Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l'analyse d'expression génique après un traumatisme crânien

L’objectif global de cette procédure est de démontrer comment obtenir des populations enrichies de neurones de l’hippocampe et de neurones uniques à partir de coupes de tissus congelés par microdissection par capture laser pour une analyse ultérieure de l’expression génique. Ceci est accompli par une première anesthésie, un rat dans une chambre d’anesthésie. Le rat est ensuite intubé, ventilé mécaniquement et placé dans un support de tête stéréotaxique pour préparer le rat.

La deuxième étape consiste à administrer la lésion cérébrale à percussion fluide. Ensuite, des sections coronales du cerveau sont coupées sur un cryostat et colorées soit avec l’aide fluro, un marqueur de neurones en dégénérescence, soit avec du violet réel, une coloration de missile. La dernière étape consiste à effectuer une micro-dissection par capture laser et à collecter des neurones uniques ou des pools de neurones.

En fin de compte, l’ARN total est isolé des cellules capturées, analysé pour en déterminer la qualité et quantifié à l’aide d’un bioanalyseur Agilent et utilisé dans des applications en aval telles que la PCR quantitative en temps réel et l’analyse axée sur les voies ou à l’échelle du génome. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la micro-dissection manuelle, est que nous pouvons obtenir des populations enrichies de neurones ou d’autres types de cellules cérébrales telles que les cellules gliales ou immunomodulatrices, ou des neurones uniques à partir de coupes de tissus. Cela nous permet d’effectuer une analyse de l’expression génique dans des types de cellules distincts identifiés dans le cerveau et dans d’autres tissus hétérogènes composés de plusieurs types de cellules, la démonstration de cette procédure sera manquée.

Debbie Boone, associée de recherche principale dans notre laboratoire. Récupérez d’abord le tissu cérébral obtenu à partir de rats présentant une percussion fluide, une lésion cérébrale traumatique ou une lésion simulée dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius, puis transférez-le à moins 22 degrés Celsius. Cryostat pendant 10 minutes pour amener le cerveau à la température de sectionnement pendant que le cerveau dégèle.

Essuyez le cryostat avec de l’ARN zap contenant de l’éthanol et nettoyez les brosses avec de l’éthanol. Une fois les 10 minutes écoulées, retirez le cerveau du tube et placez-le sur le côté ventral vers le haut sur un morceau de gaze sur la scène du cryostat, utilisez une lame de rasoir fraîche et coupez le cerveau pour retirer la partie postérieure du cerveau. Juste rostral au cervelet et la partie antérieure au chiasma optique.

Remplissez un moule cryogénique avec un support de montage OCT et placez le cerveau dans le moule avec le côté antérieur vers le bas. Laissez le tissu cérébral geler dans le support de montage jusqu’à ce qu’il devienne blanc. Cela devrait prendre environ 10 minutes.

Congelez maintenant le disque de l’échantillon sur le cerveau avec de l’OCT. Retirez ensuite le moule. Insérez le disque avec le cerveau fixé dans la tête de l’échantillon et serrez les vis.

Insérez une lame jetable à profil bas dans le porte-couteau et serrez le levier vers le bas. Commencez à trancher le cerveau à 20 microns pour enlever la couche externe d’OCT. Une fois la région de l’hippocampe atteinte, réglez le cadran du micron sur 10.

Prélevez des sections coronales en série en plaçant une lame de verre ou du verre plus. Glissez sur la section du tissu. Placez les lames dans un support de coloration sans ARN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que la section soit terminée.

Avant de procéder à la coloration des sections, essuyez tous les récipients de coloration et les cylindres gradués avec ese et rincez à l’eau milli Q. Assurez-vous que toutes les solutions ont été préparées avec de l’eau exempte d’ARN et que le violet crestal et le jade fluoré sont passés à travers un filtre de 0,2 micron auparavant. Utilisez des sections de cerveau Thor à température ambiante pendant 30 secondes et fixez-les à 75 % d’éthanol pendant une minute.

Procéder ensuite à la contre-coloration appropriée pour le LCM de bandes de neurones ou de neurones individuels pour la LCM de bandes de neurones après fixation, rincer les lames dans de l’eau libre d’ARN pendant une minute, colorer avec 1 % de crête violette pendant une minute. Rincez à l’eau libre d’ARN trois fois pendant une minute chacune, déshydratez avec de l’éthanol à 95 % deux fois pendant 30 secondes chacune. Ensuite, 100 % d’éthanol deux fois pendant 30 secondes et du xylène deux fois pendant trois minutes chacune.

Après la teinture, séchez à l’air libre toutes les sections dans une hotte pendant 15 minutes, puis passez à LCM.Here. LCM est effectué. À l’aide d’un microscope à cellule P, deux microscopes E avec un laser à diode infrarouge ajustent d’abord le joystick central en position verticale.

Ensuite, tournez et verrouillez l’objectif Forex en position. Placez une lame avec des sections d’hippocampe colorées au centre de la platine du microscope et ajustez-la manuellement jusqu’à ce que la région de l’hippocampe soit visible. Utilisez le cap et trouvez les réglages de mise au point.

Pour mettre la section au point, activez le mandrin d’aspirateur en appuyant sur le bouton d’aspiration du contrôleur. Ensuite, faites pivoter et verrouillez l’objectif 10 x en place. Concentrez-vous à nouveau sur le cap et les ajustements fins.

Chargez les capuchons de vos capuchons macro LCM dans les capuchons, votre module de cassette, et positionnez un capuchon à la position de la ligne de charge. Tournez le bras de placement du capuchon et positionnez-le autour du capuchon. Soulevez ensuite le bras de placement du capuchon pour retirer le capuchon de votre capuchon du module de cassette.

Faites pivoter le bras de placement du capuchon sur la glissière, puis abaissez-le sur la glissière pour placer le capuchon sur la glissière. Ajustez la mise au point fine et déplacez le joystick pour vérifier si les cellules sont à l’intérieur du cercle noir sur le capuchon. Toutes les cellules à capturer doivent se trouver à l’intérieur de ce cercle noir.

Réglez maintenant les paramètres laser. Appuyez d’abord sur le bouton d’activation du laser sur le contrôleur. Le point cible laser sera visible en rose.

dans le champ de vision sur l’écran de l’ordinateur. Réglez la taille du spot laser sur petite pour faire la mise au point du laser et ajustez la puissance et la durée à 65 à 75 milliwatts pendant une à deux millisecondes selon les besoins pour une capture optimale des cellules. Pour tester le laser, utilisez le joystick pour déplacer le spot laser dans une zone où il n’y a pas de cellules à capter.

Tirez le laser à l’aide de l’interrupteur au pouce. Ensuite, utilisez le joystick pour éloigner le point laser du point de polymère fondu et vérifiez s’il y a un anneau sombre visible entourant une zone claire où le laser a été tiré. Pour capturer des cellules, utilisez le joystick pour déplacer le spot laser sur la zone des cellules afin de capturer et de tirer le laser.

À l’aide de l’interrupteur au pouce, déplacez le joystick tout en tirant le laser pour capturer une grande zone de cellules. Après avoir tiré toutes les cellules d’intérêt, soulevez le bras de placement du capuchon. Les cellules capturées se sépareront de la section de tissu et adhéreront au chapeau.

Votre coiffe, les tissus restants et les cellules manquantes seront visibles dans le champ de vision. Les cellules du capuchon peuvent également être affichées en plaçant le capuchon sur une partie vide de la diapositive. Soulevez le bras de placement du capuchon et faites-le pivoter jusqu’à la station de déchargement du bouchon.

Abaissez le capuchon dans la station et tournez le bras de placement du capuchon dans sa position précédente. Faites glisser le capuchon, votre outil d’insertion, le long de la plate-forme et sur le capuchon. Soulevez l’outil avec le capuchon fixé depuis la plate-forme.

Touchez légèrement le capuchon à la partie adhésive d’un post-it pour nettoyer les tissus indésirables. Placez le capuchon dans un tube libre d’ARN de 0,5 millilitre rempli de 100 microlitres de tampon de lyse obtenu à partir du kit de micro-isolement aqueux RN. Agitez immédiatement le capuchon pendant 30 secondes pour qu’il mente.

Les cellules incubent les échantillons à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes et gèlent à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’isolement de l’ARN. La procédure de coloration pour le LCM des neurones blessés uniques après la fixation est similaire à la procédure pour les bandes de neurones. Cependant, certains temps d’incubation diffèrent et les sections maintenues avec du fluorure pendant quatre minutes avant le rinçage et la déshydratation, voir la partie texte du protocole pour plus de détails après la coloration.

Encore une fois, séchez toutes les sections à l’air libre dans une hotte pendant 15 minutes. Avant de passer au LCM pour capturer la charge des cellules uniques, capturez les bouchons HS LCM dans le module de capuchon ou de cassette en utilisant la même procédure que pour le capuchon macro LCM. Encore une fois, réglez la taille du spot laser sur petite pour focaliser le laser, mais cette fois-ci, ajustez la puissance et la durée du laser à 65 à 75 milliwatts pendant 0,45 à 0,5 milliseconde pour une capture optimale des cellules individuelles.

Tournez le bras de placement du capuchon sur la glissière et abaissez le bras vers la glissière. Pour placer le capuchon sur la lame, la surface du capuchon HS de capture se trouve au-dessus de l’échantillon. Pendant le LCM, utilisez le joystick pour déplacer le laser sur des cellules positives Fluor Aid.

Toutes les cellules capturées doivent se trouver à l’intérieur du petit anneau noir sur le capuchon : tirez le laser à l’aide de l’interrupteur au pouce. Lorsque toutes les cellules dans la zone du cercle noir ont été tirées avec le levage laser, le bras de placement du capuchon, les cellules capturées se séparent de la section tissulaire et adhèrent au capuchon hs de capture. Placez maintenant une autre lame sur la platine du microscope et collectez les cellules positives pour l’aide fluro jusqu’à ce que le capuchon HS soit plein.

Ensuite, placez le capuchon dans un tube libre d’ARN de 0,5 millilitre rempli de 40 à 50 microlitres de lyse, de tampon et de vortex et d’incubateurs avant de geler à moins 80 degrés Celsius. S’il n’effectue pas immédiatement l’isolement de l’ARN conformément aux instructions de la partie texte du protocole. Les images suivantes montrent une microdissection par capture laser de bandes de populations cellulaires spécifiques du cerveau du rat congelé des sections coronales de 10 microns du cerveau du rat.

Ils ont été préparés selon ce protocole et colorés au violet crestal et à la coloration missile. Cette image montre les neurones paramétalliques des sous-champs ca un à environ trois de l’hippocampe du rat. Ici, des cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe ont été capturées.

Enfin, nous montrons des bandes de neurones capturées dans les noyaux bilatéraux du supra-chiasma situés de part et d’autre du troisième ventricule et au-dessus du chiasma optique. Le SCN contient l’horloge circadienne maîtresse qui contrôle les rythmes circadiens dans tout le corps. Les images suivantes montrent la microdissection par capture laser de neurones uniques de l’hippocampe du rat.

Montré ici sont la dégénérescence du fluorure de l’hippocampe positif ca trois neurones ici l’aide fluro survivante négative ca trois neurones avant et après le LCM sont montrés les cellules capturées sont visualisées sur le capuchon du LCM. Les images suivantes ont montré l’analyse de l’expression génique de l’ARN total, isolé à partir de neurones capturés au laser. Cette image montre des données quantitatives de PCR en temps réel de l’expression du gène de l’horloge circadienne dans le SCN.

Cette carte thermique de l’expression des gènes dans les neurones de l’hippocampe mourants et survivants montre le profilage de l’expression des gènes liés à l’apoptose à l’aide de réseaux de PCR focalisés. Enfin, nous montrons un exemple de carte thermique générée à partir d’une analyse de microréseau ORL du génome entier de l’expression génique dans environ un à environ trois neurones de rats ayant reçu un TCC simulé ou un TCC plus un virus siRNA adéno-associé couché conçu pour inhiber l’expression de l’oxyde nitrique neuronal, de la syntase ou de la glutathion peroxydase un. les deux sont des gènes induits par une lésion cérébrale après son développement. Ces techniques ont ouvert la voie à des scientifiques dans de nombreux domaines de recherche, y compris les lésions cérébrales et le cancer, qui utilisent des modèles animaux de ces troubles pour effectuer le profilage génomique, protéomique et métabolique de populations cellulaires spécifiques.

Par exemple, nous utilisons actuellement ces techniques pour capturer au laser des populations cellulaires spécifiques du cortex préfrontal et du noyau accumbens, des zones cérébrales connues pour être impliquées dans la dépendance.