Enregistrement de l'activité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer les activités électriques des neurones dans une préparation de cerveau de poisson intact. Pour ce faire, on commence par anesthésier un poisson transgénique méca âgé de quatre à six mois dans du MS 222, puis on dissèque son cerveau. Ensuite, on place une électrode d'enregistrement en contact avec l'un des neurones d'intérêt marqués par la GFP et on enregistre ses activités électriques par électrophysiologie en mode patch lâche ou en mode « whole cell » (patch-clamp en cellule entière).

En fin de compte, les résultats peuvent montrer des modifications de la fréquence de décharge des potentiels d'action ou des changements de potentiel membranaire en réponse à différents traitements dans le cerveau intact. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'électrophysiologie des cellules en culture ou les préparations de tranches de cerveau, est que nous pouvons caractériser les propriétés électriques des neurones dans une préparation de cerveau entier dotée de circuits neuronaux intacts. Bien que cette méthode fournisse des informations sur la neuroendocrinologie de la reproduction, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes neurologiques en utilisant des poissons modèles tels que le poisson-zèbre, par exemple pour étudier les neurones contrôlant la motivation et les comportements affectifs.

Cette démonstration utilise des poissons méca transgéniques dans lesquels les neurones exprimant la GnRH trois sont génétiquement marqués par la GFP. Pour commencer, anesthésiez un adulte de type maka en l'immergeant dans cinq millilitres de MS 222. Quelques minutes après l'arrêt des mouvements des branchies, transférez-le dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant une solution saline pour poisson. Utilisez ensuite des ciseaux pour décapiter le poisson à l'extrémité caudale de l'alum.

Transférez la tête dans une boîte de Pétri de 35 millimètres de diamètre, remplie à moitié de solution saline pour poisson et doublée de garde yl. La boîte doit présenter une dépression centrale permettant de positionner et de fixer la tête, côté dorsal vers le haut, à l’aide d’épingles à insectes et de ciseaux fins. Coupez soigneusement la partie dorsale du crâne tout autour de son périmètre.

Ensuite, retirez délicatement le crâne à l’aide de pinces pour exposer la partie dorsale du cerveau, y compris la partie antérieure de la moelle épinière. Soulevez maintenant délicatement la moelle épinière à l’aide de pinces à pointe fine, puis sectionnez les nerfs connectifs bilatéraux à l’aide de ciseaux à pointe fine. Cela inclut la section des nerfs crâniens, des nerfs spinaux, des nerfs optiques du côté ventral et des nerfs olfactifs antérieurs.

Placer le cerveau entièrement disséqué dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de sérum physiologique pour poisson sous un microscope. Vérifier soigneusement que l'ensemble du cerveau et l'hypophyse sont intacts et ne présentent ni coupure ni perforation. Rejeter les cerveaux endommagés et recommencer en utilisant une aiguille.

Placez une petite goutte de colle à prise rapide, comme le cyanoacrylate, au centre de la chambre d'enregistrement. Étalez la goutte de colle sur un centimètre carré. Puis transférez rapidement le cerveau sur la colle.

Fixez-le avec la face ventrale vers le haut. Remplissez maintenant la chambre d’enregistrement avec environ un millilitre de solution saline pour poisson afin de recouvrir le cerveau. À l’aide de la pince à pointe fine, retirez soigneusement les méninges recouvrant la surface de la zone d’enregistrement du cerveau, en progressant vers l’avant.

Perfuser continuellement le cerveau avec une solution saline aérée pour poissons à un débit d'au moins 200 microlitres par minute. Préparer six à dix microélectrodes en verre de six à dix mégaohms et les remplir rétrograduellement à moitié avec une solution de enregistrement en configuration patch lâche. À l’aide d’un microscope à fluorescence droit équipé d’une caméra CCD refroidie, localiser les neurones du nerf terminal exprimant GFP gn RH trois en commençant par l’objectif 10 x.

Ensuite, passez à l'objectif 40 x et localisez les neurones à la surface ventrale ou près de celle-ci des bulbes olfactifs, juste en avant du céphalon. Passez maintenant à un moniteur vidéo qui fournit des images en temps réel provenant du microscope. Le groupe de neurones contient de huit à dix neurones à GnRH.

Positionnez la microélectrode dans la baignoire de la chambre d'enregistrement, avec la pointe de l'électrode au-dessus du neurone cible. Appliquez une légère pression positive constante afin que la microélectrode ne se bouche pas. Approchez-vous délicatement du neurone cible avec la pointe de l'électrode, et vérifiez ainsi que surveillez la résistance de l'électrode à l'aide du logiciel AxoGraft.

En utilisant le test d'étanchéité en mode blocage de tension, lorsque la pointe de l'électrode se trouve à la surface du neurone, la résistance de l'électrode change légèrement à ce moment-là. Relâchez la pression positive pour former un scellement de basse résistance ; si nécessaire, appliquez une légère pression négative. L'étape la plus critique pour un bon enregistrement consiste à sélectionner un neuro-bras propre, ce qui peut vous aider à réaliser un scellement idéal entre l'électrode et la membrane.

Passer maintenant en mode de clampage de courant. Ouvrir Chart, un programme PowerLab, et commencer à enregistrer continuellement la tension membranaire sans aucune injection de courant. Ajuster l'échelle de tension et la fréquence d'enregistrement si nécessaire. Enregistrer l'activité électrique de base dans la solution saline normale pour poisson pendant environ cinq minutes avant d'appliquer tout traitement. La perfusion par bain de médicaments, d'hormones, de peptides, etc., doit être ajoutée à la préparation cérébrale, avec un débit de 200 microlitres par minute.

Ensuite, utilisez une solution saline normale pour poisson afin de procéder à une période de lavage après avoir localisé une cellule ; vérifiez et surveillez la résistance de l'électrode en mode de blocage de tension. Lorsque l'extrémité de l'électrode se trouve à la surface du neurone et que la résistance de l'électrode change légèrement, relâchez la pression positive et appliquez une légère pression négative afin d'obtenir un scellement de haute résistance sur le neurone.

Appliquez une aspiration douce avec la bouche. Rompez la membrane de la cellule patchée. La résistance chutera instantanément à environ 120 à 250 mégohms lorsque la membrane se rompt.

Passer maintenant en mode de blocage de courant et enregistrer continuellement la tension membranaire à l’aide d’un graphique, sans injection de courant. Ajuster à nouveau l’échelle de tension et la vitesse d’enregistrement selon les besoins. Après avoir effectué un enregistrement de base de l’activité électrique dans une solution saline normale pour poisson pendant environ cinq minutes, appliquer les traitements suivis d’une période de lavage. Les activités électriques spontanées des neurones GNRH trois du nerf terminal moca ont été enregistrées en mode de blocage de courant.

La fréquence de décharge typique est de 0,5 à six hertz. Les potentiels se déclenchent généralement selon un patron tonique ou rythmique avec un intervalle entre pics assez régulier, la membrane entre pics ayant une moyenne d’environ moins 48 millivolts. Cette approche expérimentale permet également d’enregistrer les neurones GNRH marqués par la GFP situés dans le cerveau antérieur d’adultes transgéniques.

Activité électrique des neurones de poisson zèbre dans le cerveau intact excisé de lignées transgéniques. L'enregistrement chez le poisson zèbre a été réalisé de manière similaire à celle décrite pour un DACA par une technique de patch lâche. Les mêmes techniques ont également permis des enregistrements en configuration de cellule entière.

Contrairement aux neurones à GnRH du nerf terminal méca, le patron de décharge spontanée des potentiels d'action des neurones à GnRH du poisson zèbre situés dans la région pré-optique, le cerveau ventral et l'hypothalamus est souvent irrégulier. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure pour un enregistrement de 15 minutes, à condition de la pratiquer correctement. Bonne chance.