Name: Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour lanalyse dexpression génique après un traumatisme crânien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Apprenez la microdissection par capture laser pour isoler des populations enrichies de neurones hippocampiques ou des neurones uniques à partir de coupes congelées de cerveau de rat blessé. Cette technique permet l'analyse d'expression génique par PCR quantitative et microarrays.

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Ce travail est financé par R01 NS052532 (à HLH), la Fondation Moody, et le Département d&#39;anesthésiologie. Nous tenons à remercier Laurie Bolding, Christine Courteau Butler et Christy Perry pour leur aide à la rédaction, et Christy Perry pour la présentation et excellente production de toutes les figures, tableaux et objets d&#39;art.

1. Interventions chirurgicales et percussion fluide TBI <ol><li> Tous les expérimentations animales soient préalablement approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de l &#39;Université du Texas Medical Branch, Galveston, au Texas, et le National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (8e édition, Conseil national de recherches). </li><li> Des rats (mâles adultes Sprague-Dawley, 400-500 g obtenu auprès du fournisseur Charles Rivers, Portland, Maine) sont logés à deux par cage et fourni de la nourriture et de l&#39;eau ad libitum dans un vivarium avec ces conditions constantes: cycle de la lumière (600 h à 1800 h), la température (21 ° C à 23 ° C) et d&#39;humidité (40% à 50%) une semaine avant l&#39;utilisation. </li><li> Anesthésier les rats avec 4% d&#39;isoflurane, intuber et ventiler mécaniquement (NEMI scientifique; New England Medical Instruments, Medway, MA), les rats avec 1,5-2,0% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène: l&#39;air (70:30) et les préparer pour parasagittale percussion de fluide blessures, comme décrit précédemment. 8, 10 </li><li> Sacrifier les rats au point en temps opportun après la blessure selon le protocole expérimental. Enlever rapidement le cerveau, geler immédiatement sur de la glace sèche, et conserver à -80 ° C dans un tube de 50 ml ou passer immédiatement à intégrer dans l&#39;OCT pour la coupe congelée. </li></ol> 2. Coupe et coloration de cerveau de rat <ol><li> Le tissu cérébral qui n&#39;est pas utilisé immédiatement peuvent être conservés à -80 ° C pendant jusqu&#39;à un mois si elles sont conservées à une température constante. Cerveaux qui sont congelés à -80 ° C, puis décongelé à -20 ° C pour la coupe, puis recongelés ne donnent pas ARN de qualité après la décongélation seconde. Une fois que le cerveau est décongelé, monté dans un PTOM, et en coupe, les lames doivent être colorés dans les 24 heures et utilisé pour LCM dans les 30 minutes à une heure de coloration. Cela permettra d&#39;assurer l&#39;ARN de bonne qualité. Après LCM, les cellules capturées sur LCM bouchons peuvent être stockés dans un tampon de lyse à -80 ° C pendant une semaine, mais l&#39;ARN doit être isolé dans un temps opportun pour assurer la plus haute qualité. &lt;/ Li&gt; <li> Avant la coupe du cerveau, essuyez-le cryostat avec la RNase-Zap et nettoyer les pinceaux avec de l&#39;EtOH (remplacer la lame jetable entre chaque cerveau). </li><li> Récupérer le cerveau dans le tube de 50 ml à partir du congélateur à -80 ° C; placez-le dans le cryostat à une température de -22 ° C et de dégel dans le tube pendant environ 10 min. Enlever le cerveau du tube et le placer sur la scène sur de la gaze, face ventrale vers le haut. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, coupez le cerveau pour enlever la partie postérieure du cerveau, juste rostrale du cervelet et de la partie antérieure du chiasma optique. Remplissez un cryomold par OCT milieu de montage (Tissue Tek), et placez le cerveau dans le moule avec la face antérieure vers le bas. Laissez le tissu cérébral de geler dans le support de montage jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne blanc (environ 10 min). </li><li> Geler la platine (Tissue Tek) sur le cerveau avec octobre Enlever le cerveau du moule. Insérez le cerveau dans la tête de l&#39;objet et serrez les vis. </li><li> Insérez un Disposable, lame à profil bas (Fisher Scientific) dans le porte-couteau et serrer le levier vers le bas. </li><li> Commencez à trancher le cerveau à 20 um pour enlever la couche externe de octobre Une fois que la région de l&#39;hippocampe est atteinte, réglez la molette de microns à 10. Recueillir des coupes coronales de série en plaçant une lame de verre ou de plus-lame de verre sur la coupe de tissu (Fisher Scientific). Les lames sont conservées à -20 ° C dans un support de coloration sans RNase jusqu&#39;à ce découpage est terminé. </li><li> Pour supprimer tous les RNases de la verrerie où des coupes de tissus sont traités, essuyez tous les contenants de coloration et des cylindres gradués avec ELIMINase (Fisher Scientific) et rincer à l&#39;eau Milli Q. Préparer toutes les solutions avec l&#39;eau sans RNase et filtrer le crésyl violet (Sigma-Aldrich) et de fluoro-Jade (Histo-chem) la tache avec un filtre de 0,2 um avant utilisation. </li><li> Décongeler des coupes de cerveau à température ambiante pendant 30 sec et le fixer à 75% (1 min) ETOH. </li><li> Pour PPCM de simples neurones lésés après la fixation, rincer les lames à l&#39;eau sans RNase (1 min), Contre-coloration au crésyl violet à 1% (15-20 sec), rincer à l&#39;eau sans RNase (2 x 30 sec), la tache avec Fluoro-Jade (4 min), rincer à l&#39;eau sans RNase (3 x 1 min), déshydrater avec de l&#39;EtOH 95% fabriqués à partir de l&#39;eau sans RNase (30 sec), 100% (30 sec) ETOH, et le xylène (2 x 3 min). </li><li> Pour PPCM de bandes de neurones après la fixation, rincer les lames à l&#39;eau sans RNase (1 min), de la teinture au crésyl violet à 1% (1 min), rincer à l&#39;eau sans RNase pour (3 x 1 min), déshydrater à 95% ETOH (2 x 30 sec), 100% ETOH (2 x 30 sec), et le xylène (2 x 3 min). </li><li> Sécher à l&#39;air toutes les sections sous une hotte pendant 15 min avant de LCM. Les lames peuvent être stockées côtés de section, jusqu&#39;à, dans une boîte à lames bordées de déshydratant, s&#39;ils doivent être transférés d&#39;une pièce à l&#39;. Cependant, les meilleurs résultats sont obtenus si LCM est effectué immédiatement après les sections sont secs. LCM doit être limitée de 30 min à 1 h. Dans la section suivante, nous décrivons d&#39;abord comment capturer des bandes continues de cellules, ce qui est easiest à maîtriser pour ceux qui apprennent cette technique. Ensuite, nous décrivons comment capturer précisément neurones isolés. Dans notre procédure, nous identifions les neurones meurent par leur affinité pour Fluoro-Jade-un marqueur des neurones en dégénérescence. Cellules Fluoro-Jade-négatifs sont présumés être neurones survivants. </li></ol> 3. Microdissection par capture laser (LCM) LCM des andains de populations enrichies de neurones de l&#39;hippocampe <ol><li> LCM est réalisée à l&#39;aide d&#39;un microscope PixCell IIe avec un laser diode infrarouge (Life Technologies). </li><li> Ajuster la manette de commande central pour la position verticale. Tourner et verrouiller l&#39;objectif 4X en position. </li><li> Placer une lame au centre de la platine du microscope et régler manuellement jusqu&#39;à ce que la région de l&#39;hippocampe est en vue. Utilisez des ajustements grossiers et fins de discussion pour amener l&#39;image au point. </li><li> Activez le mandrin à vide en appuyant sur le bouton vide sur le contrôleur. Tourner et verrouiller l&#39;objectif 10X plus en place. Concentrer à nouveau avec des ajustements grossiers et fins. </li><li> Chargez le CapSure Macro LCM bouchons (Life Technologies) dans le module cassette CapSure et la position d&#39;un bouchon à la position de la ligne de charge. Tournez le bras de placement Cap et la position autour du bouchon. Levez le bras de placement Cap d&#39;enlever le bouchon CapSure du module cassette. </li><li> Tournez le bras de placement Cap sur la lame et abaissez le bras vers le bas sur la lame, ce qui permettra de placer le bouchon sur la diapositive. Réglez la mise au point fine et déplacez le joystick pour vérifier si les cellules sont à l&#39;intérieur du cercle noir sur la coiffe. Toutes les captures cellulaires devraient être à l&#39;intérieur de ce cercle noir. </li><li> Définissez les paramètres du laser. Tout d&#39;abord, appuyez sur le bouton laser activer sur le contrôleur. Le spot laser cible sera visible comme un point rose dans le champ de vision sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. </li><li> Réglez la taille du spot laser pour petite (7,5 um) pour focaliser le laser et ajuster la puissance et la durée de 65 à 75 mW, pour 1.0 à 2.0 ms comme nécessaire à la capture cellulaire optimale. </li><li> Pour teer le laser, utilisez le joystick pour déplacer le point laser dans une zone où il n&#39;ya pas de cellules à ramasser. Tirer le laser à l&#39;aide du commutateur pouce. Utilisez le joystick pour déplacer le spot laser loin de l&#39;endroit polymère fondu et vérifier pour voir si un anneau visible sombre entoure un espace libre où le laser a été congédié. </li><li> Pour capturer les cellules, utilisez le joystick pour déplacer le spot laser sur la surface de cellules à capturer. Tirer le laser à l&#39;aide du commutateur pouce. Déplacer le levier de commande pendant le déclenchement du laser pour capturer une grande surface de cellules. Lorsque le laser est déclenché il fait fondre la pellicule de polymère thermoplastique sur le couvercle à la surface des cellules cibles. Le polymère absorbe le rayonnement laser, donc pas de modifier l&#39;ARN, de l&#39;ADN ou de la protéine assurant l&#39;intégrité de l&#39;échantillon pour les futures applications moléculaires. </li><li> Après avoir tiré toutes les cellules d&#39;intérêt, soulever le bras de placement Cap. Les cellules capturées va se séparer de la section de tissu et de respecter le plafond CapSure. Le tissu restant et les cellules manquantes seront visble dans le champ de vision. Les cellules de la coiffe peut être consultée en plaçant le capuchon sur une partie vide de la diapositive. </li><li> Soulevez le bras de placement Cap et le faire pivoter vers le Cap station de déchargement. Abaissez le bouchon dans la station et tourner le bras de placement Cap remettre dans sa position précédente. </li><li> Faites glisser l&#39;outil d&#39;insertion CapSure le long de la plate-forme et sur le capuchon. Soulevez l&#39;outil de la plate-forme. Le plafond restera attaché. Appuyez légèrement sur le bouchon pour le pad CapSure propre pour ôter les tissus indésirables. </li><li> Placez le bouchon dans un 0,5 ml sans RNase tube rempli de 100 ul de tampon de lyse obtenue à partir de la RNAqueous Micro-Isolation Kit. Immédiatement le bouchon vortex pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 30 min et congeler à -80 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;isolement d&#39;ARN. </li></ol> PPCM de simples FJ + neurones dans l&#39;hippocampe <ol start="15"><li> Pour capturer des cellules individuelles, chargez CapSure HS LCM bouchons dans le module cassette CapSure et positisur une casquette à la position de la ligne de charge. Tournez le bras de placement Cap et le positionner autour du bouchon. Levez le bras de placement Cap d&#39;enlever le bouchon CapSure du module cassette. </li><li> Régler la taille du spot laser à petit (7,5 um) pour focaliser le laser et ajuster la puissance laser et de la durée de 65 mW -75 à 0,45 à 0,50 ms pour la capture cellulaire optimale de cellules uniques. </li><li> Faire tourner le bras de placement Cap sur le coulisseau et abaisser le bras vers le bas en direction de la lame. Cela permet de placer le bouchon sur la diapositive. Le capuchon CAPSURE HS surface est assise surélevée par rapport à l&#39;échantillon au cours de LCM. </li><li> Utilisez le joystick pour déplacer le laser sur simple FJ + cellules. Toutes les cellules sont capturés doivent être à l&#39;intérieur de la petite ceinture noir sur la coiffe. Tirer le laser à l&#39;aide du commutateur pouce. </li><li> Lorsque toutes les cellules de la zone de cercle noir ont été tirés avec le laser, soulever le bras de placement Cap. Les cellules capturées se séparer de la section de tissu et d&#39;adhérer à la coiffe CapSure HS. </li><li> Placez un autre diaporama sur les microsface scène et recueillir FJ + cellules jusqu&#39;à ce que le bouchon HS est pleine. Placez le bouchon dans un 0,5 ml sans RNase tube rempli avec 40-50 ul de tampon de lyse. Immédiatement le bouchon vortex pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 30 min et congeler à -80 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;isolement d&#39;ARN. </li></ol> 4. Isolation d&#39;ARN total à partir d&#39;échantillons LCM (Cette section sera simplement décrit dans la vidéo de présentation) <ol><li> L&#39;ARN total de cellules est isolé en utilisant le kit de RNAqueous-Micro (Ambion) suivant les protocoles du fabricant. Tous les réactifs et solutions de lavage sont fournis dans ce kit. Mouillage préalable du micro filtre cartouche en ajoutant 30 pl de tampon de lyse à la solution de filtration. Après 5 min, centrifuger le filtre pendant 30 sec à 10.000 x g. </li><li> Ajouter 3 pi d&#39;additif LCM au lysat d&#39;échantillon, une pipette pour mélanger et centrifuger. </li><li> Ajouter 52 ul de 100% (1/2 volume) ETOH au lysat d&#39;échantillon; pipette pour mélanger et transférer le lysat sur le filtrecolonne. </li><li> Centrifuger la colonne de filtration à 10.000 x g pendant 1 min à lier l&#39;ARN de la colonne. Si il ya des bouchons multiples pour un seul échantillon, tourner chaque lysat à travers la même colonne séparément. </li><li> Effectuez la procédure d&#39;isolement d&#39;ARN comme décrit dans le kit RNAqueous Micro. </li><li> Effectuer un traitement DNase et l&#39;inactivation de DNase des échantillons d&#39;ARN LCM telles que décrites dans le kit, transférer les ARN dans un tube RNase-free et conserver à -80 ° C. </li></ol> 5. La quantification de l&#39;ARN et des applications en aval Évaluation de la qualité de l&#39;ARN et la quantification est réalisée avec un bioanalyseur Agilent en utilisant des réactifs du kit Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) selon le protocole du fabricant. <ol><li> L&#39;ARN total est analysé sur un bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies). Le logiciel évalue la concentration et l&#39;intégrité de l&#39;échantillon d&#39;ARN en affectant un numéro d&#39;intégrité de l&#39;ARN (RIN) de chaque échantillon allant fROM 1 à 10. 1-5 indique ARN dégradé et 7-10 indique l&#39;ARN de bonne qualité. </li><li> Non dégradés ARN intact sera utilisé pour PCR en temps réel; essais Taqman individuels ou RT2 tableaux profileur en utilisant Sybr-chimie verte. L&#39;ARN peuvent aussi être utilisés pour l&#39;analyse de puce à ADN et d&#39;ARNm analyse par microréseau microRNA. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêt.

Cette technique LCM nous a permis de réaliser des progrès importants dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la TCC. 8,10,11,12,13 Nous étions les premiers chercheurs d&#39;utiliser cette technique pour démontrer que les sous-régions distinctes de l&#39;hippocampe du rat ont des profils d&#39;expression des gènes qui en corrélation avec leur vulnérabilité sélective des blessures. Nos études ont montré que l&#39;on pouvait quantifier l&#39;expression des gènes, par qPCR, d&#39;aussi peu que 10 cellules laser capturés et que nous pourrions effectuer une analyse de puces à ADN du génome entier d&#39;aussi peu que 600 cellules capturées. LCM serait un outil précieux dans des études similaires de d&#39;autres régions cérébrales qui sont connus pour être impliqués dans divers troubles neurologiques et neuropsychiatriques. Par exemple, des études utilisant LCM ont mis en lumière dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson dans les neurones dopaminergiques de la substance noire, 14 et aidé études de profilage du génome entier du noyau accumbens, qui est impliqué dans les circuits de récompense impliqués dans stroubles d&#39;abus ubstance. 15 Hétérogénéité des neurones se traduit au niveau du génome 16 et peut contribuer au manque de succès des traitements expérimentaux pour TBI dans les essais cliniques. Ainsi, notre but est d&#39;utiliser cette technique pour étudier les éléments critiques qui influencent la survie des neurones après un traumatisme cérébral. Notre récente étude profilage du génome entier de la mort et à proximité survivant neurones de l&#39;hippocampe après TBI suggéré qu&#39;un rhéostat cellulaire qui reflète le rapport entre les niveaux d&#39;expression de la survie des cellules aux gènes de mort cellulaire régule le destin des cellules après un traumatisme cérébral. Ces études en cours contribuera à la conception et au développement de stratégies pharmacothérapeutiques qui peuvent influencer positivement le rhéostat la survie cellulaire. En outre, nous utilisons actuellement LCM pour suivre et surveiller les effets potentiels des traitements médicamenteux thérapeutiques dans des neurones d&#39;hippocampe après un traumatisme cérébral. Ainsi, nos études démontrent que les données soigneusement les techniques de manipulation sans RNase et certainsmodifications des protocoles existants, il est possible d&#39;obtenir de haute qualité des échantillons d&#39;ARN à partir de LCM pour l&#39;analyse précise de l&#39;expression génique quantitative. Cependant, il existe quelques pièges liés aux techniques de LCM. Par exemple, collecter seulement les cellules neuronales sans aucune contamination microglie peut être presque impossible. Dans la couche des cellules pyramidales de l&#39;hippocampe, il a été estimé que 95% des cellules sont des neurones avec 90% de cette population d&#39;être des cellules pyramidales et des interneurones 10%, laissant un petit pourcentage de types de cellules gliales et les autres. 8,17, 18 Dans nos études, nous utilisons Fluoro-Jade un colorant fluorescent qui marque spécifiquement seuls neurones lésés dans le tissu cérébral. Une tache différente qui est un marqueur pour la GFAP serait nécessaire pour colorer les cellules microgliales 19. Collecte uniquement les fluoro-jade teinté simples corps neuronaux assure une population plus homogène de neurones. Un autre problème commun qui peut exiger de dépannage est que le cercle n&#39;est past définie lorsque le laser est déclenché. Si cela se produit, il est nécessaire de vérifier les paramètres du laser et ajuster la puissance et la durée si nécessaire. En outre, il est important de s&#39;assurer que le bouchon est posé à plat sur le tissu et bien placé sur le bras. Se référant au manuel LCM technique ou appeler l&#39;assistance technique sera parfois nécessaire. Après LCM et l&#39;isolement d&#39;ARN, la qualité de l&#39;ARN doit toujours être évaluée à l&#39;aide d&#39;un bioanalyseur avant toute analyse de l&#39;expression génique. Il existe plusieurs types d&#39;instruments de capture laser actuellement disponibles sur le marché, y compris la découpe laser (Life Technologies, Leica Microsystems) et laser catapultant (Zeiss) les instruments. Notre système LCM fonctionne bien pour la capture de petits nombres de cellules. D&#39;autres systèmes à haut débit et plus automatisée peut être plus appropriée pour l&#39;obtention d&#39;un plus grand nombre de cellules pour l&#39;analyse génomique et protéomique en particulier. En effet, LCM utilisation de ces systèmes automatisés a un grand potentiel pour l&#39;analyse des protein expression dans des cellules ou des populations identifiées enrichies de cellules. 20 En outre, LCM peuvent faciliter l&#39;analyse d&#39;expression génique de cellules immunomarquées, 21 ce qui nous permet d&#39;étudier l&#39;expression des gènes dans des types cellulaires définies indépendamment de la complexité dans les tissus les plus hétérogènes. Ainsi, LCM est un excellent outil pour les études de pointe moléculaires des populations isolées ou enrichie de cellules.

Analyse de l&#39;expression génique des tissus hétérogènes a toujours été problématique,. Ceci est particulièrement vrai dans le cerveau des mammifères, qui a environ 5.000 différents types de cellules 4 Avant le développement de la microdissection par capture laser (LCM) technique, les études génomiques sur les effets des TBI in vivo ont été basées sur l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes dans une population mixte de cellules cérébrales comprenait non seulement des différents types de cellules neuronales, mais aussi de soutenir les cellules gliales et immunomodulatrices. Les complexes résultant profils d&#39;expression génique obtenus à partir de ces tissus hétérogènes et souvent contradictoires les motifs de blessures provoquées par des signaux cellulaires, peut-être une explication de l&#39;échec des essais cliniques humains de stratégies thérapeutiques avérées efficaces dans des études précliniques de TBI 5. Pour obtenir une compréhension claire de l&#39;expression génique induite par des blessures chez les populations vulnérables des neurones de la hanche chez le ratcampe, nous avons adopté la technique de la LCM, la première fois par Emmert-Buck et al. 3 Par la suite, nous avons modifié et optimisé cette technique de microdissection par capture efficace des populations enrichies de neurones et les neurones simples pour le profilage de l&#39;ARNm en utilisant quantitative PCR en temps réel et l&#39;analyse des microréseaux . Pour maintenir l&#39;intégrité de l&#39;ARNm dans des coupes congelées de tissus cérébraux pour l&#39;analyse génomique, nous avons modifié les protocoles existants pour la fixation, la coloration et la capture rapide des neurones à partir de surgelés sections de cerveau de rat. Pour l&#39;identification et l&#39;isolement des blessés et des mourants neurones de l&#39;hippocampe, nous avons également optimisé la technique de coloration Fluoro-Jade pour LCM. Fluoro-Jade ne distingue pas entre la mort cellulaire par apoptose et nécrose. Ainsi, tous les types de neurones qui dégénèrent peuvent être détectés par cette tache. 6,7 Ici, nous décrivons le protocole utilisé dans notre laboratoire pour obtenir des pools de neurones qui meurent ou survivent simples ainsi que des andains de enrichie populations de types distincts de cellules neuronales (c.-à-CA1-CA3 neurones pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes après TBI). La procédure en cas de blessure du cerveau percussion fluide réalisée dans notre laboratoire est décrite en détail dans Shimamura et al., 8 et est très similaire au protocole blessures par percussion de fluide latérale pour souris publiées dans JoVE par Alder et al. 9 Depuis la technique LCM a été démontré qu&#39;ils ont un effet minime ou nul sur l&#39;intégrité de l&#39;ADN, de l&#39;ARN et des protéines dans les tissus, il s&#39;agit d&#39;un excellent outil pour l&#39;analyse moléculaire et de protéines de types de cellules définies.

<table><tbody><tr><td>PixCell IIe Laser Capture Microscope Life Technologies</td><td>(Arcturus)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Kit NAqueous</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Jade</td><td>Histo-chem Inc.</td><td></td><td></td>#1FJ</tr><tr><td>Cresyl Violet Acétate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xylène (grade histologique)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (grade histologique)</td><td>UTMB pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase free barrier pipette tips</td><td>Fisher</td><td>Scientific 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf » target="_blank">Système de microdissection par capture laser Arcturus (Life Technologies)</a> <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection » target="_blank">Zeiss Laser Microdissection La famille PALM </a> <a href="http:// www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20DM6000%20B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf » target="_blank">Leica Microsystems</a></td></tr></tbody></table>

microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l&#39;analyse d&#39;expression génique après un traumatisme crânien

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

À long terme des troubles cognitifs après TBI est associé à des lésions neurodégénérescence induite dans l&#39;hippocampe, une région du lobe temporal qui est essentiel pour l&#39;apprentissage, la mémoire et les fonctions exécutives. 1,2 D&#39;où nos études se concentrent sur ​​l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes des neurones spécifiques populations dans les sous-régions distinctes de l&#39;hippocampe. La technique de microdissection par capture laser (LCM), introduit en 1996 par Emmert-Buck et al., 3 a permis des avancées significatives dans l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes des cellules individuelles et enrichi des populations de cellules provenant de tissus hétérogènes tels que le cerveau des mammifères qui contient des milliers de types de cellules fonctionnelles. 4 Nous utilisons LCM et un modèle de rat bien établie d&#39;une lésion cérébrale traumatique (TBI) pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie de TBI. Suite à percussion de fluide TBI, les cerveaux sont prélevés à des heures prédéterminées après la lésion, immédiatement congelés sur glace sèche,et préparé pour la coupe dans un cryostat. Les cerveaux de rats peut être intégré dans un PTOM et sectionné immédiatement ou stocké pendant plusieurs mois à -80 ° C avant la coupe pour la microdissection par capture laser. En outre, nous utilisons LCM pour étudier les effets de la TCC sur les rythmes circadiens. Pour cela, nous capturons neurones du noyau suprachiasmatique qui contiennent l&#39;horloge maître du cerveau des mammifères. Ici, nous démontrons l&#39;utilisation de LCM pour obtenir simples neurones identifiés (blessés et dégénérer, Fluoro-Jade-positive, ou indemne, Fluoro-Jade-négatif) et des populations enrichies de neurones de l&#39;hippocampe pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes ultérieure par PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier. Ces études LCM-compatibles ont révélé que la vulnérabilité sélective des régions anatomiquement distincts de l&#39;hippocampe du rat sont reflétées dans les différents profils d&#39;expression des gènes de différentes populations de neurones obtenus par LCM à partir de ces régions distinctes. Les résultats de nos études unicellulaires, le casl&#39;on compare les profils transcriptionnels de mourir et à proximité survivant neurones de l&#39;hippocampe, suggèrent l&#39;existence d&#39;un rhéostat la survie des cellules qui régule la mort cellulaire et la survie après un traumatisme cérébral.

Dans notre étude LCM première fois, nous avons pu montrer que les sous-régions fonctionnellement distinctes (CA1 et CA3) de l&#39;hippocampe du rat ont des profils d&#39;expression des gènes qui reflètent leur vulnérabilité aux TBI. 8 Figure 1A-1C montre la capture laser de neurones pyramidaux hippocampiques (CA1- CA3), les neurones gyrus denté et les neurones du RCS avant et après LCM. Nettoyer les captures d&#39;pyramidale, granulés ou neurones du RCS, respectivement, sont présentés sur les chapeaux de macro. Figure 2A-2B illustre mourant, Fluoro-Jade positifs neurones pyramidaux et survivre, Fluoro-Jade négatifs neurones pyramidaux avant et après LCM. La capture de la propre mort ou neurones survivants est montré en visualisant les cellules capturées sur les chapeaux de LCM. Après LCM, l&#39;ARN total peut être utilisé pour un large éventail d&#39;études moléculaires, y compris quantitative en temps réel l&#39;analyse de l&#39;expression génique par PCR TaqMan ou SYBR en utilisant des chimies vertes (figure 3A), petite focused tableaux PCR avec des sondes SYBR green (figure 3B) ou l&#39;ensemble du génome (biopuces études Figure 3C). <img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figure 1. Microdissection par capture laser des andains de populations cellulaires définies à partir du cerveau de rat. Surgelées 10 sections um coronales de cerveau de rat sont fixés dans l&#39;éthanol, colorées avec un colorant de Nissl (crésyl violet) et préparé pour LCM. Montré des photos de l&#39;hippocampe du rat et de noyau suprachiasmatique avant et après les neurones A. LCM et les cellules capturées comme visualisées sur les chapeaux de macro. Pyramidales de CA1 les sous-champs-CA3 de l&#39;hippocampe du rat. Cellules granulaires du gyrus B. hippocampe denté. C. bilatérale suprachiasmatique noyaux situés de chaque côté du troisième ventriculeet située au-dessus du chiasma optique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figure 2. Microdissection par capture laser de neurones isolés de l&#39;hippocampe du rat. Montré sont en dégénérescence A., Fluoro-Jade-positifs (teinté) CA3 hippocampiques neurones et B. Surviving, Fluoro-Jade-négatif (non coloré) CA3 neurones avant et après LCM. Cellules capturées sont visualisés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Analyse de l&#39;expression du gène de l&#39;ARN total isolé à partir de neurones laser capturés. A. quantitatives en temps réel les données de PCR de l&#39;expression du gène horloge circadienne dans les SCN. Heatmap B. de l&#39;expression génique dans la mort et la survie des neurones d&#39;hippocampe montrant l&#39;expression de gènes liés à l&#39;apoptose en utilisant des tableaux axés PCR . C. Agilent microarray génome entier de l&#39;expression génique dans l&#39;hippocampe CA1-CA3 neurones de rats qui ont reçu des blessures imposture, ou TCC TCC, plus un virus siARN adéno-associé recombinant destiné à l&#39;expression de gènes knockdown induite par une lésion cérébrale (oxyde nitrique neuronal synthase et la glutathion peroxydase-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

Nous décrivons comment utiliser la microdissection par capture laser (LCM) pour obtenir des populations enrichies de neurones de l&#39;hippocampe ou des neurones simples de coupes congelées de cerveau de rat blessé pour l&#39;analyse d&#39;expression génique ultérieure à l&#39;aide quantitative PCR en temps réel et / ou puces à ADN du génome entier.

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l&#39;analyse d&#39;expression génique après un traumatisme crânien

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

L’objectif global de cette procédure est de démontrer comment obtenir des populations enrichies de neurones de l’hippocampe et de neurones uniques à partir de coupes de tissus congelés par microdissection par capture laser pour une analyse ultérieure de l’expression génique. Ceci est accompli par une première anesthésie, un rat dans une chambre d’anesthésie. Le rat est ensuite intubé, ventilé mécaniquement et placé dans un support de tête stéréotaxique pour préparer le rat.La deuxième étape consiste à administrer la lésion cérébrale à percussion fluide. Ensuite, des sections coronales du cerveau sont coupées sur un cryostat et colorées soit avec l’aide fluro, un marqueur de neurones en dégénérescence, soit avec du violet réel, une coloration de missile. La dernière étape consiste à effectuer une micro-dissection par capture laser et à collecter des neurones uniques ou des pools de neurones.En fin de compte, l’ARN total est isolé des cellules capturées, analysé pour en déterminer la qualité et quantifié à l’aide d’un bioanalyseur Agilent et utilisé dans des applications en aval telles que la PCR quantitative en temps réel et l’analyse axée sur les voies ou à l’échelle du génome. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la micro-dissection manuelle, est que nous pouvons obtenir des populations enrichies de neurones ou d’autres types de cellules cérébrales telles que les cellules gliales ou immunomodulatrices, ou des neurones uniques à partir de coupes de tissus. Cela nous permet d’effectuer une analyse de l’expression génique dans des types de cellules distincts identifiés dans le cerveau et dans d’autres tissus hétérogènes composés de plusieurs types de cellules, la démonstration de cette procédure sera manquée.Debbie Boone, associée de recherche principale dans notre laboratoire. Récupérez d’abord le tissu cérébral obtenu à partir de rats présentant une percussion fluide, une lésion cérébrale traumatique ou une lésion simulée dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius, puis transférez-le à moins 22 degrés Celsius. Cryostat pendant 10 minutes pour amener le cerveau à la température de sectionnement pendant que le cerveau dégèle.Essuyez le cryostat avec de l’ARN zap contenant de l’éthanol et nettoyez les brosses avec de l’éthanol. Une fois les 10 minutes écoulées, retirez le cerveau du tube et placez-le sur le côté ventral vers le haut sur un morceau de gaze sur la scène du cryostat, utilisez une lame de rasoir fraîche et coupez le cerveau pour retirer la partie postérieure du cerveau. Juste rostral au cervelet et la partie antérieure au chiasma optique.Remplissez un moule cryogénique avec un support de montage OCT et placez le cerveau dans le moule avec le côté antérieur vers le bas. Laissez le tissu cérébral geler dans le support de montage jusqu’à ce qu’il devienne blanc. Cela devrait prendre environ 10 minutes.Congelez maintenant le disque de l’échantillon sur le cerveau avec de l’OCT. Retirez ensuite le moule. Insérez le disque avec le cerveau fixé dans la tête de l’échantillon et serrez les vis.Insérez une lame jetable à profil bas dans le porte-couteau et serrez le levier vers le bas. Commencez à trancher le cerveau à 20 microns pour enlever la couche externe d’OCT. Une fois la région de l’hippocampe atteinte, réglez le cadran du micron sur 10.Prélevez des sections coronales en série en plaçant une lame de verre ou du verre plus. Glissez sur la section du tissu. Placez les lames dans un support de coloration sans ARN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que la section soit terminée.Avant de procéder à la coloration des sections, essuyez tous les récipients de coloration et les cylindres gradués avec ese et rincez à l’eau milli Q. Assurez-vous que toutes les solutions ont été préparées avec de l’eau exempte d’ARN et que le violet crestal et le jade fluoré sont passés à travers un filtre de 0,2 micron auparavant. Utilisez des sections de cerveau Thor à température ambiante pendant 30 secondes et fixez-les à 75 % d’éthanol pendant une minute.Procéder ensuite à la contre-coloration appropriée pour le LCM de bandes de neurones ou de neurones individuels pour la LCM de bandes de neurones après fixation, rincer les lames dans de l’eau libre d’ARN pendant une minute, colorer avec 1 % de crête violette pendant une minute. Rincez à l’eau libre d’ARN trois fois pendant une minute chacune, déshydratez avec de l’éthanol à 95 % deux fois pendant 30 secondes chacune. Ensuite, 100 % d’éthanol deux fois pendant 30 secondes et du xylène deux fois pendant trois minutes chacune.Après la teinture, séchez à l’air libre toutes les sections dans une hotte pendant 15 minutes, puis passez à LCM.Here. LCM est effectué. À l’aide d’un microscope à cellule P, deux microscopes E avec un laser à diode infrarouge ajustent d’abord le joystick central en position verticale.Ensuite, tournez et verrouillez l’objectif Forex en position. Placez une lame avec des sections d’hippocampe colorées au centre de la platine du microscope et ajustez-la manuellement jusqu’à ce que la région de l’hippocampe soit visible. Utilisez le cap et trouvez les réglages de mise au point.Pour mettre la section au point, activez le mandrin d’aspirateur en appuyant sur le bouton d’aspiration du contrôleur. Ensuite, faites pivoter et verrouillez l’objectif 10 x en place. Concentrez-vous à nouveau sur le cap et les ajustements fins.Chargez les capuchons de vos capuchons macro LCM dans les capuchons, votre module de cassette, et positionnez un capuchon à la position de la ligne de charge. Tournez le bras de placement du capuchon et positionnez-le autour du capuchon. Soulevez ensuite le bras de placement du capuchon pour retirer le capuchon de votre capuchon du module de cassette.Faites pivoter le bras de placement du capuchon sur la glissière, puis abaissez-le sur la glissière pour placer le capuchon sur la glissière. Ajustez la mise au point fine et déplacez le joystick pour vérifier si les cellules sont à l’intérieur du cercle noir sur le capuchon. Toutes les cellules à capturer doivent se trouver à l’intérieur de ce cercle noir.Réglez maintenant les paramètres laser. Appuyez d’abord sur le bouton d’activation du laser sur le contrôleur. Le point cible laser sera visible en rose.dans le champ de vision sur l’écran de l’ordinateur. Réglez la taille du spot laser sur petite pour faire la mise au point du laser et ajustez la puissance et la durée à 65 à 75 milliwatts pendant une à deux millisecondes selon les besoins pour une capture optimale des cellules. Pour tester le laser, utilisez le joystick pour déplacer le spot laser dans une zone où il n’y a pas de cellules à capter.Tirez le laser à l’aide de l’interrupteur au pouce. Ensuite, utilisez le joystick pour éloigner le point laser du point de polymère fondu et vérifiez s’il y a un anneau sombre visible entourant une zone claire où le laser a été tiré. Pour capturer des cellules, utilisez le joystick pour déplacer le spot laser sur la zone des cellules afin de capturer et de tirer le laser.À l’aide de l’interrupteur au pouce, déplacez le joystick tout en tirant le laser pour capturer une grande zone de cellules. Après avoir tiré toutes les cellules d’intérêt, soulevez le bras de placement du capuchon. Les cellules capturées se sépareront de la section de tissu et adhéreront au chapeau.Votre coiffe, les tissus restants et les cellules manquantes seront visibles dans le champ de vision. Les cellules du capuchon peuvent également être affichées en plaçant le capuchon sur une partie vide de la diapositive. Soulevez le bras de placement du capuchon et faites-le pivoter jusqu’à la station de déchargement du bouchon.Abaissez le capuchon dans la station et tournez le bras de placement du capuchon dans sa position précédente. Faites glisser le capuchon, votre outil d’insertion, le long de la plate-forme et sur le capuchon. Soulevez l’outil avec le capuchon fixé depuis la plate-forme.Touchez légèrement le capuchon à la partie adhésive d’un post-it pour nettoyer les tissus indésirables. Placez le capuchon dans un tube libre d’ARN de 0,5 millilitre rempli de 100 microlitres de tampon de lyse obtenu à partir du kit de micro-isolement aqueux RN. Agitez immédiatement le capuchon pendant 30 secondes pour qu’il mente.Les cellules incubent les échantillons à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes et gèlent à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’isolement de l’ARN. La procédure de coloration pour le LCM des neurones blessés uniques après la fixation est similaire à la procédure pour les bandes de neurones. Cependant, certains temps d’incubation diffèrent et les sections maintenues avec du fluorure pendant quatre minutes avant le rinçage et la déshydratation, voir la partie texte du protocole pour plus de détails après la coloration.Encore une fois, séchez toutes les sections à l’air libre dans une hotte pendant 15 minutes. Avant de passer au LCM pour capturer la charge des cellules uniques, capturez les bouchons HS LCM dans le module de capuchon ou de cassette en utilisant la même procédure que pour le capuchon macro LCM. Encore une fois, réglez la taille du spot laser sur petite pour focaliser le laser, mais cette fois-ci, ajustez la puissance et la durée du laser à 65 à 75 milliwatts pendant 0,45 à 0,5 milliseconde pour une capture optimale des cellules individuelles.Tournez le bras de placement du capuchon sur la glissière et abaissez le bras vers la glissière. Pour placer le capuchon sur la lame, la surface du capuchon HS de capture se trouve au-dessus de l’échantillon. Pendant le LCM, utilisez le joystick pour déplacer le laser sur des cellules positives Fluor Aid.Toutes les cellules capturées doivent se trouver à l’intérieur du petit anneau noir sur le capuchon : tirez le laser à l’aide de l’interrupteur au pouce. Lorsque toutes les cellules dans la zone du cercle noir ont été tirées avec le levage laser, le bras de placement du capuchon, les cellules capturées se séparent de la section tissulaire et adhèrent au capuchon hs de capture. Placez maintenant une autre lame sur la platine du microscope et collectez les cellules positives pour l’aide fluro jusqu’à ce que le capuchon HS soit plein.Ensuite, placez le capuchon dans un tube libre d’ARN de 0,5 millilitre rempli de 40 à 50 microlitres de lyse, de tampon et de vortex et d’incubateurs avant de geler à moins 80 degrés Celsius. S’il n’effectue pas immédiatement l’isolement de l’ARN conformément aux instructions de la partie texte du protocole. Les images suivantes montrent une microdissection par capture laser de bandes de populations cellulaires spécifiques du cerveau du rat congelé des sections coronales de 10 microns du cerveau du rat.Ils ont été préparés selon ce protocole et colorés au violet crestal et à la coloration missile. Cette image montre les neurones paramétalliques des sous-champs ca un à environ trois de l’hippocampe du rat. Ici, des cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe ont été capturées.Enfin, nous montrons des bandes de neurones capturées dans les noyaux bilatéraux du supra-chiasma situés de part et d’autre du troisième ventricule et au-dessus du chiasma optique. Le SCN contient l’horloge circadienne maîtresse qui contrôle les rythmes circadiens dans tout le corps. Les images suivantes montrent la microdissection par capture laser de neurones uniques de l’hippocampe du rat.Montré ici sont la dégénérescence du fluorure de l’hippocampe positif ca trois neurones ici l’aide fluro survivante négative ca trois neurones avant et après le LCM sont montrés les cellules capturées sont visualisées sur le capuchon du LCM. Les images suivantes ont montré l’analyse de l’expression génique de l’ARN total, isolé à partir de neurones capturés au laser. Cette image montre des données quantitatives de PCR en temps réel de l’expression du gène de l’horloge circadienne dans le SCN.Cette carte thermique de l’expression des gènes dans les neurones de l’hippocampe mourants et survivants montre le profilage de l’expression des gènes liés à l’apoptose à l’aide de réseaux de PCR focalisés. Enfin, nous montrons un exemple de carte thermique générée à partir d’une analyse de microréseau ORL du génome entier de l’expression génique dans environ un à environ trois neurones de rats ayant reçu un TCC simulé ou un TCC plus un virus siRNA adéno-associé couché conçu pour inhiber l’expression de l’oxyde nitrique neuronal, de la syntase ou de la glutathion peroxydase un. les deux sont des gènes induits par une lésion cérébrale après son développement. Ces techniques ont ouvert la voie à des scientifiques dans de nombreux domaines de recherche, y compris les lésions cérébrales et le cancer, qui utilisent des modèles animaux de ces troubles pour effectuer le profilage génomique, protéomique et métabolique de populations cellulaires spécifiques.Par exemple, nous utilisons actuellement ces techniques pour capturer au laser des populations cellulaires spécifiques du cortex préfrontal et du noyau accumbens, des zones cérébrales connues pour être impliquées dans la dépendance.

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Gene analyse de l'expression d'un sous-ensemble de cellules dans un tissu spécifique représente un défi majeur. Cet article décrit comment isoler l'ARN total de haute qualité à partir d'une population de cellules spécifiques en combinant une méthode de immunomarquage rapide avec microdissection laser.

Isolement de l&#39;ARN à partir de sous-populations cellulaires spécifiques en utilisant le laser capture microdissection Combiné avec Rapid immunomarquage

Les auteurs décrivent l’utilisation de laser microdissection de saisie pour prélever des échantillons de populations cellulaires distincts de différentes régions du cerveau pour l’analyse des gènes et des micro-ARN. Cette technique permet l’étude des effets différentiels de traumatisme crânien dans des régions spécifiques du cerveau de rat.

Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

Nous décrivons ici un protocole pour une microdissection laser reproductible de la saisie (LCM) pour isoler le réseau trabéculaire (TM) pour l’analyse en aval de RNA. La capacité d’analyser les changements dans l’expression des gènes dans le TM aidera à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents des maladies oculaires liées au TM.

Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

Ce protocole explique comment collecter des neurones uniques, des microglies et des astrocytes du noyau central de l’amygdale avec une grande précision et une spécificité anatomique à l’aide de la microdissection de capture laser. En outre, nous expliquons notre utilisation de microfluidique RT-qPCR pour mesurer un sous-ensemble du transcriptome de ces cellules.

Combiner la microdissection de capture laser et le QPCR microfluidique pour analyser les profils transcriptionnels des cellules uniques : une approche de biologie des systèmes à la dépendance aux opioïdes

La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.

Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion

Nous décrivons ici une méthode pour biopsies muqueuse olfactive de rat et humain des cavités nasales. Ces biopsies peuvent être utilisés soit pour identifier les anomalies moléculaires dans les maladies du cerveau ou d'isoler cellules souches adultes multipotentes qui peuvent être utilisés pour la transplantation de cellules dans des modèles animaux de traumatisme crânien /...

Isoler les cellules souches nasal olfactif des rongeurs ou des êtres humains

Apprenez la microdissection par capture laser pour isoler des populations enrichies de neurones hippocampiques ou des neurones uniques à partir de coupes congelées de cerveau de rat blessé. Cette technique permet l'analyse d'expression génique par PCR quantitative et microarrays.

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour lanalyse dexpression génique après un traumatisme crânien (Vidéo) | JoVE Journal

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l'analyse d'expression génique après un traumatisme crânien

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