Un paradigme d'enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de Drosophila

Le but de cette procédure est d’appliquer une blessure par arme blanche à la moelle nerveuse ventrale du SNC larvaire de la drosophile et d’induire une réponse cellulaire à cette blessure. Pour ce faire, les larves sont d’abord stadifiées jusqu’à 96 heures après la ponte. Ensuite, le SNC larvaire est disséqué et le cordon nerveux ventral est poignardé à l’aide d’une fine aiguille de poupe.

Les dernières étapes consistent à cultiver puis à fixer les cordons nerveux ventraux poignardés pour l’immunocoloration ou simplement à les cultiver pour des enregistrements en accéléré. En fin de compte, la microscopie confocale des échantillons peut montrer la dynamique de la progression de la plaie et les changements dans la prolifération des cellules gliales, l’apoptose et la morphologie. Le principal avantage de cette technique par rapport à 16 méthodes comme la blessure à la mouche adulte, est que, bien qu’il s’agisse toujours d’un paradigme pour un système nerveux central fonctionnel, le SNC larvaire est techniquement plus accessible.

Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car le code du nerf bénin peut dégénérer si l’étape de dissection n’a pas été commencée en s’assurant des conditions sanitaires. Nettoyez le banc et vos mains avec de l’éthanol à 70 %. Les instruments doivent être enveloppés dans un tissu imbibé à 70 % d’éthanol et mis de côté.

Lorsque vous êtes prêt à manipuler les larves, déballez le tissu et laissez les instruments sécher à l’air. Pour ces protocoles, il est essentiel que les pointes des forceps s’emboîtent parfaitement. S’ils ne les ajustent pas, l’utilisation de pierres de l’Arkansas est équivalente.

Chargez un bloc de coloration avec de l’eau distillée et trois blocs avec deux millilitres de milieu M trois PS. Sélectionnez une fiole avec de la lave vieille de 96 heures et ajoutez-y de l’eau. Ensuite, à l’aide d’une spatule, prélevez délicatement la nourriture contenant des larves dans le flacon et étalez-la sur une serviette en papier humide.

Transférez 10 larves de la propagation vers le bloc de coloration avec de l’eau. Remplacez l’eau six fois pour nettoyer complètement la lave. Remplacez ensuite l’eau par un média M trois PS.

Transférez l’une des larves dans un bloc de coloration de M trois milieux PS et placez-la sous un microscope à dissection. Retirez le VNC avec un minimum de dommages tissulaires. Positionnez d’abord la lave côté dorsal vers le haut.

Ensuite, au tiers de la distance de l’extrémité antérieure, saisissez le côté dorsal avec deux paires de pinces. Retirez ensuite l’extrémité postérieure avec la pince qui déchire l’épiderme. Ensuite, coupez l’intestin là où il est le plus proche du cerveau, car il ne doit pas y contenir beaucoup de nourriture.

Le cerveau et le VNC peuvent maintenant être vus depuis le bord postérieur de la moitié antérieure. Retirez soigneusement le corps adipeux, l’intestin et l’épiderme avec soin. Servez les nerfs périphériques par le VNC thoracique avec deux paires de pinces placées l’une à côté de l’autre et en les séparant.

Ne tirez pas ou n’arrachez pas de disques ou de nerfs périphériques du VNC thoracique, sinon cela dégénérera la bouche. Des parties peuvent également être laissées attachées au VNC, les disques imaginaux doivent être laissés attachés au cerveau. Maintenant plus humide élargi P 20.

TIP dans le milieu M trois PS et utilisez-le pour transférer le VNC dans un bloc de coloration contenant du milieu frais M trois PS avant d’endommager le vnc. Assurez-vous d’être suffisamment rassemblé. Quatre à cinq sont nécessaires pour le time lapse, mais plus de 24 sont nécessaires pour l’immuno-marquage.

Transférez un VNC dans un bloc de coloration propre contenant M trois PS sous un microscope de dissection, mettez la pilule neuro dorsale en vue. C’est l’orientation la plus naturelle pour VNC avec des lobes optiques attachés. Maintenant, une seule fois, utilisez une aiguille sten pour poignarder manuellement le VNC du côté dorsal à un angle pratiquement droit Visez la moitié abdominale du VNC.

Le coup de couteau frappera doucement la surface du verre sous le tissu. Il est donc important de vérifier régulièrement si la pointe de l’aiguille est encore suffisamment tranchante pour la prochaine tentative. S’il est émoussé, aiguisez la pointe.

À l’aide d’une pierre de l’Arkansas ou d’un évent de poignardage équivalent, un protège-nerf avec une aiguille de coloration de tango est l’étape la plus importante de cette procédure, car il s’agit d’un paradigme de blessure. Si l’aiguille est trop émoussée, la plaie sera beaucoup trop grande et l’évent d’un protège-nerfs peut dégénérer. Lors d’un coup de couteau, empêchez la tige du porte-aiguille de toucher le milieu une fois terminé, la plaie ne sera pas visible même après une immuno-coloration par fluorescence.

Aucun signe de dégénérescence ne peut être observé dans les VNC sains fixés après 22 heures de culture. Cette procédure peut entraîner une dégénérescence cellulaire dans le VNC sans rapport avec le coup de couteau 22 heures après le coup de couteau. Recherchez des surfaces rugueuses, en particulier dans la zone ventrale latérale du thorax, comme l’indiquent les pointes de flèches.

Dans les cas extrêmes, le VNC est saillant. Recherchez également des trous ou des vacuoles dans la pilule neurologique thoracique, qui peuvent être visibles sous forme de trous après une immunocoloration fluorescente. Remarquez les trous au niveau de la pointe de la flèche.

Les échantillons présentant l’un de ces signes de dégénérescence dans la pilule neurologique doivent être jetés. Pour visualiser la pilule neurophonique axonale dans le VNC vivant, utilisez un piège à protéines GFP appelé G nine, qui marque tous les axones. Pour visualiser toutes les cellules gliales à l’exception de la ligne médiane gl, utilisez le pilote glial repo G quatre avec par exemple, les mouches rapporteures U-A-S-D-S red S 1 97 Y les mouches transportant les deux rapporteurs auront des axones verts et des GL rouges qui peuvent être enregistrés dans des tissus vivants en accéléré.

Après avoir poignardé le VNC d’animaux portant les rapporteurs requis, transférez le VNC poignardé dans un plat à fond en verre de 3,5 millimètres recouvert de polyol lysine avec un millilitre de M trois PS Positionnez ensuite le VNC côté dorsal vers le bas, appuyez doucement le VNC sur le plat à l’aide du côté plat de la pince pour qu’il y colle. Ajoutez maintenant avec précaution un millilitre de M trois PS à 15 % FPS dans une chambre d’imagerie contrôlée à 25 degrés Celsius. Acquérez des images du VNC à l’aide de la microscopie confocale sur le LIR SP deux, quelque peu limité.

Utilisez un objectif 20x avec un zoom quatre fois. Réglez le mode de balayage sur XYZT. Réglez la résolution des pixels sur 512 carrés.

Réglez les pas Z sur un micron et collectez des images à un ou deux heures d’intervalle. Ces paramètres permettront de scanner huit à neuf points temporels sur d’autres microscopes confocaux. Ajustez les paramètres pour acquérir des piles d’images plus longtemps.

Points jusqu’à 24 heures. Une lésion VNC a été visualisée en accéléré comme une zone GFP négative dans la pilule neurologique d’échantillons portant le marqueur axonal G neuf peu de temps après avoir poignardé, de petites zones GFP négatives qui ressemblaient à des trous ou des vacuoles ont commencé à apparaître. Ces zones négatives à la GFP s’élargissent généralement jusqu’à six à huit heures après le coup de couteau.

Par la suite, les zones négatives de la GFP ont diminué davantage et certaines ont même disparu 22 heures après l’attaque au couteau. La zone occupée par la plaie était généralement plus petite que la zone maximale observée six à huit heures après l’attaque au couteau. De même, la zone négative rouge SD dans les processus gliaux a initialement augmenté.

Cependant, ils ont rétréci 22 heures après avoir été poignardés. Il est intéressant de noter que les processus gliaux positifs au rouge du SD remplissaient souvent les trous négatifs de la GFP dans la pilule neurologique avant leur disparition. L’immunocoloration d’échantillons fixes portant le repo GAL quatre et U-A-S-M-C-D-H-G-F-P pour marquer les membranes des cellules gliales avec un anti GFP a révélé que les lésions du côté dorsal ont entraîné une bosse.

Le coup de poignard ventral semblait affecter plus sévèrement les cellules gliales associées à la pilule neurologique et aux cellules gliales associées à la pilule neurologique qu’aux cellules gliales à la surface et dans le cortex. Les processus gliaux semblaient désorganisés dans la pilule neurologique, tandis que dans le cortex, ils étaient toujours en gaine de VNC et maintenaient leur organisation en maille. Les dommages ont entraîné la présence de deux débris cellulaires positifs pour GS, comme l’indiquent les pointes de flèches.

Les débris sont distincts des cellules normales. Il est beaucoup plus petit et n’est pas connecté à un corps cellulaire. Cela a révélé des dommages aux cellules gliales associées aux pilules neurologiques, à la caspase clivée.

Trois apoptoses positives. Une coloration a été observée dans les neurones et les cellules gliales, montrant qu’elles subissaient une apoptose lors d’une blessure au couteau. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux heures.

Il faut une heure pour disséquer le code du nerf de l’évent, le poignarder et le configurer pour la microscopie confocale en accéléré et en deux heures, le code du nerf de l’évent 24 peut être disséqué, poignardé et mis en place pour la culture, après quoi l’échantillon peut être fixé au point de temps souhaité.