Name: Enregistrement de lactivité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Découvrez l'enregistrement électrophysiologique de neurones GnRH identifiés dans le cerveau intact de poissons transgéniques. Cette méthode par patch clamp préserve les circuits neuronaux pour étudier la neuroendocrinologie reproductive.

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Nous remercions le Dr Meng-Chin Lin et Mme Yuan Dong pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health HD053767 (sous-traitance à ANL), et par des fonds provenant du département de physiologie et le Bureau du vice-chancelier de la recherche, de l&#39;Université de Californie-Los Angeles (ANL).

1. Dissection de cerveaux de l&#39;adulte Medaka <ol><li> Anesthésier adulte mâle ou femelle (figure 1A) par immersion dans 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4); attendre quelques minutes après les mouvements de branchies ont cessé avant le décapiter. Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel de l&#39;utilisation de l&#39;Université de Californie-Los Angeles. </li><li> Décapiter le poisson dans une solution saline de poisson à l&#39;extrémité caudale de l&#39;opercule avec des ciseaux dans une boîte de Pétri diamètre 60 mm. </li><li> la tête de poisson de transfert à une boîte de Petri de diamètre 35 mm, à moitié rempli d&#39;une solution saline poissons et bordée de Sylgard qui présente un renfoncement en elle pour positionner et fixer la tête pour la dissection des cerveaux. Positionner et fixer la tête dorso-latérale avec des épingles insectes. </li><li> Découpez soigneusement la partie dorsale du crâne autour de son périmètre avec des ciseaux fins et retirez-le délicatement avec une pince, exposant la partie dorsale du cerveau, y compris complètement la partie antérieure de la moelle épinière. </li> &lt;li&gt; Soulever la moelle épinière délicatement avec une pince à pointe fine et couper les nerfs conjonctifs bilatéraux avec des ciseaux à pointe fine: les nerfs crâniens, les nerfs spinaux et des nerfs optiques sur la face ventrale du cerveau et les nerfs olfactifs à la partie antérieure de le cerveau. </li><li> Placez le cerveau entièrement disséqué dans un plat frais Petri remplie de sérum physiologique des poissons, et vérifiez soigneusement sous le microscope afin d&#39;assurer la totalité du cerveau est intact (y compris la glande pituitaire), sans coupures ou perforations. Cerveaux endommagés ne sont pas utilisés pour l&#39;expérimentation. </li></ol> 2. Montage du cerveau dans une chambre d&#39;enregistrement <ol><li> Placer une petite goutte de cyanoacrylate ou une autre colle à action rapide avec une aiguille dans le centre de la chambre d&#39;enregistrement et étaler la colle d&#39;environ 1 cm 2. </li><li> Transférer rapidement le cerveau et le coller dans une position ventrale vers le haut. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;une solution saline de poisson afin qu&#39;il remplisse la chambre d&#39;enregistrement et couvre le cerveau. Perfuser en continule cerveau avec une solution saline de poisson aérée à un débit d&#39;au moins 200 pl / min. </li><li> Utilisation de la pointe fine Pince retirer soigneusement les méninges sur la surface de la zone d&#39;enregistrement du cerveau. </li></ol> 3. Électrophysiologie <ol><li> Lâche enregistrement de patch de potentiel d&#39;action tir <ol><li> microélectrodes de verre (6-10 MQ) sont construits à partir des pipettes en verre borosilicate (1B150F-4, World Precision Instruments) à l&#39;aide d&#39;un extracteur d&#39;électrode (par exemple Sutter P-87), et le dos remplis avec la solution d&#39;enregistrement libre-patch mi-chemin de l&#39; électrode. </li><li> En utilisant un microscope à fluorescence verticale avec un dispositif à couplage de charge refroidi (CCD), trouver la GFP exprimant TN-GnRH3 neurones à travers 10x (figure 1B), puis des objectifs à immersion d&#39;eau 40x (figure 1C). Ils sont situés à la surface ventrale des bulbes olfactifs, juste en avant du télencéphale ou à proximité. </li><li> Basculer vers un moniteur vidéo qui fournitimages en temps réel de la microscope pour localiser le neurone groupe TN-GnRH3 (figure 1C). </li><li> Positionner le micro-électrodes dans le bain de sorte que la pointe de l&#39;électrode est au-dessus du neurone cible. Appliquer une légère pression constante positive à la micro-électrode de sorte qu&#39;elle ne soit pas obstruée, et une approche en douceur le neurone cible avec la pointe de l&#39;électrode. </li><li> Contrôler et surveiller la résistance de l&#39;électrode en mode voltage-clamp en utilisant un logiciel de AxoGraph et amplificateur Axoclamp 200B avec le logiciel Axograph (Axon Instruments). Lorsque vous pouvez le voir sur le moniteur vidéo que la pointe de l&#39;électrode est à la surface du neurone et de l&#39;affichage de AxoGraph que la résistance change légèrement, relâchez la pression positive et appliquer une légère pression négative si nécessaire pour faire un joint à faible résistance sur le neurone (&lt;100 MQ). </li><li> Passez en mode courant-clamp, et enregistrer la tension de la membrane en continu sans aucun courant d&#39;entrée, le réglage de l&#39;échellede la tension et la vitesse de l&#39;enregistrement si nécessaire. Les données sont recueillies et analysées par le logiciel Powerlab (ADInstruments Inc.). </li><li> Fiche de référence activité électrique dans une solution saline de poisson normale pendant environ 5 min avant tout traitement (figure 2A). perfusion de bain de médicaments, hormones, peptides, etc. ajoutée à la solution saline de poissons se poursuit au rythme de 200 pi / min, suivie d&#39;une période de sevrage chez les poissons solution saline normale 5, 6, 11. </li></ol></li><li> Enregistrement de cellules entières du potentiel de membrane L&#39;ensemble du patch clamp procédure d&#39;électrophysiologie de la cellule est le même que celui de la procédure d&#39;enregistrement mobiles extracellulaire correction décrite ci-dessus, à partir des étapes 3.1.1 - 3.1.4. Ensuite, les procédures diffèrent en conséquence: <ol><li> Contrôler et surveiller la résistance de l&#39;électrode en mode voltage-clamp. Lorsque vous pouvez le voir sur le moniteur vidéo que la pointe de l&#39;électrode est à la surface du neurone et de l&#39;oscilloscope que les changements de résistance légèrement, relâchez le positifpression et appliquer un peu de pression négative pour faire un joint haute résistance sur le neurone (~ 3 Giga Ω). Appliquer aspiration douce par la bouche à une rupture de la membrane patché, vous verrez une chute soudaine de la résistance à environ 120-250 MQ. </li><li> Passez en mode courant-clamp, et enregistrer la tension de la membrane en continu sans aucun courant d&#39;entrée, en ajustant l&#39;échelle de la tension et la fréquence de l&#39;enregistrement si nécessaire. </li><li> Fiche de référence activité électrique dans une solution saline de poisson normale pendant environ 5 min avant tout traitement, tel que décrit ci-dessus en 3.1.7 (figure 2B). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrophin-releasing+hormone+%28GnRH%29+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Soc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom.</a> J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).</li>
<li>Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+from+conspecifics+alter+electrical+activity+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+the+terminal+nerve+via+visual+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).</li>
<li>Abe, H., Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuromodulation+by+a+nonhypophysiotropic+GnRH+system+controlling+motivation+of+reproductive+behavior+in+the+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost.</a> 57 (6), 665-674 (2011).</li>
<li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodotoxin-resistant+persistent+Na%2B+current+underlying+pacemaker+potentials+of+fish+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones.</a> J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).</li>
<li>Zhao, Y., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Kisspeptin1+on+Electrical+Activity+of+an+Extrahypothalamic+Population+of+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Neurons+in+Medaka%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka.</a> PLoS One. 7 (5), e37909(2012).</li>
<li>Wayne, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+electrophysiology+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+that+express+green+fluorescent+protein+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).</li>
<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+gonadotropin-releasing+hormone+neuronal+development%3A+insights+from+transgenic+medaka+and+the+relevance+to+X-linked+Kallmann+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome.</a> Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+gonadotropin-releasing+hormone+in+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).</li>
<li>Ramakrishnan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+spontaneous+electrical+activity+during+embryonic+development+of+gonadotropin-releasing+hormone-3+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).</li>
<li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gonadotropin-releasing+hormone-3+neuron+ablation+in+zebrafish%3A+effects+on+neurogenesis%2C+neuronal+migration%2C+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction.</a> Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).</li>
<li>Wayne, N. L., Kuwahara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-endorphin+alters+electrical+activity+of+gonadotropin+releasing+hormone+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+the+teleost+medaka+%28Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).</li>
<li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones+and+steroid-sensitive+sexually+dimorphic+kisspeptin+neurones+in+teleosts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts.</a> J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , Wiley & Sons. England. (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

GnRH 3: GFP transgéniques poissons fournissent des modèles uniques pour étudier les mécanismes neurophysiologiques qui sous-tendent l&#39;intégration neuronale et de la réglementation dans le contrôle central de comportements qui sont à la fois directement et indirectement impliqués dans la reproduction 3, 8-10. L&#39;un des avantages importants de ce système modèle, c&#39;est que beaucoup GnRH3 neurones exprimant la GFP sont proches de la surface ventrale du cerveau, permettant un accès relativement...

<table><tbody><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>BX50W (vertical)</td></tr><tr><td>Amplificateur</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axoclamp 200B </td></tr><tr><td>Convertisseur A-D</td><td>Computer Interference Corp.</td><td></td><td>Digidata ITC-18 </td></tr><tr><td>Caméra CCD refroidie</td><td>PCO Optique</td><td></td> informatique <td>Sensicam</td></tr><tr><td>Lampe au xénon</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeu de filtres GFP</td><td>Logiciel d’imagerie Chroma Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Innovations</td><td></td> en imagerie intelligente <td>Logiciel de diaporama Logiciel </td></tr><tr><td>d’acquisition de données d’électrophysiologie</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Logiciel d’axographe </td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition de données d’électrophysiologie</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td>PowerLab </td></tr><tr><td>Headstage pour l’électrophysiologie</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>CV 203BU </td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme de chambre d’enregistrement</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>P1 </td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>RC-26G </td></tr><tr><td>Extracteur d’électrodes</td><td>Sutter instruments</td><td></td><td>P87 </td></tr><tr><td>Filament pour extracteur d’électrodes</td><td>Sutter Instruments</td><td>FB330B</td><td>Filament d’auge de 3,0 mm de large Capillaires</td></tr> en <tr><td>verre de 1,5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>Micr&#8211 ; lectrode pour l’enregistrement</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Becton Dickinson</td><td>309586</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>MS-222 </td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate</td></tr><tr><td>sel Poisson salin</td><td></td><td></td><td>mM : 134 NaCl ; 2.9 KCl ; 2.1 CaCl2 ; 1.2 MgCl2 ; 10 HEPES </td></tr><tr><td>Solution d’électrode (loose-patch) </td><td></td><td></td><td>mM : 150 NaCl ; 3,5 KCl ; 2.5 CaCl2 ; 1,3 MgCl2 ; 10 HEPES ; Solution de 10 </td></tr><tr><td>électrodes de glucose (patch de cellules entières) </td><td></td><td></td><td>mM : 112,5 K-gluconate ; NaCl ; 17,5 KCl ; 0,5 CaCl2 ; 1 MgCl2 ; 5 MgATP ; 1 EGTA ; 10 HEPES ; 1 GTP ; 0,1 lupeptine ; 10 phospho-créatine </td></tr></tbody></table>

enregistrement de l&#39;activité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Comprendre la physiologie cellulaire des circuits neuronaux qui régissent les comportements complexes est grandement améliorée par l&#39;utilisation de systèmes modèles dans lesquels ce travail peut être effectué dans une préparation de cerveau intact où les circuits neuronaux du système nerveux central reste intact. Nous utilisons des poissons transgéniques dans lesquelles la gonadolibérine (GnRH neurones) sont génétiquement marquées avec une protéine fluorescente verte pour l&#39;identification dans le cerveau intact. Les poissons ont de multiples populations de neurones à GnRH, et leurs fonctions dépendent de leur emplacement dans le cerveau et le gène de la GnRH qu&#39;ils expriment 1. Nous avons concentré notre démonstration sur GnRH3 neurones situés dans les nerfs terminaux (TN) associés aux bulbes olfactifs en utilisant le cerveau intact de poisson transgénique médakas (figure 1B et C). Des études suggèrent que medaka neurones TN-GnRH3 sont neuromodulateur, agissant comme un émetteur d&#39;informations provenant de l&#39;environnement extérieur au système nerveux central; they ne jouent pas un rôle direct dans la régulation des fonctions hypophyso-gonadique, tout comme le bien connu hypothalamique GNRH1 neurones 2, 3. Le modèle tonique de potentiel d&#39;action spontanée des neurones TN-GnRH3 est une propriété intrinsèque 4-6, la fréquence est modulée par des signaux visuels de leurs congénères 2 et la kisspeptine neuropeptide 1 5. Dans cette vidéo, nous utilisons une ligne stable d&#39;transgénique médakas dans lequel les neurones TN-GnRH3 expriment un transgène contenant la région promotrice du Gnrh3 lié à la protéine fluorescente verte 7 pour vous montrer comment identifier les neurones et surveiller leur activité électrique dans le cerveau entier préparation 6.

Un exemple de groupes bilatéraux de GFP marqués TN-GnRH3 neurones du cerveau excisé du poisson medaka sont présentés dans les figures 1B et 1C. Chaque cluster contient environ 8-10 neurones à GnRH. Les activités neuronales spontanées de la cible TN-GnRH3 ont été enregistrées en mode courant-clamp (I = 0) avec des taux de cuisson typiques de 0,5-6 Hz. Le modèle de potentiel d&#39;action tir est typiquement un modèle de tonic ou battant, avec un intervalle entre pics assez régulière. trac...

Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment enregistrer l&#39;activité électrique de neurones isolés identifiés dans une préparation de tout le cerveau, ce qui préserve les circuits neuronaux complexes. Nous utilisons des poissons transgéniques dans lesquelles la gonadolibérine (GnRH neurones) sont génétiquement marquées avec une protéine fluorescente pour l&#39;identification dans la préparation du cerveau intact.

Enregistrement de l&#39;activité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer les activités électriques des neurones dans une préparation de cerveau de poisson intact. Pour ce faire, on commence par anesthésier un poisson transgénique méca âgé de quatre à six mois dans du MS 222, puis on dissèque son cerveau. Ensuite, on place une électrode d'enregistrement en contact avec l'un des neurones d'intérêt marqués par la GFP et on enregistre ses activités électriques par électrophysiologie en mode patch lâche ou en mode « whole cell » (patch-clamp en cellule entière).En fin de compte, les résultats peuvent montrer des modifications de la fréquence de décharge des potentiels d'action ou des changements de potentiel membranaire en réponse à différents traitements dans le cerveau intact. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'électrophysiologie des cellules en culture ou les préparations de tranches de cerveau, est que nous pouvons caractériser les propriétés électriques des neurones dans une préparation de cerveau entier dotée de circuits neuronaux intacts. Bien que cette méthode fournisse des informations sur la neuroendocrinologie de la reproduction, elle pe

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