Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

Le but de cette procédure est de tracer sélectivement les fibres auditives du système nerveux périphérique au système nerveux central dans un embryon. Pour ce faire, il faut d’abord effectuer une section microdose pour révéler le crâne chondro ventral et identifier le canal cochléaire aviaire. La deuxième étape consiste à effectuer une micro-injection dans les cellules ganglionnaires acoustiques sous-jacentes et leurs axones.

Ensuite, l’échantillon est incubé et oxygéné dans un LCR artificiel pendant 20 minutes pour permettre le transfert de DIA. Enfin, une préparation histologique et une coupe du tissu permettent une visualisation microscopique des projections centrales du ganglion acoustique. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont qu’elle permet un traçage sélectif du huitième nerf.

Les fibres auditives à haute résolution permettent un transfert rapide de colorant dans les tissus vivants et permettent l’expérimentation à un stade précoce du développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l’audition. Par exemple, quelles sont les molécules qui guident les axones vers leurs cibles centrales ?

Ou comment le circuit réagit-il aux blessures ou à l’exposition ototoxique ? Tout d’abord, ajoutez du liquide céphalo-rachidien artificiel dans un bocal Nalgene à large ouverture de 500 millilitres jusqu’à ce que le bocal soit rempli aux deux tiers. Replacez le couvercle, qui a un trou percé sur le pot.

Placez un barboteur à tige attaché à un réservoir de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone à travers le trou du couvercle et dans le LCR A. Allumez le gaz et ajustez la pression pour obtenir un flux constant de bulles qui atteignent environ un tiers du liquide, mais ne sont pas assez fortes pour provoquer des éclaboussures sur le bord. Immergez jusqu’à six flacons en verre de cinq millilitres dans le bocal pour séparer les échantillons individuels les uns des autres.

Et de la turbulence du flux de gaz. Laissez le LCR A s’oxygéner pendant au moins 20 minutes pendant que les micropipettes en verre tirent les oxygénants du LCR A remplissent la micropipette avec une solution immunitaire Dexter et Am à 6,25 % de rodine dans du PBS contenant 0,4 % de Triton XX. Fixez la micropipette au micromanipulateur et cassez la pointe avec une pince fine pour former une ouverture de 20 à 50 microns. Utilisez un tube fin pour fixer le micromanipulateur stabilisé au pico spritzer.

Réglez le pico spritzer entre 10 et 30 PSI pour commencer à terminer le reste de la configuration. Assurez-vous qu’il y a une petite parabole de dissection en silicone avec deux broches de dissection placées dans un petit chemin hexagonal. Webo deux pinces à pointe fine.

Une pince à pointe courbée, un bécher de 50 millilitres et un récipient pour les déchets tissulaires dans la zone de dissection. Après avoir retiré l’embryon de poussin de l’œuf, placez la tête sur la boîte de dissection recouverte de silicone. Dans le bateau à lactosérum, positionnez la tête avec une vue ventrale de manière à ce que l’oreille du côté d’intérêt dans ce cas, le côté droit soit visible.

Une fois dans la bonne position, stabilisez le tissu avec des broches de dissection, en évitant la région cérébrale postérieure. Utilisez le bécher de 50 millilitres pour transférer 30 millilitres de LCR A oxygéné dans la boîte, en immergeant complètement le tissu. Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, saisissez doucement et décollez la mâchoire inférieure.

Retirez ensuite la paupière inférieure du côté d’intérêt. Ensuite, retirez les tissus vasculaires et mous sus-jacents, y compris le palais et l’œsophage restants. Une fois ces tissus retirés, la surface lisse du crâne ventral et les artères vertébrales distinctives devraient être révélées.

Disséquez soigneusement la peau autour des mitos externes, le cartilage de l’articulation de la mâchoire et de l’oreille moyenne tout en laissant l’oreille interne intacte. À l’aide de la pince, vous coupez doucement les structures cartilagineuses de la mâchoire et de l’oreille moyenne. Utilisez maintenant un léger mouvement de balayage avec les pointes fines des pinces pour retirer les artères vertébrales et l’accumulation de sang.

Ceci est important car le sang peut obscurcir la vue et la coagulation peut obstruer l’ouverture de la pipette d’injection. À ce stade, la masse tial blanche caractéristique devrait être visible. La flèche de cette figure indique le canal cochléaire avec l’épithélium sensoriel et le ganglion acoustique adjacents.

Il est situé directement sous le crâne du chondra et, comme on le voit ici, peut être visualisé comme une projection allongée en forme de doigt s’étendant de l’oreille interne ventralement avec l’apex près de la ligne médiane antérieure pour marquer les fibres auditives. Placez d’abord la pipette d’injection près de la surface de l’embryon du canal cochléaire et de la région papuleuse baula, abaissez lentement la micropipette pour percer d’abord le crâne. Cette région du crâne est plus mince que les zones environnantes et nécessite moins de force pour pénétrer.

La micro-pipette doit maintenant se trouver à l’intérieur du canal cochléaire. Si nécessaire. Une petite injection de colorant de traçage peut être effectuée ici pour aider à visualiser la base par pilier sans repositionner la micro-pipette et continuer à descendre jusqu’à ce qu’elle franchisse le bord profond du canal cochléaire.

Cette image montre la position idéale de la pipette dans la région appropriée du ganglion acoustique. Effectuez une injection à ce stade, puis répétez l’opération dans plusieurs régions sur toute la longueur de la papille basale. En fonction de l’étendue de l’étiquetage souhaité et en excluant l’extrémité la plus proximale où se trouve la legina vestibulaire.

Avec le pico spritzer réglé entre 10 et 30 PSI, chaque injection devrait entraîner un point fluorescent marqué DIA d’environ 200 à 400 microns de diamètre, comme on le voit ici. Une fois l’injection terminée, utilisez une pince pour transecter l’échantillon au-dessus du tronc cérébral comme illustré ici, et utilisez une pipette de transfert pour placer la portion cordale dans l’un des petits bocaux à l’intérieur du récipient de perfusé. Un CSF.

Pour chaque embryon, prévoyez 20 à 30 minutes pour le transfert de la matrice en fonction de la distance de traçage central souhaitée. Une fois le temps d’incubation écoulé, retirez le tissu et préparez-vous pour la coupe histologique. Ici, le tissu est immergé dans du paraldéhyde à 4 % dans un XPBS pendant la nuit, qui sera ensuite suivi d’une déshydratation pendant la nuit dans du saccharose à 30 % dans un XPBS.

Une fois que le tissu est équilibré pendant la nuit dans 30 % de saccharose, il est cryo-sectionné coronal. Après la section, l’immunomarquage avec des anticorps appropriés peut orienter l’observateur vers l’emplacement anatomique et identifier des régions d’intérêt particulières. Cette image montre la vue coronale du tronc cérébral E six avec les ganglions acoustiques bilatéraux intacts.

La pipette rouge schématisée en S illustre le ciblage précis des cellules ganglionnaires acoustiques à partir d’un point d’entrée latéral dorsal. Les sections sont immunomarquées avec des anti-neurofilaments pour mettre en évidence les projections axonales. Les organes vestibulaires sont rostrals à la section montrée.

Le nerf cochléaire vestibulaire est étiqueté, tout comme le ganglion acoustique et le ganglion vestibulaire. La face dorsale est vers le haut, la barre d’échelle est égale à 300 microns. Ce qui suit, une image représentative de faible et haute puissance du traçage sélectif de la fibre auditive dans un embryon E huit à partir de 25 microns.

Les coupes coronales prélevées sur le même embryon sont de plans différents, comme on le voit ici. Les axones marqués par AJR peuvent être tracés à partir du site d’injection indiqué par la pointe de la flèche à travers le nerf crânien indiqué par la flèche et trimestriellement vers les cibles des noyaux auditifs primaires indiquées par la double pointe de flèche, la barre d’échelle est égale à 300 microns. L’immunomarquage avec des anticorps anti-neurofilaments met en évidence toutes les projections axonales et les fibres tracées par RDA de l’image précédente sont dans la voie de projection auditive.

AP et VP indiquent les composants auditifs et vestibulaires respectifs périphériques au point d’entrée du nerf. L’image couleur fusionnée montre comment les axones marqués RDA s’intègrent dans l’anatomie locale. L’image à haute puissance du même embryon à une position plus cordale démontre la haute résolution des fibres au point d’entrée du nerf indiqué par une flèche et le long de la voie centrale indiquée par une double pointe de flèche.

La coloration des neurofilaments de tous les axones permet la démarcation de P-N-S-C-N-S ainsi que les projections auditives présumées par rapport aux projections vestibulaires. Encore une fois, AP et VP indiquent les composants auditifs et vestibulaires respectifs périphériques au point d’entrée du nerf, tandis que AC et VC indiquent les projections auditives et vestibulaires respectives centrales au point d’entrée du nerf. Encore une fois, la superposition de canaux séparés est représentée par une fusion de couleurs.

L’examen histologique du ganglion acoustique révèle l’emplacement des cellules ganglionnaires acoustiques marquées à partir du tracé précédent et leurs projections périphériques indiquées par l’astérisque, A tracé rétroactivement à la papille basilaire. Ici, AG indique le ganglion acoustique bp, la papille basale et lm la laina maculaire. La barre d’échelle est égale à 100 microns.

Enfin, cette illustration montre une trajectoire de traçage de 700 microns attendue avec un marquage du huitième nerf auditif spécifique à E huit. Le site d’injection indiqué par le cercle rouge est cordal au point d’entrée du nerf et les projections centrales se déplacent rostralement et trimestriellement. Une fois dans le cerveau postérieur ici, la barre d’échelle est égale à 300 microns.

Tout en essayant cette procédure, adaptez vos injections pour qu’elles correspondent au mieux à vos critères d’analyse. Et n’oubliez pas qu’il y aura une certaine variabilité dans le nombre exact et l’emplacement des axones à l’état de traces entre les échantillons.