Injection stéréotaxique d'un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une expression génique limitée dans l’espace dans la moelle épinière de souris en injectant stéréotaxiquement un vecteur viral dans la corne dorsale lombaire. La première étape de la procédure consiste à localiser et à exposer la vertèbre lombaire. La deuxième étape consiste à retirer la partie dorsale de la vertèbre afin de révéler la moelle épinière.

Une procédure appelée laminectomie. Ensuite, une pipette en verre reliée à un micro-pousse-seringue est positionnée sur la corne dorsale et abaissée dans la moelle épinière. La dernière étape consiste à injecter lentement la suspension vectorielle.

Deux semaines plus tard, la transfection des neurones de la corne dorsale est mise en évidence par l’expression d’une protéine fluorescente verte, qui permet de suivre la distribution du virus. Cette méthode aide à élucider la fonction des neurones dans une partie de la voie sensorielle. Nous l’utilisons dans des études qui se concentrent spécifiquement sur le développement de la douleur inflammatoire ou neuropathique.

La démonstration visuelle est essentielle pour apprendre à positionner la souris dans le cadre stéréotaxique. Il est essentiel pour le succès de la procédure que la colonne vertébrale soit correctement fixée car la laminectomie est une technique si délicate. Martin Mole, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

John Wang, un assistant de recherche, l’aidera un ou deux jours avant l’intervention. Pipettes en verre Pul pour obtenir un diamètre de pointe de 40 micromètres et biseauter la pointe à un angle de 20 degrés le jour de l’intervention. Commencez la procédure en désinfectant le matériel chirurgical et en préparant les outils chirurgicaux stériles pour mettre en place le cadre stéréotaxique.

Montez l’injecteur de micro-seringue sur le manipulateur et branchez l’appareil. Fixez l’une des pipettes en verre à la micro-seringue à l’aide du raccord à compression. Retirez maintenant le piston de la micro-seringue.

Remplissez la seringue avec l’huile minérale, puis réinsérez le piston et poussez-le jusqu’à l’extrémité. Évitez soigneusement de créer des bulles d’air. Insérez ensuite la micro-seringue dans le support de l’injecteur.

Ensuite, sortez le virus du congélateur et préparez la suspension de particules virales juste avant de l’utiliser en la diluant avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile à la concentration de particules souhaitée. Pipetez cinq microlitres de suspension virale sur un petit morceau de param. Abaissez ensuite l’embout de la pipette en verre dans la goutte et tirez sur le piston pour remplir la micro-seringue.

À la fin. Créez une petite bulle d’air au niveau de la pointe de la pipette pour éviter qu’elle ne se bouche. Dans cette étape, préparez la zone de chirurgie en essuyant le banc dans le coussin chauffant avec un désinfectant.

Ensuite, anesthésie la souris par inhalation de fluor. Ensuite, appliquez du lubrifiant sur chaque œil pour les protéger du dessèchement pendant l’opération. Ensuite, rasez la fourrure du bas du dos jusqu’au cou de la souris. Désinfectez la peau avec des lingettes alternées d’un antiseptique topique, tel que la chlorhexidine ou la povidone iodée, et de 70 % d’éthanol.

Ensuite, infiltrez le site d’incision avec 0,25 % de bupivacaïne dilué un à 10 avec une solution saline physiologique. Par la suite, incisez la peau à l’extrémité du dorlotement de la cage thoracique, sur deux à trois centimètres le long de la ligne médiane et séparez le fascia recouvrant la colonne vertébrale. Identifiez la vertèbre L un, qui est située dorlotée à la vertèbre, tenant la dernière paire de côtes et exposez-la en enlevant les petits muscles et ligaments de la colonne vertébrale attachés à sa surface dorsale.

Ensuite, soulevez légèrement et maintenez la vertèbre L une avec une paire d’ajouts et de pinces. Ensuite, utilisez une pince à laminectomie dédiée pour retirer la partie dorsale de la vertèbre, y compris l’apophyse épineuse et la lame pour exposer la moelle épinière. Évitez d’endommager la dure-mère ou la moelle épinière pendant cette procédure.

Transférez ensuite la souris sur une plaque chauffante dans le cadre stéréotaxique et surveillez la température de la souris pendant l’opération ultérieure. Utilisez maintenant les pointes à encoche en V pour stabiliser la colonne vertébrale afin que la vertèbre ne bouge pas pendant la respiration. Ensuite, rapprochez la micro-seringue de manière à ce que la pointe de la pipette se trouve au-dessus du site de laminectomie.

Abaissez le piston jusqu’à ce que vous voyiez la suspension virale sortir de la pipette. Retirez la gouttelette avec de la gaze stérile. Positionnez ensuite la pointe de la pipette sur la partie la plus rostrale de la moelle épinière exposée.

Centrez la pipette au-dessus du sillon médian postérieur et déplacez la pointe de 500 micromètres latéralement. Après cela, abaissez la pointe à la surface du cordon et percez la dure-mère. Ensuite, abaissez la pointe du verre, pipette 300 micromètres dans la moelle épinière.

Injecter un microlitre de suspension virale à une vitesse de 200 nanolitres par minute. A la fin de l’injection, attendez au moins deux minutes avant de rétracter lentement la pipette. Répétez la procédure d’injection au niveau de la partie la plus choyée de la moelle épinière exposée pour obtenir une distribution complète du vecteur viral dans le segment rachidien L quatre.

Les deux sites d’injection sont situés rostral et dorlotent le segment L quatre. Pour éviter d’endommager les tissus de la région cible après la libération de l’injection, la vertèbre L de l’encoche en V se pince et retire la souris du cadre stéréotaxique. Ensuite, suturez le fascia avec cinq oh Vicryl.

Le fascia fermé couvre le site de laminectomie. Fermez ensuite la peau à l’aide de sutures en nylon ou d’agrafes chirurgicales. Fournir une analgésie post-chirurgicale pendant 72 heures avec des injections sous-cutanées quotidiennes de carprofène à cinq milligrammes par kilogramme.

Transférez la souris dans une cage de récupération avec une litière molle et non particulière. Placez la souris sur le côté pour une respiration confortable. Ensuite, surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il soit complètement alerte.

Ambulance et commence à boire. Surveiller la récupération post-chirurgicale par une inspection quotidienne pendant les trois premiers jours. Puis tous les deux jours ou trois jours par semaine jusqu’à ce que l’expérience soit terminée.

Sept à 10 jours après l’opération lorsque la cicatrisation de la plaie est terminée. Retirez les sutures cutanées ou les agrafes. Cette figure montre l’expression de la protéine rapporteure fluorescente verte améliorée ou EGFP dans la corne dorsale gauche de la moelle épinière L quatre.

Deux semaines après l’injection stéréotaxique des neurones R-A-A-V-E-G-F-P ont été immunomarqués pour les noyaux neuronaux Protéine montrée en pointe de flèche rouge. Pointez vers des cellules gliales transfectées dispersées dans la colonne dorsale. Environ 80 % des neurones de la corne dorsale médiale ont été infectés par la pratique.

La procédure peut être terminée en 30 à 40 minutes, et n’oubliez pas de maintenir des conditions stériles pendant la procédure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des injections chimales intra pin dans la dose ho de la moelle épinière de la souris. Nous utilisons la technique pour la manipulation génétique, mais vous pouvez l’adapter à d’autres fins telles que l’application de médicaments intraspinaux.