Name: Injection stéréotaxique dun vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez l'injection stéréotaxique d'un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris. Cette méthode permet une expression génique ciblée dans la corne dorsale lombaire.

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Nous remercions Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur du développement et de la production Vector dans la Neuroscience Center du Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, pour nous avoir fourni le vecteur rAAV-EGFP, et John Whang pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par une bourse R01 NS050408 (JS) de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies.

La procédure chirurgicale décrite a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Columbia. 1. Préparation de l&#39;équipement et de la suspension de particules de virus <ol><li> Nettoyer et désinfecter le matériel, stériliser les instruments chirurgicaux et les pointes entaille en V qui seront utilisés pour fixer L1 vertèbre. </li><li> Tirez et pipettes en verre coniques. Nous utilisons des pipettes qui ont un diamètre de pointe de 40 um et sont biseautés à un angle de 20 °. Stériliser les pipettes en verre. </li><li> Mettre en place le cadre stéréotaxique, monter l&#39;injecteur microseringue sur le manipulateur et de connecter l&#39;injecteur au dispositif de commande. </li><li> Fixez l&#39;un des pipettes en verre à l&#39;aide de la microseringue kit raccord à compression. </li><li> Retirer le piston de la microseringue et remplissez la seringue avec de l&#39;huile minérale. Oil Red O (1 - (2,5-diméthyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) phénylazo)-2-naphtol) peut être ajouté à l&#39;huile minérale pour augmenter sa visibility. Réinsérez le piston et le pousser à tout le chemin à la pointe. Soigneusement éviter de créer une bulle d&#39;air. </li><li> Préparer la suspension de particules de virus dans une enceinte de sécurité biologique. Décongeler le virus congelé dans la glace et, juste avant utilisation, le diluer avec de stérile saline tamponnée au phosphate à la concentration de particules souhaitée. </li><li> Insérez la microseringue dans le support de l&#39;injecteur. </li><li> 5 ul de la suspension de virus sur une feuille de plastique faible, par exemple Parafilm. Abaissez la pointe de la pipette en verre dans la goutte et tirez sur le piston pour remplir la microseringue. Créer une petite bulle d&#39;air à la pointe de la pipette pour l&#39;empêcher de se boucher. </li></ol> 2. Laminectomie <ol><li> Préparer le secteur de la chirurgie en essuyant banc et coussin chauffant avec un désinfectant. </li><li> Anesthésier la souris. Nous utilisons l&#39;anesthésie par inhalation avec l&#39;isoflurane (3% lors de l&#39;induction, 2% -3% lors de l&#39;entretien). </li><li> Placez lubrifiant sur chaque œil afin de protéger les yeux de séchage pendant lafonctionnement. </li><li> Raser les poils de la partie inférieure arrière de la nuque de la souris et désinfecter la peau avec une alternance de lingettes d&#39;un antiseptique topique telles que la chlorhexidine ou la povidone-iode et de l&#39;éthanol 70%. Isoler le site de manière aseptique avec champ opératoire et infiltrent le site de l&#39;incision avec de la bupivacaïne (0,25%, 1:10 dilué avec du sérum physiologique). </li><li> Inciser la peau à l&#39;extrémité caudale de la cage thoracique le long de la ligne médiane (2-3 cm) et séparer le fascia recouvrant la colonne vertébrale. </li><li> Parce que la moelle épinière arrête de pousser plus tôt au cours du développement postnatal de la colonne vertébrale, segment vertébral L4 se trouve sous la première vertèbre lombaire (L1). Vertèbre L1 est situé en aval de la vertèbre qui contient la dernière paire de nervures. Identifier et dénoncer L1 vertèbre en enlevant les petits muscles spinaux et les ligaments attachés à sa surface dorsale. </li><li> Soulevez légèrement et maintenez L1 vertèbre avec une pince Adson. Utilisez une pince à laminectomie dédiés pour enlever la dorsale portion de la vertèbre (colonne vertébrale et de la lame) et exposer la moelle épinière. Éviter d&#39;endommager la moelle épinière. </li><li> Transfert de la souris sur la plaque chauffante dans le cadre stéréotaxique. Surveiller la température de la souris pendant l&#39;opération ultérieure. </li></ol> 3. Injection <ol><li> Fixer vertèbre L1 avec des pointes entaille en V. Les pointes doivent stabiliser la colonne vertébrale de sorte que la vertèbre ne se déplace pas pendant la respiration. </li><li> Apportez de la microseringue de plus près afin que la pointe de la pipette est au-dessus du site de laminectomie. Abaissez le piston jusqu&#39;à ce que vous voyez la suspension de virus sortant de la pipette. Retirer la gouttelette avec un coton-tige stérile. </li><li> Positionner la pointe de la pipette à la partie rostrale plus de la moelle épinière exposée. Centre de la pipette au-dessus du sillon médian postérieur, puis déplacez la pointe 500 um latéralement. Abaissez la pointe à la surface de la corde et à la perforation de la dure-mère ou, si vous travaillez avec une pipette en verre unbeveled, utiliser une canule en acier biseauté pour perforer la dura. Abaissez la pointe de la pipette en verre les 300 um dans la moelle épinière. </li><li> Injecter 1 ul de la suspension virale à un taux de 200 nl / min. </li><li> À la fin de l&#39;injection, attendez au moins 2 minutes avant de se rétracter lentement la pipette. </li><li> Répéter les étapes de 3,3 à 3,5 à la partie caudale plus de la moelle épinière exposée pour obtenir une distribution complète du vecteur viral dans L4 segment rachidien. Les deux points d&#39;injection sont situés rostrale et caudale du segment L4 pour éviter d&#39;endommager les tissus dans la région cible. </li></ol> 4. Fermeture des plaies <ol><li> Communiqué vertèbre L1 des pinces entaille en V et retirez la souris à partir du cadre stéréotaxique. </li><li> Suturer l&#39;aponévrose avec 5,0 vicryl. Le fascia fermé offre une couverture pour le site de laminectomie. </li><li> Fermer la peau avec des sutures de nylon ou d&#39;agrafes chirurgicales. </li></ol> 5. Soins postopératoires <ol><li> Transfert de la souris dans une cage de récupération de doux, de la literie nonparticular. Placez-le sur tIl côté pour respirer à l&#39;aise. Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit en état d&#39;alerte, ambulatoire et commence à boire. </li><li> Nous fournissons une analgésie postopératoire pendant 72 heures par jour avec des injections sous-cutanées de carprofène (5,0 mg / kg). </li><li> Surveiller le rétablissement post-opératoire par une inspection quotidienne pour les 3 premiers jours, puis tous les deux jours ou 3 jours par semaine jusqu&#39;à ce que l&#39;expérience est terminée. </li><li> Enlever les sutures ou des agrafes de 7 à 10 jours après l&#39;opération, lorsque la cicatrisation est complète. </li><li> Euthanasier l&#39;animal après la fin de l&#39;expérience. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Injection stéréotaxique vecteur de ciblage permet neurones de la moelle épinière pour des applications telles que la cartographie du réseau neuronal sur la base de virus d&#39;étalement transsynaptique 6,7 ou 8 optogenetic dissection, guidage axonal pendant la régénération de lésions 9,10, la thérapie génique ou pour la prévention ou le traitement de la neurodégénérescence 11, 12. Les vecteurs viraux ont été utilisés pour la manipulation génétique dans la moelle épinière pour ...

Les technologies de pointe de la manipulation génétique conditionnelle chez la souris permettent des approches multidimensionnelles à l&#39;exploration des voies synaptiques et les connexions fonctionnelles dans le système nerveux central. Transgènes peut être régulée par petites molécules effectrices telles que la doxycycline agissant sur ​​un transactivateur de tétracycline contrôlée, qui peut être conçu pour fonctionner comme un répresseur ou un activateur de la transcription du gène, ou le tamoxifène reconnaître une mutation de domaine de liaison au ligand du récepteur oestrogène 1 . Modification irréversible transgène est généralement obtenue par l&#39;acide désoxyribonucléique (ADN) recombinases. Cre (recombinaison causes) et Flp (enzyme de recombinaison flippase) catalyser l&#39;excision, inversion ou translocation de fragments d&#39;ADN qui sont flanquées par loxP (lieu de passage sur x, P1) ou Frt (cible de reconnaissance flippase) sites, respectivement 1. Les applications incluent l&#39;activation de gènes ou le silence et l&#39;acide inductible ribonucléique (ARN) des interférences <sup&gt; 2. Expression conditionnelle de reporters fluorescents ou enzymatiques tels que β-galactosidase ou la phosphatase alcaline peut être utilisée pour étiqueter les neurones et d&#39;examiner leur organisation locale et la connectivité 3. Projets de mutagenèse à grande échelle en Amérique du Nord ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) et en Europe ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) produisent des bibliothèques de clones embryonnaires de souris de cellules souches avec gènes cibles conditionnelles et les pièges qui finira par couvrir l&#39;ensemble du génome de la souris. Les souris issues de ces clones peuvent être croisés avec un nombre croissant de lignées de souris qui expriment recombinases ADN dans des promoteurs ou des loci spécifiques à une population particulière de neurones pour la manipulation génétique sélective ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Cependant, restreindre la manipulation génétique de populations distinctes de neurones ou des régions particulières d&#39;intérêt ne peut pas être atteint par ciblage génétique seul si un promoteur spécifique à la population de neurones d&#39;intérêt n&#39;est pas connu ou ne s&#39;exprime pas par tous les neurones de la région d&#39;intérêt. Dans la moelle épinière, des modèles expérimentaux peuvent nécessiter restriction spatiale de la manipulation génétique d&#39;une ou deux segments craniocaudale. Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral exprimant Cre ou FLP permet de limiter la recombinaison de gènes de régions dans la moelle épinière de souris dans lequel les fragments d&#39;ADN flanqués de sites FRT ou loxP, que l&#39;on appelle allèles floxé ou flrted. Contrairement réarrangement de l&#39;ADN constitutive, qui résulterait de croisements avec des animaux recombinase souris exprimant, cette stratégie permet également de contrôler temporelle sur l&#39;activation de gènes ou le silence. Les vecteurs viraux codant pour floxé ou flirté transgènes offrir une option inverse de la manipulation génétique chez les souris exprimant le corresponding en aval d&#39;un promoteur recombinase spécifique des neurones. Plusieurs vecteurs recombinants ayant une affinité pour les neurones sont disponibles 4. Haute capacité (lâche) adénovirus, virus adéno-associé, l&#39;herpès simplex virus et lentivirus sont couramment utilisés vecteurs neurotropes. Sélection du virus approprié pour une question de recherche est un élément essentiel de la conception expérimentale. Taille du transgène, l&#39;itinéraire de livraison, la spécificité de l&#39;infection des neurones par opposition aux cellules gliales, l&#39;efficacité, l&#39;infection effets secondaires inflammatoires et toxiques doivent être considérées 4. Nous décrivons ici l&#39;injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral dans la corne dorsale de la moelle épinière, une technique que nous employons pour la régulation des gènes avec sursis dans notre recherche sur la neurobiologie de la douleur. La corne dorsale reçoit influx afférents primaires de neurones somatosensoriels y compris les neurones nociceptifs. Interneurones locaux traiter l&#39;information avant de la transmettre neurones de projection dela corne dorsale du cerveau 5. On démontre l&#39;infection des neurones de la corne dorsale de la colonne vertébrale segmentaire niveau L4 avec un neurotrope recombinant virus adéno-associé (rAAV) qui exprime la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous un promoteur du cytomégalovirus constitutivement actif.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de base épinière </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Petit instrument stéréotaxique animaux </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Gaz souris de tête anesthésie titulaire </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Supports de base ajustables </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V notch pointes </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Petit système de contrôle de la température des animaux </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pince laminectomie </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (un) par SYS-MICRO4 contrôleur </td><td> World Precision Instruments </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microseringue 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> Raccord à compression RN, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Verre borosilicate capillaires </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Injection intra-parenchymateux d&#39;un vecteur viral permet la manipulation génétique conditionnel populations distinctes de neurones ou des régions particulières du système nerveux central. Nous démontrons une technique d&#39;injection stéréotaxique qui permet l&#39;expression du gène ciblé ou le silence dans la corne dorsale de la moelle épinière de souris. L&#39;intervention chirurgicale est de courte durée. Il nécessite laminectomie d&#39;une vertèbre unique, offrant pour la récupération rapide de l&#39;animal et de la motilité intacte de la colonne vertébrale. Injection contrôlée d&#39;un volume de suspension petit vecteur à faible vitesse et à l&#39;utilisation d&#39;une micro-canule avec verre biseauté minimiser la lésion tissulaire. La réponse immunitaire locale au vecteur dépend des propriétés intrinsèques du virus utilisé, dans notre expérience, il est mineure et de courte durée quand une adéno-associé recombinant virus est utilisé. Un gène rapporteur tel que le renforcement de la protéine fluorescente verte facilite la distribution spatiale de surveillance du vecteur, et l&#39;efficacité et cellulaire spécificité de la transfection.

Rendements de transfection avec succès l&#39;expression des gènes robuste neurones de la corne dorsale injecté (figure 1), épargnant la corne dorsale du côté controlatéral, la corne ventrale et les ganglions de la racine dorsale. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La transfection de neurones de la corne dorsale. (A) Expression de l&#39;EGFP rapporteur fluorescent (vert) dans la corne gauche dorsale de la moelle ...

Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l&#39;expression génique conditionnelle ou l&#39;ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une expression génique spatialement restreinte dans la moelle épinière de la souris en injectant stéréotaxiquement un vecteur viral dans le corne dorsal lombaire. La première étape de la procédure consiste à localiser et exposer les vertèbres lombaires. La deuxième étape consiste à retirer la portion dorsale de la vertèbre afin de révéler la moelle épinière.Une procédure appelée laminectomie. Ensuite, une pipette en verre reliée à une pompe microsérique est positionnée au-dessus du cornet dorsal et abaissée dans la moelle épinière. La dernière étape consiste à injecter lentement la suspension de vecteur.Deux semaines plus tard, la transfection des neurones de la corne dorsale est démontrée par l'expression de la protéine fluorescente verte, ce qui permet de suivre la distribution du virus. Cette méthode aide à élucider la fonction des neurones dans certaines voies sensorielles. Nous l'utilisons dans des études portant spécifiquement sur le développement de la douleur inflammatoire ou neuropathique.La démonstration visuelle est essentielle pour apprendre à positionner correctement la souris dans le cadre stéréotaxique. Il est cruci

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Source : Porlan, E., et al. Modification génétique stable et efficace des cellules de la souris adulte V-SVZ pour l’analyse des effets autonomes et non autonomes des cellules souches neurales. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre la modification génétique stable des cellules souches neurales (CSN) dans la zone ventriculaire-sous-ventriculaire (V-SVZ) par injection stéréotaxique d’un gène thérapeutique porteur du virus dans un modèle murin. Le virus pénètre dans les CSN, subit une...

Injection stéréotaxique de virus pour une modification génétique stable dans un modèle murin

Source : Chen, S., et al., Chirurgie stéréotaxique pour la manipulation génétique dans les cellules striales des cerveaux de souris néonatales. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique d’un vecteur viral codant pour la Cre recombinase et la protéine de fluorescence verte ou GFP dans le striatum d’un chiot de souris génétiquement modifié pour réaliser une manipulation génique en excisant une cassette STOP flanquée de loxP, activant la protéine de fluorescence rouge ou...

Micro-injection stéréotaxique d’un vecteur viral pour la manipulation de gènes chez un striatum de bébé souris

Source : Tadokoro, T., et al. Administration du vecteur du virus adéno-associé sous-pial 9 (AAV9) chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre une technique d’injection sous-piale pour l’administration de gènes à la moelle épinière chez la souris. La procédure consiste à exposer la dure-mère, à perforer la pie-mère et à injecter un virus adéno-associé recombinant (rAAV) portant un gène exprimant une protéine fluorescente dans l’espace sous-pial. Après l’injection et la...

Livraison de gènes sous-piaux dans la moelle épinière de souris pour évaluer l’expression des gènes

Source : Pereira, M. et. al., In vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique d’un virus adéno-associé dans le cortex cérébral d’une souris transgénique pour délivrer des gènes de reprogrammation neuronale et de rapporteur fluorescent dépendants de Cre dans les cellules gliales.

Injection stéréotaxique de vecteurs viraux pour la reprogrammation des cellules gliales dans un modèle murin

Source : Fricano-Kugler, C. J., et al. Conception, emballage et administration de CRISPR retro et de lentivirus à titre élevé par injection stéréotaxique. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’injection virale stéréotaxique pour une édition précise des gènes neuronaux dans le cerveau de la souris. Le protocole garantit une livraison précise du virus au gyrus denté, permettant le marquage fluorescent et l’inactivation de gènes médiée par CRISPR pour étudier les circuits neuronaux, la...

Injection virale stéréotaxique pour l’édition de gènes neuronaux ciblés dans le cerveau de souris

Source : Li, D., et al. Injection intrathécale directe de virus adéno-associés recombinants chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’injection intrathécale de virus adéno-associés (AAV) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) d’une souris éveillée, couvrant la préparation de la seringue, l’alignement de la colonne vertébrale et l’insertion précise de l’aiguille. Cette méthode valide l’administration ciblée de gènes, soutenant ainsi son potentiel pour les...

Administration intrathécale de virus dans un modèle murin pour le traitement de maladies du système nerveux central

Le système / cas9 CRISPR offre la possibilité de faire éditer génome ciblé accessible et abordable pour la communauté scientifique. Ce protocole vise à démontrer comment créer des virus qui Knockout un gène d'intérêt en utilisant le système / cas9 CRISPR, puis les injecter stéréotaxique dans le cerveau de souris adulte.

Design et emballage, et de livraison de titre élevé CRISPR Retro et lentivirus via stéréotaxique Injection

Intrarachidienne de recombinase dépendant adeno-associated virus recombinant (rAAV) peut être utilisée pour manipuler n’importe quel type de cellules génétiquement marquées dans la moelle épinière. Ici, nous décrivons comment transmettre des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire. Cette technique permet d’interrogatoire fonctionnelle du sous-type neurone manipulé.

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral marqués transportable dans les tissus de la moelle épinière de rat. Le vecteur est absorbé au niveau de la synapse et transporté vers le corps cellulaire des neurones de la cible. Ce modèle convient pour un traçage rétrograde des voies importantes de la colonne vertébrale ou ciblage des cellules pour des applications de la thérapie génique.

Injection directe d’un vecteur Lentiviral met en évidence plusieurs voies motrices de la moelle épinière de Rat

Ce protocole démontre une nouvelle méthode d’application de thérapies géniques à des sous-populations de cellules chez des rats néonatals âgés de 5 à 10 jours après la naissance en injectant un modificateur chimiogénétique antérograde dans le cortex somatomoteur et une Cre recombinase rétrogradablement transportable dans la moelle épinière cervicale.

Cibler le tractus corticospinal chez les rats néonatals avec un vecteur double viral à l’aide d’une chirurgie combinée du cerveau et de la colonne vertébrale

Une injection intrathécale lombaire représente une voie d’administration pertinente sur le plan translationnel pour l’administration de la thérapie génique au système nerveux central. Ce protocole standardisé complet pour les injections intrathécales lombaires chez les souris et les rats néonatals, juvéniles et adultes vise à guider les chercheurs dans l’adoption de cette technique pour les études précliniques de thérapie génique.

Injection intrathécale lombaire de vecteurs de thérapie génique pour le ciblage du système nerveux central chez la souris et le rat

Découvrez l'injection stéréotaxique d'un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris. Cette méthode permet une expression génique ciblée dans la corne dorsale lombaire.

Injection stéréotaxique d'un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

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