Name: Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Découvrez une technique de microdissection et d'injection de colorant fluorescent pour tracer sélectivement les fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire d'embryons de poulet. Cette méthode permet une visualisation haute résolution des projections ganglionnaires acoustiques.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Candace Hsieh des suggestions et de l&#39;aide des techniques d&#39;imagerie et Dr Doris Wu d&#39;expertise sur l&#39;anatomie poussin oreille interne au cours de l&#39;embryogenèse précoce. Ce travail a été soutenu par la NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, et le DOE GAANN P200A120165.

1. Préparer les outils de dissection et réactifs suivants <ul><li> Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF, 130 mM NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM de glucose, 2 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO 4) perfusion continue avec 95% 2/5% de CO 2 à la température ambiante. Pour la perfusion, remplir au 2/3 de 500 ml à large ouverture Nalgene pot avec un trou percé dans le couvercle. Réservoir sera fixé par une tubulure à une tige de verre barboteur, qui pénètre dans la aCSF à travers le trou dans le couvercle du bocal. Régler la pression afin d&#39;obtenir un flux constant de bulles qui atteignent environ 1/3 du liquide, mais ne sont pas suffisamment puissants pour provoquer des éclaboussures au-dessus de la jante. Submerger 5 ml flacons de verre (jusqu&#39;à 6) dans le pot Nalgene pour séparer les échantillons individuels les uns des autres et de la turbulence de l&#39;écoulement de gaz. ACSF doit être oxygéné pendant au moins 20 min avant l&#39;une incubation de tissus. </li><li> Petit plat dissection de silicone (35 x 10 mmPetri mm revêtu en utilisant Sylgard Elastomere Kit) avec deux broches de dissection placés en polystyrène hexagonale petite (47 mm en bas) pèsent bateau. </li><li> Deux pinces à pointe fine, une pointe recourbée-pinces, un bécher de 50 ml, et un récipient pour les déchets de tissu. </li><li> Tiré de verre micropipette (1,2 OD / 0,9 ID) rompu à environ 20-50 um d&#39;ouverture à l&#39;extrémité et rempli avec de la rhodamine dextrane aminé (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) dans une solution de 6,25% avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS . Fixer par un tube fin pour picospritzer et stabiliser à micromanipulateur. </li></ul> 2. Micro-dissection pour révéler Papille basilaire à 4,5 E8 <ol><li> Avec des pinces courbes, couper E8 embryon juste en dessous du tronc cérébral, en plaçant directement sur la tête de dissection plat enduit de silicone à l&#39;intérieur de peser bateau. </li><li> Utilisant des broches de dissection, positionner la tête avec une vue ventrale afin de l&#39;oreille sur le côté de l&#39;intérêt est légèrement visible, la tête légèrement inclinée sur le dos et pointant 10-30 degrés loin de CEnter (figure 2A). Immédiatement fixer la tête avec des épingles. Si bilatérale traçage est désiré, un centre de la tête à 0 degrés, ou une vue plein ventrale afin que les deux côtés peuvent être consultées. De même, pour une injection du côté gauche, fixer la tête de -10 à -30 degrés à partir du centre de sorte que le côté gauche est accessible. </li><li> En utilisant le bécher de 50 ml, 30 ml de transférer aCSF oxygéné dans le plat, entièrement immerger le tissu. </li><li> Saisissez doucement vers le bas et le zeste de la mâchoire inférieure en utilisant une pince fine pointe, puis retirez la paupière inférieure sur le côté de l&#39;intérêt. </li><li> Retirez le tissu vasculaire sus-jacente, y compris tous les palais restant et l&#39;œsophage. Ces tissus mous devrait décoller révélant la surface lisse de développer chondrocrâne avec les artères vertébrales distinctifs à sa surface. À ce stade, la caractéristique masse blanche otoconial doit être visible. </li><li> Disséquer soigneusement la peau autour du conduit auditif externe, le cartilage de l&#39;articulation de la mâchoire et l&#39;oreille moyenne, tout en laissant l&#39;enner l&#39;oreille intacte. Utilisez la pince pour couper délicatement ces structures cartilagineuses. </li><li> Retirer artères vertébrales et l&#39;accumulation de sang à l&#39;aide d&#39;un léger mouvement de balayage avec les extrémités de la pince fine. Le sang peut obscurcir vue et la coagulation peut boucher l&#39;ouverture pipette d&#39;injection. </li><li> Le canal cochléaire avec épithélium sensoriel adjacente (papille basilaire) et le ganglion acoustique se trouve directement sous le chondrocrâne 6 et peut être visualisée comme une forme allongée en forme de doigt saillie s&#39;étendant à partir de l&#39;oreille interne ventralement, avec la pointe la plus distale (apex) près de la partie antérieure médiane 5. Il peut y avoir une petite accumulation de sang (rouge) de la dissection et / ou des calcifications otolithiques (blanc) à l&#39;apex de la cochlée conduit (figure 2B) qui peuvent aider à visualiser. Au sommet se trouve la macula lagenar, un patch sensorielle pensé pour être de la fonction vestibulaire 7,8. </li></ol> 3. Étiquetage sélective des fibres NC VIII auditif <ol><li&gt; Placez la pipette d&#39;injection près de la surface embryon à la région papille basilaire et conduit cochléaire. </li><li> Abaissez lentement la micropipette à première ponction du crâne. Cette région crânienne est plus mince que les zones environnantes et nécessite moins de force pour pénétrer. La micropipette devrait maintenant être à l&#39;intérieur du canal cochléaire. En option: une petite injection de colorant de traçage peut être faite ici pour aider à la visualisation de la papille basilaire. </li><li> Sans avoir à repositionner la micropipette, continuer à baisser jusqu&#39;à ce qu&#39;il seulement à l&#39;atteinte de la frontière profondeur du canal cochléaire (Figure 1). Effectuer une injection ici et répéter dans de multiples régions le long de la longueur de la papille basilaire (figures 2C, 2D), à l&#39;exclusion de la pointe la plus proximale où le lagena vestibulaire est situé. Avec le picospritzer mis entre 10-30 psi, plusieurs injections sont faites. Le volume de fluide injecté de colorant varie, et dépend du degré de marquage souhaitée. Chaque injection doit se traduire par un colorant fluorescent-laBeled place d&#39;environ 200 à 400 um de diamètre (figure 2D). </li><li> Une fois l&#39;injection terminée, utilisez une pince pour sectionner l&#39;échantillon au-dessus du tronc cérébral et d&#39;utiliser une pipette de transfert pour placer la partie caudale dans un petit pot dans le conteneur de aCSF continuellement perfusés avec 95% O 2/5% de CO 2. </li><li> Pour chaque embryon, 20-30 min pour permettre le transfert de colorant, selon la distance du centre de traçage souhaitée. </li><li> Éliminer les tissus et préparer pour la coupe histologique. Dans l&#39;exemple présenté ici, le tissu est immergé dans du paraformaldéhyde à 4% (dans du PBS 1X) pendant une nuit, le saccharose 30% (dans du PBS 1X) pendant une nuit. </li></ol> 4. La contre et analyse <ol><li> La contre est utile pour aider à orienter l&#39;observateur de la localisation anatomique ainsi que d&#39;identifier les régions d&#39;intérêt particulier. Une contre-coloration efficace dans cette préparation est immunomarquage neurofilaments (figures 1, 3b, 3e), où L vivementAbel axones et permet de délimitation des voies axonales dans le SNC. </li><li> L&#39;analyse doit être effectuée dans toute la région étiqueté, comme les saillies peuvent s&#39;étendre sur plusieurs centaines de microns ou plus long de l&#39;axe rostro-caudal. Quelques exemples d&#39;analyses de base sont les suivants: taux d&#39;erreur de ciblage, le calendrier et / ou des changements dans la divergence des modèles de projections. Axones RDA-étiquetés sont visualisées dans le système nerveux périphérique et central à haute résolution (figures 3A, 3D). </li></ol>

<ol><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li>
<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
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<li>Marrs, G. S., Spirou, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+auditory+circuits%3A+spiral+ganglion+and+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem.</a> The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).</li>
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<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
<li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size%2C+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li>
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</ol>

Pas de conflit d&#39;intérêts sont déclarés.

Les études sur le développement précoce du nerf VIII ont été limitées, en partie à cause de la difficulté d&#39;identifier les axones embryonnaires provenant de ganglions distincts multiples. Plusieurs études ont exploré les signaux moléculaires directeurs auditif et vestibulaire cellule sensorielle et destins des cellules ganglionnaires au cours du développement précoce, 5,11,12, mais les processus de régulation innervation centrale n&#39;ont pas encore été déterminés. Rapports des acoustiques projections de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Peser vaisselle en polystyrène </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de Pétri, 35 X 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Utilisez-le pour faire la dissection plat en silicone </td></tr><tr><td> Kit Élastomère silicone Sylgard </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td><td> Manteau de Petri plat pour faire la dissection </td></tr><tr><td> Dissection Pins </td><td> Divers </td><td></td><td> Dit embryon en place lors de la dissection </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Divers </td><td></td><td> une partie de la recette aCSF </td></tr><tr><td> Récipient pour aCSF. Proposer translucide à large ouverture Nalgene pot de 500 ml (16 oz) avec couvercle. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Trou de perçage en haut du couvercle pour tige de verre bubling de pénétrer de liquide </td></tr><tr><td> Vider flacon de 5 ml en verre transparent ou comparables flacon </td><td> American Pharmaceutical Partners, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; Utilisation pendant l&#39;incubation aCSF de conserver des échantillons séparés l&#39;un de l&#39;autre et du courant de bouillonnement </td></tr><tr><td> Réservoir de carbogène (95% O 2/5% CO 2) relié par un tube à barbotage </td><td> Divers </td><td></td><td> Fixer par un tube de barbotage tige de verre pour perfusion en aCSF </td></tr><tr><td> Verre à pied barboteur </td><td> Divers </td><td></td><td> Pour infuser dans carbogène aCSF </td></tr><tr><td> Courbé en bout d&#39;une pince </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501008 </td><td> Pour retirer la tête de l&#39;embryon de l&#39;oeuf </td></tr><tr><td> Deux fine pointe de pince </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501985 </td><td> Pour les micro-dissection </td></tr><tr><td> 50 ml Bécher </td><td> divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine dextrane Amine (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> divers </td><td> Fluorescent axone traceur </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline (PBS 1X) </td><td> Divers </td><td></td><td> Réactif de laboratoire standard </td></tr><tr><td> Thin Wall capillaires en verre, 1,2 OD, .9 ID 4 &quot;(100 mm) de longueur </td><td> World Precision Instruments </td><td> TW120F-4 </td><td> Chargez-RDA. Chaque capillaire fait deux micropipettes de verre </td></tr><tr><td> Aiguille / extracteur pipette </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modèle 720 </td><td> Paramètres utilisés: Chaleur 16,4, 2,2 solénoïde </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Instrumentation </td><td> divers </td><td> Fixer par un tube de verre fin pour micropipette </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Narishige </td><td> divers </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection avec la fluorescence </td><td> Divers </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Paraformaldéhyde 4% </td><td> Divers </td><td></td><td> Réactif de laboratoire standard </td></tr><tr><td> anti-neurofilaments anticorps, en option </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Suivre le protocole histologique recommandé par le fabricant </td></tr><tr><td> Cryostat et matériaux associés pour la coupe </td><td> Leica </td><td> divers </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à épifluorescence de formation d&#39;image </td><td> Zeiss, divers </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Le poussin embryonnaire est un modèle largement utilisé pour l&#39;étude des périphériques et centraux projections des cellules ganglionnaires. Dans le système auditif, marquage sélectif des axones du nerf auditif dans VIIIe crânienne améliorerait l&#39;étude du développement central circuit auditif. Cette approche est difficile en raison de multiples organes sensoriels de l&#39;oreille interne contribuer à la VIIIe nerf 1. De plus, des marqueurs qui distinguent de manière fiable contre les groupes auditif vestibulaires des axones dans le nerf VIII aviaire doivent encore être identifiés. Voies auditives et vestibulaires peuvent pas être distinguées fonctionnellement dans les embryons précoces, comme sensorielles-réponses évoquées ne sont pas présents avant que les circuits sont formés. Idéalement saillie axones VIIIe ont été tracées dans certaines études, mais auditives axone étiquetage a été accompagnée par l&#39;étiquetage des autres composants nerveuses VIIIe 2,3. Ici, nous décrivons une méthode de traçage antérograde du ganglion acoustique de façon sélective labeaxones auditives l sein du VIIIe nerf développement. Tout d&#39;abord, après dissection partielle de la région céphalique antérieure d&#39;un embryon de poulet 8-jour immergé dans le liquide céphalorachidien artificiel oxygéné, le canal cochléaire est identifié par des repères anatomiques. Ensuite, une micropipette de verre fine tiré est positionnée pour injecter une petite quantité de rhodamine dextrane aminé dans la région de canal adjacent et profonde, où les cellules ganglionnaires acoustiques sont situés. Dans les trente minutes qui suivent l&#39;injection, les axones auditives sont tracées de manière centrale dans le cerveau postérieur et peuvent ensuite être visualisées après une préparation histologique. Cette méthode fournit un outil utile pour les études sur le développement de la formation auditive périphérique circuit central.

Les composants du nerf VIII et l&#39;anatomie du nerf lui-même sont complexes et alambiquées (figures 1, 3). Par sélectivement le traçage des fibres provenant de cellules ganglionnaires acoustiques, les segments du nerf VIII ainsi que les afférences auditives primaires dans le tronc cérébral peuvent être tracées et proprement distinguent de leurs homologues vestibulaires (Figures 2, 3). De même, cette technique pourrait être utilisée pour étudier les projections périphériques des cellul...

Nous décrivons ici une technique de microdissection suivie par l&#39;injection de colorant fluorescent dans le ganglion acoustique des embryons de poulet au début de traçage sélective des fibres axonales auditives dans le nerf et du cerveau postérieur.

Sélective traçage des fibres auditives dans le nerf vestibulo-cochléaire aviaire embryonnaire

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

L'objectif de cette procédure est de tracer sélectivement les fibres auditives du système nerveux périphérique vers le système nerveux central dans un embryon. Cela est réalisé en réalisant d'abord une section microdose afin de révéler le chondrocrâne ventral et d'identifier le canal cochléaire aviaire. La deuxième étape consiste à effectuer une microinjection dans les cellules du ganglion acoustique sous-jacent et leurs axones.Ensuite, l'échantillon est incubé dans un LCR artificiel oxygéné pendant 20 minutes afin de permettre le transfert du DIA. Enfin, une préparation histologique et la sectionnement du tissu permettent la visualisation microscopique des projections centrales du ganglion acoustique. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes sont qu'elle permet un traçage sélectif du nerf huitième.Les fibres auditives à haute résolution permettent un transfert rapide du colorant dans les tissus vivants et autorisent des expériences à un stade précoce du développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la recherche sur l'audition. Par exemple, quelles sont les molécules qui guident les axones vers leurs cibles centrales ?Ou comment le circuit réagit-il à une lésion ou à une exposition ototoxique ? Commencez par ajouter du liquide céphalorachidien artificiel dans un bocal Nalgene de 500 millilitres à large ouverture, jusqu'à ce que le bocal soit rempli aux deux tiers. Remplacez le couvercle, qui comporte un trou percé, sur le bocal.Placez un diffuseur de tige relié à une bouteille d’oxygène à 95 % et de dioxyde de carbone à 5 % dans le trou du couvercle et plongez-le dans le LCR artériel. Ouvrez le gaz et réglez la pression afin d’obtenir un flux constant de bulles atteignant environ un tiers du liquide, sans être assez fort pour provoquer des éclaboussures par-dessus le bord. Immergez jusqu’à six petits flacons en verre de cinq millilitres dans le récipient afin de séparer les échantillons individuels les uns des autres.Et de la turbulence du flux de gaz. Laisser le LCSA s'oxygéner pendant au moins 20 minutes ; pendant que le LCSA s'oxygène, tirez des micropipettes en verre, remplissez-les par l'arrière avec une solution de 6,25 % de rodine Dexter et une solution immunitaire dans du PBS contenant 0,4 % de Triton XX. Fixez la micropipette au micromanipulateur et cassez l'extrémité à l'aide de pinces fines afin de former une ouverture de 20 à 50 microns. Utilisez un tube fin pour relier le micromanipulateur stabilisé au pico-spritzer.Régler le pulvérisateur pico entre 10 et 30 PSI pour commencer à terminer le reste du montage. S'assurer qu'il y a un petit plat de dissection en silicone avec deux épingles à dissection insérées dans un support hexagonal. Prévoir deux paires de pinces à pointe fine.Une pince courbe, un bécher de 50 millilitres et un récipient pour les déchets de tissus dans la zone de dissection. Après avoir retiré l'embryon de poulet de l'œuf, placer la tête sur la boîte de dissection revêtue de silicone. Dans le bateau en plastique, positionner la tête en vue ventrale afin que l'oreille du côté d'intérêt, dans ce cas-ci le côté droit, soit visible.Une fois en position correcte, stabilisez le tissu à l’aide d’épingles de dissection, en évitant la région du cerveau postérieur. Utilisez le bécher de 50 millilitres pour transférer 30 millilitres du LCR A oxygéné dans la boîte, recouvrant entièrement le tissu. Ensuite, utilisez une pince fine pour saisir délicatement et décoller la mâchoire inférieure.Ensuite, retirez la paupière inférieure du côté d'intérêt. Puis, retirez les tissus vasculaires et mous superficiels, y compris tout palais et oesophage résiduel. Une fois ces tissus retirés, la surface lisse du crâne ventral et les artères vertébrales distinctives doivent être exposées.Dissez soigneusement la peau autour du mésotympanum jusqu'au cartilage de l'articulation de la mâchoire et de l'oreille moyenne, tout en laissant l'oreille interne intacte. Utilisez la pince pour couper délicatement les structures cartilagineuses de la mâchoire et de l'oreille moyenne. Employez maintenant un mouvement de balayage doux avec les extrémités de la pince fine pour enlever les artères vertébrales et le sang accumulé.Ceci est important car le sang peut obstruer la vue et la coagulation peut boucher l'ouverture de la pipette d'injection. À ce stade, la masse blanche caractéristique du tial devrait être visible. La flèche sur cette figure indique le canal cochléaire avec l'épithélium sensoriel adjacent et le ganglion acoustique.Il est situé directement sous le crâne chondral et, comme on le voit ici, peut être visualisé comme une projection allongée en forme de doigt s'étendant depuis l'oreille interne vers le ventral, dont l'apex se situe près de la ligne médiane antérieure, afin de marquer les fibres auditives. Placez d'abord la pipette d'injection près de la surface embryonnaire du canal cochléaire et dans la région de la papille basilaire, puis abaissez lentement la micro-pipette afin de percer d'abord le crâne. Cette région du crâne est plus mince que les zones environnantes et nécessite moins de force pour être pénétrée.La micropipette doit maintenant se trouver à l'intérieur du canal cochléaire. Si nécessaire, une petite injection de colorant traceur peut être effectuée ici afin de faciliter la visualisation du pilier basal. Sans repositionner la micropipette, continuer à descendre jusqu'à ce qu'elle franchisse légèrement la limite profonde du canal cochléaire.Cette image montre la position idéale de la pipette dans la région appropriée du ganglion acoustique. Effectuez une injection à ce point, puis répétez l'opération dans plusieurs régions le long de la longueur de la papille basale. Selon l'étendue du marquage souhaitée, en excluant toutefois l'extrémité la plus proximale où se trouve le ligament vestibulaire.Avec le pulvérisateur pico réglé entre 10 et 30 PSI, chaque injection doit produire un spot fluorescent marqué au DIA d’environ 200 à 400 microns de diamètre, comme illustré ici. Une fois l'injection terminée, utilisez une pince pour sectionner l'échantillon au-dessus du bulbe rachidien comme indiqué ici, puis utilisez une pipette de transfert pour placer la portion médullaire dans l'un des petits pots situés dans le récipient contenant le liquide de perfusion, un LCR.Prévoir 20 à 30 minutes par embryon pour le transfert sur lame, selon la distance de traçage central souhaitée. Une fois le temps d'incubation écoulé, retirer le tissu et le préparer pour la coupe histologique. Ici, le tissu est immergé dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS 1X toute une nuit, suivi par une déshydratation toute une nuit dans du saccharose à 30 % dans du PBS 1X.Après avoir laissé le tissu en équilibre pendant une nuit dans du saccharose à 30 %, il est coupé en sections coronales par cryocoupes. Après la section, un marquage immunohistochimique à l'aide d'anticorps appropriés permet d'orienter l'observateur par rapport à la localisation anatomique et d'identifier des régions d'intérêt spécifiques. Cette image montre la vue coronaire du tronc cérébral d'un embryon E six, avec les ganglions acoustiques bilatéraux intacts.La pipette rouge schématisée en S illustre un ciblage précis des cellules du ganglion acoustique à partir d'un point d'entrée latéral dorsal. Les sections sont immunomarquées avec un anticorps anti-neurofilament afin de mettre en évidence les projections axonales. Les organes vestibulaires sont situés en position rostrale par rapport à la section montrée.Le nerf vestibulocochléaire est étiqueté, de même que le ganglion acoustique et le ganglion vestibulaire. Le côté dorsal est orienté vers le haut ; l'échelle représente 300 microns. Ci-dessous, des images représentatives à faible et forte puissance d'un traçage sélectif des fibres auditives chez un embryon E8, coupé à 25 microns.Les sections coronales prélevées sur le même embryon correspondent à des plans différents, comme illustré ici. Les axones marqués avec RDA peuvent être suivis depuis le site d'injection, indiqué par la tête de flèche, à travers le nerf crânien désigné par la flèche, puis jusqu'aux cibles des noyaux auditifs primaires, indiquées par la double tête de flèche ; la barre d'échelle représente 300 microns. Une immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-neurofilament met en évidence toutes les projections axonales, et les fibres marquées au RDA de l'image précédente se situent dans la voie de projection auditive.AP et VP indiquent respectivement les composantes auditive et vestibulaire périphériques par rapport au point d'entrée du nerf. L'image en couleurs fusionnée montre comment les axones marqués par le RDA s'intègrent à l'anatomie locale. Une image en fort grossissement du même embryon, prise à une position plus caudale, démontre la haute résolution des fibres au point d'entrée du nerf, indiqué par une flèche, et le long du trajet central, indiqué par une double pointe de flèche.La coloration des neurofilaments de tous les axones permet de délimiter les trajets P-N-S-C-N-S ainsi que les projections auditives et vestibulaires présumées. Ici encore, AP et VP indiquent respectivement les composantes auditive et vestibulaire situées en périphérie du point d'entrée du nerf, tandis que AC et VC indiquent les projections auditives et vestibulaires respectives situées au centre par rapport au point d'entrée du nerf. Là encore, la superposition des canaux séparés est présentée sous forme de fusion colorée.L'examen histologique du ganglion acoustique révèle l'emplacement des cellules du ganglion acoustique marquées suite au traçage précédent ainsi que leurs projections périphériques indiquées par l'astérisque, un traçage rétrogradement important vers la papille basilaire. Ici, AG indique le ganglion acoustique, bp la papille basilaire et lm la macula lagna. L'échelle représente 100 microns.Enfin, cette illustration montre un trajet de traçage de 700 microns attendu avec une étiquetage spécifique du huitième nerf auditif à E8. Le site d'injection indiqué par le cercle rouge est situé en position caudale par rapport au point d'entrée du nerf, et les projections centrales se dirigent vers l'avant (rostro) et en oblique (quartaire). Une fois dans le cerveau postérieur ici, l'échelle indique 300 microns.Lors de l'exécution de cette procédure, adaptez vos injections de manière à répondre au mieux à vos critères d'analyse. Et n'oubliez pas qu'il peut exister une certaine variabilité quant au nombre exact et à la localisation des axones tracés entre les échantillons.

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