIII ainsi que les afférences auditives primaires dans le tronc cérébral peuvent être tracées et proprement distinguent de leurs homologues vestibulaires (Figures 2, 3). De même, cette technique pourrait être utilisée pour étudier les projections périphériques des cellul...

Nous décrivons ici une technique de microdissection suivie par l&#39;injection de colorant fluorescent dans le ganglion acoustique des embryons de poulet au début de traçage sélective des fibres axonales auditives dans le nerf et du cerveau postérieur.

Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

L'objectif de cette procédure est de tracer sélectivement les fibres auditives du système nerveux périphérique vers le système nerveux central dans un embryon. Cela est réalisé en réalisant d'abord une section microdose afin de révéler le chondrocrâne ventral et d'identifier le canal cochléaire aviaire. La deuxième étape consiste à effectuer une microinjection dans les cellules du ganglion acoustique sous-jacent et leurs axones.Ensuite, l'échantillon est incubé dans un LCR artificiel oxygéné pendant 20 minutes afin de permettre le transfert du DIA. Enfin, une préparation histologique et la sectionnement du tissu permettent la visualisation microscopique des projections centrales du ganglion acoustique. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont qu'elle permet un traçage sélectif du nerf huitième.Les fibres auditives à haute résolution permettent un transfert rapide du colorant dans les tissus vivants et autorisent des expériences à un stade précoce du développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la recherche sur l'audition. Par exemple, quelles sont les molécules qui guident les axones v

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Whole-cell patch-clamp enregistrements de dendrites auditives fibres nerveuses au niveau des synapses du ruban des cellules ciliées internes de la cochlée de mammifère.

Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

Cette vidéo montre le processus de préparation de tranches de cerveau en forme de coin en laboratoire. À l'aide d'un vibratome, une tranche en forme de coin du cerveau d'une souris est fabriquée avec une épaisseur variable. Cette tranche contient la racine nerveuse auditive positionnée à l’extrémité la plus épaisse, tandis que les neurones liés à l’audition sont situés à l’extrémité la plus mince.

Préparation de tranches de cerveau en coin pour visualiser les neurones auditifs

Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d'électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents stades de développement.

Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l&#39;embryon de poulet

Nous présentons une méthode qui décrit l’isolement et la culture d’explants cochléaires à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris.  Nous démontrons également une méthode de transfert de gènes dans des explants cochléaires par électroporation à ondes carrées. La culture d’explants in vitro couplée à la technique de transfert de gènes permet aux chercheurs d’étudier les effets de la modification de l’expression des gènes au cours du développement.

Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

L’organe auditif médie l’audition. Nous présentons ici une méthode modifiée de micro-électroporation in ovo optimisée pour l’étude de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices auditives dans l’organe auditif du poulet en développement.

Transfert de gènes dans l&#39;organe de poulet Auditory par<em&gt; Dans Ovo</em&gt; Micro-électroporation

Les neurones auditifs du tronc cérébral des oiseaux et des mammifères sont spécialisés pour l'encodage neuronal rapide, un processus fondamental pour les fonctions auditives normales. Ces neurones proviennent de précurseurs distincts du cerveau postérieur embryonnaire. Nous présentons des techniques utilisant l'électroporation pour exprimer des gènes dans le cerveau postérieur d'embryons de poulet pour étudier la fonction des gènes pendant le développement auditif.

Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem

Nous présentons ici un protocole pour obtenir des tranches du tronc cérébral auditif non coronal de l’embryon de poulet pour l’étude des propriétés tonotopiques et des trajectoires de développement dans une tranche du tronc cérébral. Ces tranches comprennent des sections sagittales, horizontales et horizontales / transversales englobant des régions tonotopiques plus grandes dans un plan de tranche individuel que les sections coronales traditionnelles.

Trancher le tronc auditif embryonnaire du poulet pour évaluer les gradients tonotopiques et les microcircuits

Nous avons utilisé des techniques standard de réponse auditive du tronc cérébral (ABR) et les avons appliquées à des poulets nouveau-nés, un modèle aviaire précoce pour la fonction auditive. Le protocole décrit en détail les techniques de préparation animale et d’acquisition ABR, avec des étapes qui pourraient se traduire par d’autres modèles aviaires ou rongeurs.

Évaluation de la réponse auditive du tronc cérébral chez les nouveau-nés de poulet

Le poussin est un organisme modèle rentable, accessible et largement disponible pour une variété d’études. Ici, une série de protocoles est détaillée pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et à la régénération de l’oreille interne aviaire.

Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

Les méthodes présentées ici fournissent des instructions détaillées pour la dissection, la dissociation, la culture et l’enregistrement patch-clamp à partir de neurones ganglionnaires vestibulaires et ganglionnaires spiralés de l’oreille interne.

Isolement et culture de somates ganglionnaires vestibulaires et spiralés de rongeurs nouveau-nés pour les enregistrements Patch-Clamp

Découvrez une technique de microdissection et d'injection de colorant fluorescent pour tracer sélectivement les fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire d'embryons de poulet. Cette méthode permet une visualisation haute résolution des projections ganglionnaires acoustiques.

Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

Explorer plus de vidéos