Name: Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée dun siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Découvrez l'inhibition à long terme d'ITSN-1s dans les poumons de souris par livraison répétée de siRNA via des liposomes cationiques. Cette méthode sûre et reproductible réduit les niveaux d'ARNm et de protéines de 75%.

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Ce travail a été financé par l&#39;Institut national de la santé Subventions R01HL089462 à SP.

1. Préparation des liposomes cationiques <ol><li> Autoclave un ballon propre à être utilisé pour la préparation lipososmes. </li><li> Préparer des solutions de: <ol class="lalpha"><li> - Dissoudre 200 mg de bromure de diméthyl ammonium dioctadecyl (Doab) dans 10 ml de chloroforme en utilisant une petite bouteille en verre. </li><li> - Dissoudre 200 mg de cholestérol dans 10 ml de chloroforme en utilisant une petite bouteille en verre. </li><li> - Préparer et passer à l&#39;autoclave pour stériliser les 5% de glucose dans 100 ml d&#39;ARN / ADN-ase eau distillée libre. </li></ol></li><li> Rincer le ballon avec du chloroforme. Ajouter 5-10 ml dans le flacon, tourbillon, et laisser reposer pendant quelques minutes. Gardez le flacon recouvert d&#39;une feuille d&#39;aluminium à tout moment. Vider le chloroforme du ballon. </li><li> Préparation de liposomes: <ol class="lalpha"><li> - Ajouter 315 ul de la solution mère Doab au ballon rond. </li><li> - Ajouter 200 pi de solution de cholestérol dans le ballon. </li><li> - Ajouter 9,5 ml de chloroforme à la fiolend mélanger par tourbillonnement. </li></ol></li><li> Réglez le rotovapeur à 37 ° C, 100 rotations par minute (rpm) ou plus (100-120 rpm). L&#39;évaporateur rotatif doit être connectée à une commande de vide de pompe à eau avec un tube d&#39;aspiration fixé correctement. </li><li> Connectez le réservoir de gaz argon et l&#39;évaporateur rotatif. </li><li> Fixer le ballon à l&#39;évaporateur rotatif et ajuster les réglages optimaux avant de descendre dans le bain d&#39;eau. Ouvrez la première vanne pour l&#39;argon complètement en tournant dans le sens antihoraire. Toujours ouvrir et fermer cette vanne premier. La seconde soupape commande la pression d&#39;argon de soufflage dans le ballon. La pression doit être toujours douce. </li><li> Abaisser le rotovapeur dans le bain d&#39;eau, assez pour le flacon toucher l&#39;eau sans être complètement submergé et allumez la vitesse. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que tous les chloroforme s&#39;évapore, environ 10 min. Ensuite arrêter la machine. </li><li> Éteignez la vitesse de rotovapeur et les robinets du réservoir d&#39;argon. Maintenant, le flacon doit être supprimée. </li><li> Ajouter 2 ml de glucose à 5% pour ee ballon pour dissoudre les lipides. </li><li> Rayer le fond du flacon à fond en utilisant une pointe de pipette ml pour dissoudre tous les lipides. Après grattage, enlever tout reste de lipides à partir de la pointe de 1 ml dans le flacon, le cas échéant, avec une deuxième extrémité. </li><li> Incuber la solution obtenue à 42 ° C au bain d&#39;eau tout en tourbillonnant lentement (15 min) dans le ballon. </li><li> Remplir la cuve d&#39;ultrasons avec de l&#39;eau froide. Soniquer la solution pendant au moins 20-30 minutes avec le ballon tenu et le bas juste à peine toucher l&#39;eau. </li><li> Chauffer le ballon dans un bain d&#39;eau de l&#39;évaporateur rotatif pendant 20 min à 42 ° C, à la vitesse zéro, avec le fond rond immergé dans l&#39;eau, cette fois. </li><li> Filtrer les liposomes à travers un 0,47 micron et par la suite, 0,22 micron filtres seringue. </li><li> Utilisation d&#39;une petite extrudeuse, filtrer les liposomes à travers une membrane de 50 nm pour générer une population homogène de vésicules de liposomes unilamellaires. </li><li> Transférer les liposomes dans un tube Eppendorf et le placer sur la glace. </li></ol><html> 2. Préparer les liposomes: siRNA-ITSN-1 Complexes <ol><li> Reprendre le sur-cible souris siRNA ITSN dans un tampon de siRNA contenant HEPES 20 mM et du chlorure de sodium 150 mM, pH 7,4, à une concentration finale de 2 pg / pl. Gardez-le sur la glace avant de les mélanger. </li><li> Préparer les liposomes: complexes ITSN de siRNA à un ratio de 8 liposomes nmol: 2 ug d&#39;ARN (ou 400 nmol liposomes: 100 ug siRNA ITSN). Dans la présente étude, nous avons ajouté 50 pi de ITSN de siRNA à partir de la solution mère (50 M) à 100 pi de liposomes fraîchement préparés en utilisant un ARN / ADN-ase tube Eppendorf libre. Notez que la concentration de ITSN de siRNA est très important car un maximum de 150 pi de mélange peut être injecté bilatéralement et rétro-orbitaires chez la souris en même temps. </li><li> Gardez le mélange sur la glace en attendant d&#39;injecter des souris. </li></ol> 3. Souris rétro-orbitaire injection dans la veine (angle interne de l&#39;orbite) jove_content &quot;&gt; Toutes les expériences de souris ont été arrêtés et exécutés en conformité avec les directives du Rush University Institutional Animal Care et Use Committee. <ol><li> Anesthésier la souris par injection intra-péritonéale d&#39;un mg / kg de kétamine 50 corps de poids et de 5 mg / kg de poids corporel xylazine (mélange disponible dans le commerce). Selon le poids de l&#39;animal et de l&#39;âge, de régler le volume des anesthésiques et de concentration. Les souris utilisées dans les souris de l&#39;étude sont des souris CD1 mâles, âgées de 6-8 semaines et pèse environ 25 grammes. Les seringues sont tuberculine 1 ml Type avec l&#39;aiguille fixée. </li><li> Tenir des oreilles de souris avec une main et tourner la souris enfoncé sur un côté pour exposer l&#39;angle interne de l&#39;œil. But médiale à la plica semilunaris; éviter de toucher le globe oculaire. </li><li> Approchez-vous des caruncle lacrymales de l&#39;oeil tenant la seringue contenant le mélange à un angle de 45 degrés dans les trois axes. </li><li> Injecter lentement le mélange et laissez la souris pour récupérer le côté injecté vers le haut. Si une grande liquideformes de gouttelettes sur le lieu d&#39;insertion de l&#39;aiguille, l&#39;aiguille se rétractent, aspiration arrière de la goutte dans la seringue et essayez à nouveau. Des injections répétées sont mieux fait en alternant les yeux, pour permettre la récupération parfaite. En cas de doute, cette technique peut être vérifiée en injectant un colorant bleu (50 pi, 0,5% de cristal violet dans le méthanol) et en exposant les poumons de souris pour observer la vascularisation bleu. </li><li> Les souris dans cette étude ont été injectés chaque 3 ème jour pendant 3 semaines sans décès ou les effets indésirables. </li></ol> 4. Souris perfusion du poumon et collection de tissus pour les études biochimiques <ol start="0"><li> Régler la pompe péristaltique pour fonctionner à 1,5 ml / min. </li><li> Préparer le réglage: ventilateur, table d&#39;opération, les instruments, des cotons-tiges stériles, des cotons tiges, cordes, gobelets, eau distillée, sel équilibrée de Hank, traceur. </li><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale du mélange anesthésique (100 mg / kg de kétamine corps de poids et de 10 mg / kg de poids corporel xylazine de poids). </li&gt; <li> Au niveau de la nuque, enlever les glandes salivaires et d&#39;exposer la trachée. </li><li> Commencez par laparotomie, l&#39;excision de la membrane, et suivre avec thoracotomie, exposant les poumons et le coeur. </li><li> Retirez le thymus. </li><li> Utilisation de la microscopie optique pour une meilleure précision, cathétérisme de l&#39;artère pulmonaire. </li><li> Avez-trachéotomie et intuber la souris en utilisant la trachéotomie. Réglez le ventilateur à une vitesse de 150 coups / min et le volume systolique de 150 pi. </li><li> En sortie, ouvrez l&#39;oreillette gauche. </li><li> Perfuser le système vasculaire pulmonaire de souris sans sang pendant 5 min, à l&#39;aide de la pompe péristaltique et la solution de Hank réchauffé à 37 ° C. </li><li> Perfuser le traceur (8 nm d&#39;or-albumine 16) pour supplémentaire de 10 min à la même vitesse d&#39;écoulement. </li><li> Rincer le traceur non lié par 5 perfusion du poumon min avec une solution de Hank. </li><li> Suivre avec la fixation in situ dans les poumons de 10 min perfusion de 4% (poids / volume) de formaldéhyde, 2,5% de glutaraldéhyde, l&#39;acide tannique et de 1% à 0,1 PIPEStampon, pH 7,2. </li><li> Recueillir les poumons, enlever le tissu excessive, couper des petits blocs (3/3 mm), et les placer dans une fiole à scintillation marqué contenant 2 ml de mélange fixateur. </li></ol> Les souris vont expirer complètement anesthésié pendant la procédure. 5. Souris traitement du tissu pulmonaire pour EM <ol><li> Préparer des solutions de 1% Palade OSO4, acétate veronal, et le tampon Kellenberger. <ol class="lalpha"><li> - Mémoire tampon Palade-OSO4 ​​1% contient: 1 ml d&#39;acétate d&#39;actions veronal, 1,25 ml 4% OSO4, 1 ml d&#39;acide chlorhydrique 0,1 N et de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à 5 ml de volume final. </li><li> - Solution stock veronal d&#39;acétate est obtenue par dissolution de 1,15 g de sodium andydrous d&#39;acétate et 2,94 g barbiturique dans 100 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Solution Kellenberger contient 2 ml d&#39;acétate d&#39;actions veronal, 2,8 ml d&#39;acide chlorhydrique 0,1 N, 0,05 g d&#39;acétate d&#39;uranyle et de 5,1 mlde l&#39;eau distillée, à pH = 6. </li></ol></li><li> Laver les blocs du poumon chez 0,1 M cacodylate de sodium, pH = 7,4, brièvement 3 fois. </li><li> Fixer les échantillons dans les 4% (poids / volume) de formaldéhyde, 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon 0,1 PIPES, pH 7,2, pendant 1 heure, à température ambiante. </li><li> Post-fixer avec 1% Palade-Osmium pendant 1 h dans la hotte, sur la glace, dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer une fois avec un tampon Kellenberger. </li><li> Incuber les échantillons dans un tampon Kellenberger pendant 2 heures ou toute la nuit, à la température ambiante. </li><li> Rincer une fois dans l&#39;éthanol à 50%. </li><li> Déshydrater avec la série graduée de l&#39;éthanol, 5 min / chacun: 70%, 95%, puis 2 x 15 min de l&#39;éthanol à 100%. </li><li> Mettez à 100% d&#39;oxyde de propylène, 2 x 15 min. </li><li> Éliminer l&#39;oxyde de propylène et d&#39;ajouter un mélange de 50% d&#39;oxyde de propylène et 50% Epon 812, incuber pendant la nuit, tournant sur une roue, à la température ambiante. </li><li> Le lendemain matin, retirez le mélange et ajouter frais Epon 812, au moins pour 4-5 heures sur le volant. </li><li> En utilisant des moules coniques doublé, remplisà mi-chemin avec des produits frais 100% Epon 812, ajouter les échantillons sélectionnés et les placer sur les bords. </li><li> Déplacez les moules à l&#39;ensemble incubateur à 60 ° C et laissez-les durcir pendant 48-72 h. </li><li> Lorsque polymérisé, envoyer les blocs d&#39;être mince (60-70 nm d&#39;épaisseur) sectionnés. </li></ol>

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<li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260(2009).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li>
<li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li>
<li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dap160%2Fintersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li>
<li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Basé sur des études précédentes publiées par d&#39;autres 9 et nous 1, 18 nous avons développé cette méthodologie pour le long terme abattre des ITSN-1 in vivo par administration intraveineuse répétée (toutes les 72 h, pendant 24 jours consécutifs) de siRNA spécifique / complexes de liposomes. Cette approche expérimentale est efficace, peut être utilisé en toute sécurité et de façon répétée et il peut être facilement étendu pour étudier l&#39;implication d&#39;un gène codant pour une proté...

SiARN nu ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire, étant chargé négativement, et il est facilement dégradés par les enzymes dans le sang, les tissus et les cellules. Même avec des modifications structurales récemment d&#39;améliorer la stabilité, l&#39;accumulation de siRNA au niveau du site cible après administration est extrêmement faible et nécessite un véhicule intracellulaire efficace 5. Les liposomes cationiques sont apparus comme sûrs acides nucléiques transporteurs ayant le potentiel de transférer de gros morceaux d&#39;ADN / ARN dans les cellules par encapsulation et la protection des acides nucléiques à partir de la dégradation enzymatique 6. En outre, les liposomes cationiques interagissent spontanément avec l&#39;ADN / ARN, favorisant ainsi le transfert de gènes dans les cellules 2. Plus récemment liposomes ont été appliquées à l&#39;administration de vaccins et de médicaments à faible poids moléculaire 7. Livraison liposomale de microRNA-7 plasmide exprimant surmonte facteur de croissance épidermique récepteur tyrosine kinase inhibiteur de la résistance dans les cellules de cancer du poumon 8. Lorsque vous ciblez l&#39;endothélium vasculaire, l&#39;administration par voie intraveineuse est essentielle parce que les complexes sont peu susceptibles de traverser la barrière endothéliale et s&#39;extravaser dans le tissu interstitiel 9. En comparaison à d&#39;autres organes, ECS de la microvascularisation du poumon ont le plus l&#39;absorption et avidement internaliser liposome cationique et complexes ADN / ARN, suivie par les ganglions lymphatiques et les plaques de Peyer 9. Administration intraveineuse dans des modèles rongeurs de siRNA via injections veine rétro-orbitaires ou la queue a été prouvé inoffensif, même à des concentrations élevées, telles que 50 mg / kg 10. Dans la littérature publiée de la composition de liposomes cationiques est différente, sur la base de la formulation de lipides et de leur rapport équimolaire 11, 12. Il existe un large éventail d&#39;applications potentielles en utilisant des liposomes cationiques pour la livraison de gènes in vivo, si le ciblage down-regulation/over-expression des protéines, la livraison des vaccins ou des thérapies anti-tumorales 13-15. Important de se rappelerest que l&#39;efficacité de l&#39;interaction de la membrane l&#39;ADN / ARN cellulaire est régulée par la forme de couplage entre les complexes générés et les lipides membranaires. Ceci suggère que l&#39;adaptation de la composition des lipides aux profils ciblés de la membrane cellulaire peut être bénéfique et entraîner des taux élevés de transfection dans un type cellulaire particulier 6.

<table><tbody><tr><td>Bromure de diméthyldioctadécylammonium (DOAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2779</td><td></td></tr><tr><td>Stabilisateur LiposoFast (mini-extrudeur)</td><td>Avestin Inc.</td><td>LF-STB</td><td></td></tr><tr><td>Membrane en polycarbonate, 19 mm de diamètre, pores de 50 nm</td><td>Avestin Inc.</td><td>LFM-50</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4432-04</td><td></td></tr><tr><td>Sels équilibrés de Hank</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td></td></tr><tr><td>Fiole à fond rond</td><td>Fisher Scientific</td><td>FHB-275-030X</td><td></td></tr><tr><td>SiRNAITSN - sur cible </td><td>Dharmacon/ ThermoScientific</td><td>J-046912-11</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Ismatec</td><td>REGLO-CDF numérique avec tête de</td><td></td>pompe RHOO</tr><tr><td>Ventilateur</td><td>Hugo Sachs Electronik</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0500</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Epon812</td><td>EM Sciences</td><td>Produit arrêté par le fabricant</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de propylène</td><td>EM Sciences</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Moules d’enrobage</td><td>EM Sciences</td><td>69923-05</td><td></td></tr><tr><td>Acide tannique</td><td>EM Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>Traceur or-albumine 8 nm</td><td>Préparé en laboratoire comme dans16</td><td></td><td colspan="4">Comments<td colspan="4">Equipé de 2 Avestin 1 ml <td></td></tr><tr></td></tr><tr> seringues étanches aux gaz (cat. # LF-1)</td></tr><tr><td colspan="4">Pyrex, 100 ml</td></tr><tr><td colspan="4">SibARN modifié, in vivo</td></tr><tr><td colspan="4">Fait partie d’IDEX corp.</td></tr><tr><td colspan="4">D-79232 Mars, Allemagne</td></tr><tr><td colspan="4">Remplacé par Embed812, cat. # 14120</td></tr></tbody></table>

taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d&#39;un sirna spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Des études antérieures ont montré que knockdown de ITSN-1 (KD ITSN), une protéine endocytose impliqué dans la régulation du poumon perméabilité vasculaire et les cellules endothéliales () la survie, la mort cellulaire par apoptose induite, un obstacle majeur au développement d&#39;un système de culture cellulaire avec prolongée ITSN-1s une inhibition. Utilisant des liposomes cationiques comme porteurs, nous avons exploré le silence des gènes ITSN-1 dans les poumons de souris par l&#39;administration systémique de siRNA ciblant ITSN-1 gène (ITSN de siRNA). Les liposomes cationiques offrent plusieurs avantages pour la livraison de siRNA: coffre-fort avec des doses répétées, non immunogène, non toxique et facile à produire 2. performance des liposomes et l&#39;activité biologique dépend de leur taille, la charge, lipides composition, la stabilité, la dose et la voie d&#39;administration 3 Ici, efficace et ITSN KD spécifique dans les poumons de souris a été obtenu en utilisant une combinaison de bromure d&#39;ammonium dioctadecyl cholestérol et de diméthyle. Administration intraveineusede ITSN de siRNA / complexes liposome cationique transitoire renversé protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm dans les poumons de souris au jour 3, qui a récupéré après 3 jours supplémentaires. Profitant des liposomes cationiques comme un transporteur sûr reproductible, l&#39;étude prolongée de 24 jours. Ainsi, le traitement rétro-orbital avec des complexes fraîchement générés a été administrée tous les 3 jours, induisant soutenue ITSN KD tout au long de l&#39;étude 4. tissus de souris recueillies en plusieurs points du temps post-siRNA ITSN ont été soumis à des analyses en microscopie électronique (EM) pour évaluer les effets de la chronique KD ITSN, dans l&#39;endothélium pulmonaire. Imagerie EM à haute résolution nous a permis d&#39;évaluer les changements morphologiques causés par KDITSN dans le lit vasculaire pulmonaire (c. rupture de la barrière endothéliale, le nombre de cavéoles et la régulation positive des voies alternatives de transport a diminué), les caractéristiques non détectables par microscopie optique. Globalement, ces résultats ont établi un importantTANT rôle de ITSN-1 dans la fonction EC et l&#39;homéostasie du poumon, tout en illustrant l&#39;efficacité de la livraison de siRNA-liposomes in vivo.

Taux de protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm ont été contrôlés à plusieurs points de temps après la livraison de siRNA ITSN par Western blot et PCR classique et quantitative en 4. Taux de protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm dans les poumons siRNA ITSN traités souris étaient environ 75% plus faible par rapport aux contrôles pendant knockdown continue de ITSN-1 pendant 21 jours. Sans ITSN-1s, dynamin-2, un premier partenaire d&#39;interaction du lecteur ITSN-1 et essentiel dans le détachem...

Des injections répétées rétro-orbitaires de complexes cationiques liposomes/siRNA/ITSN-1s chez la souris, toutes les 72 heures pendant 24 jours, fournir efficacement le duplex de siRNA à la microvascularisation pulmonaire de la souris réduire ARNm ITSN-1 et l&#39;expression des protéines de 75%. Cette technique est hautement reproductible dans un modèle animal, n&#39;a pas d&#39;effets indésirables et évite les accidents mortels.

Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d&#39;un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer les effets d'une inhibition à long terme de l'expression d'intersectine 1 sur la structure et la fonction des poumons de souris. Cette inhibition est obtenue en préparant tout d'abord des complexes spécifiques de liposomes duplex INA afin de cibler la vascularisation pulmonaire de la souris dans une deuxième étape. Les complexes de liposomes INA sont administrés par injection rétro-orbitaire, répétée toutes les 72 heures pendant 24 jours consécutifs, afin d'assurer une inhibition efficace de l'expression d'intersectine 1S.Ensuite, le tissu pulmonaire de souris injectées est prélevé pour des analyses biochimiques et des examens en microscopie électronique afin d'évaluer les niveaux de la protéine et de l'ARNm d'intersectine-1 et d'effectuer des analyses morphologiques approfondies des poumons. Les résultats obtenus par immunotransfert sur des lysats pulmonaires à l'aide d'anticorps spécifiques dirigés contre l'intersectine-1 et par analyses de RT-qPCR montrent une inhibition spécifique et efficace de l'intersectine-1 pendant 24 jours consécutifs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodologies existantes, telles que les polymères ou les lentivirus, réside dans le fait que l'administration pulmonaire de liposomes oniques est reproductible, sûre, non toxique et hautement efficace au niveau de l'endothélium pulmonaire.L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous avons décidé d'évaluer les effets de l'intersection de N vers le bas in vivo, et lorsque d'autres méthodes de livraison d'ARNi n'ont pas fonctionné. Pour préparer les liposomes oniques, ajoutez 315 microlitres d'une solution mère de bromure de diméthyl dioctadécyl ammonium, ou DOAB, dans un ballon à fond rond, puis 200 microlitres de solution mère de cholestérol et 9,5 millilitres de chloroforme, en mélangeant par agitation douce. Fixez le ballon au rotavapor réglé à 37 degrés Celsius et à 100 tours par minute ou plus.Ouvrez complètement la première vanne pour l'argon en la tournant dans le sens horaire. Ouvrez et fermez toujours cette vanne en premier. La deuxième vanne régule la pression de l'argon soufflé dans le ballon.Ouvrez-le partiellement pour assurer une pression douce. Une fois que la glace sèche commence à couler sur le tube reliant le réservoir de gaz d'Argonne au rotavapor, abaissez le rotavapor dans le bain d'eau jusqu'à ce que le ballon touche l'eau sans être complètement immergé. Réglez le bouton de vitesse à 100 à 120 tr/min. Lorsque tout le chloroforme contenu dans le ballon s'est évaporé, arrêtez l'appareil.Régler la vitesse du rotavapor sur zéro et fermer les vannes du réservoir d'argon. Retirer le flacon. Ajouter deux millilitres d'une solution de glucose à 5 % dans le flacon pour resuspendre les lipides.À l’aide d’une pipette d’un millilitre, gratter soigneusement le fond du flacon afin de dissoudre tous les lipides. Incuber la solution obtenue dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant une heure tout en vortexant lentement le flacon. Soniquer la solution pendant au moins 20 à 30 minutes, en tenant le flacon verticalement et en plaçant son fond légèrement en contact avec l’eau froide du bain à ultrasons.Ensuite, chauffer le ballon dans le bain d'eau du rotavapor pendant 20 minutes à 42 degrés Celsius à vitesse nulle, le fond rond étant immergé dans l'eau. Filtrer les liposomes à l'aide d'un filtre à seringue de 0,47 micron, suivi d'un filtre à seringue de 0,22 micron. À l'aide d'un petit extrudeur, filtrer les liposomes à travers une membrane de 50 nanomètres afin d'obtenir une population homogène de vésicules liposomiques unilamellaires.Transférez les liposomes dans un tube Eppendorf et placez-les sur de la glace. Préparez les complexes ARN-liposomes ITSN selon un rapport de huit moles de liposomes pour deux microgrammes d'ARN. Dans cet exemple, 50 microlitres de I-A-I-T-S-N.À partir d'une solution mère de 50 micromolaire, on ajoute 100 microlitres de liposomes fraîchement préparés en utilisant un tube EOR exempt de A-R-N-A-D-N-A. Conserver le mélange sur de la glace jusqu'à l'injection chez les souris. Les souris utilisées dans cette étude ont environ quatre à six semaines et pèsent environ 25 grammes.Confirmez par une pincée du orteil que l'animal est complètement anesthésié avant l'injection. Les seringues utilisées sont des seringues tuberculiniques d'un millilitre avec l'aiguille fixée d'une seule main. Tenez les oreilles de la souris et retournez-la sur le côté afin d'exposer l'angle interne de l'œil.Viser médialement par rapport aux PIKA semi-lunaires et éviter de toucher le globe oculaire. Approcher le caroncule lacrymal de l'œil avec la seringue chargée selon un angle de 45 degrés sur les trois axes. Injecter lentement le mélange, replacer la souris dans sa cage et lui permettre de se remettre du côté injecté.Haut. La souris reçoit un traitement par ARNi ciblant le gène ITSN1 toutes les 72 heures pendant 24 jours. Pour commencer cette procédure, vérifiez que la souris est complètement anesthésiée en l'absence du réflexe de retrait. Effectuez une laparotomie et excisez le diaphragme.Ensuite, réalisez une thoracotomie afin d'exposer les poumons et le cœur. Retirez le thymus à l'aide d'un microscope StereoZoom pour une meilleure précision. Cathétérisez l'artère pulmonaire.Ensuite, réalisez une trachéotomie et intubez la souris en utilisant la stomie trachéale. Réglez le ventilateur sur une fréquence de 150 mouvements par minute et un volume courant de 150 microlitres. En tant qu'orifice de sortie, ouvrez l'oreillette gauche à l'aide d'une pompe péristaltique réglée à 1,5 millilitre par minute et d'une solution de Hank réchauffée à 37 degrés Celsius.Parcourez la vascularisation pulmonaire de la souris sans sang pendant cinq minutes, suivie d'une perfusion avec le traceur pendant 10 minutes. Après avoir éliminé le traceur non lié, effectuez une fixation in situ des poumons par une perfusion de 10 minutes avec du formaldéhyde à 4 %, du glutaraldéhyde à 2,5 % et de l'acide tannique à 1 %. Prélevez les poumons et retirez les tissus excédentaires.Découper les poumons en petits blocs et les transférer dans un flacon de scintillation étiqueté contenant deux millilitres d'un mélange fixateur. Pour commencer le traitement du tissu pulmonaire en microscopie électronique, laver brièvement les blocs pulmonaires trois fois dans du tampon au citrate de sodium 0,1 molaire.Ensuite, fixer les échantillons dans un mélange d'aldéhyde 4 % et de glutaraldéhyde 2,5 % dans un tampon Pipee 0,1 M pendant une heure à température ambiante, puis effectuer une post-fixation avec 1 % d'osmium tétraoxyde pendant une heure dans la hotte, sur de la glace et à l'abri de la lumière, après un rinçage avec le tampon Callen burger. Incuber les échantillons dans le tampon Callen burger pendant deux heures à toute la nuit à température ambiante. Rincer une fois dans de l'éthanol 50 %, puis déshydrater à l’aide d’une série progressive d’éthanol.70 % d'éthanol pendant cinq minutes, 95 % d'éthanol pendant cinq minutes, puis deux fois dans de l'éthanol à 100 % pendant 15 minutes chacun. Ensuite, passez à l'oxyde de propylène à 100 %. Deux incubations de 15 minutes chacune.Retirer l'oxyde de propylène et ajouter un mélange contenant 50 % d'oxyde de propylène et 50 % d'epon. Incuber toute la nuit en agitant par rotation sur une roue à température ambiante. Le lendemain matin, retirer le mélange et ajouter de l'epon frais. Agiter par rotation sur une roue pendant au moins quatre à cinq heures.Ajouter les spécimens sélectionnés dans des moules à double affinement remplis à moitié avec de l’Epon 100 % frais huit 12. Les placer sur les bords, transférer les moules dans un incubateur à 60 degrés Celsius et laisser polymériser pendant 48 à 72 heures. L'inhibition chronique de l'expression de ITSN un s pendant 21 jours consécutifs par administration répétée de complexes de liposomes d'ARNi contre ITSN un s entraîne des niveaux significativement plus faibles de la protéine ITSN un dans les poumons de souris, comme le montrent ces résultats représentatifs : des lysats pulmonaires provenant d’un témoin non traité et de souris traitées ont été transférés sur membrane et révélés avec des anticorps dirigés contre ITSN un et l’actine à plusieurs points temporels après l’administration d’ARNi, comme indiqué.L'analyse densitométrique de films CL représentatifs à signal élevé et l'analyse quantitative RT-PCR du ARNm d'ITSN1s confirment davantage que le traitement par des complexes de liposomes d'ARNsi ciblant ITSN1s régule efficacement à la baisse la protéine ITSN1s dans les poumons de souris. La diminution des niveaux d'intersectine 1 conduit à un endocytose déficient, à une perturbation du transport endothélial, à une altération de la barrière interendothéliale et à un œdème pulmonaire. Ces micrographies électroniques représentatives de tissu pulmonaire montrent des jonctions interendothéliales ou JIE ouvertes, marquées sur toute leur longueur par des particules d'albumine-or de huit nanomètres.Le panneau A1 est un agrandissement du panneau A ; les flèches indiquent trois à quatre particules d'albumine marquées à l'or situées à proximité les unes des autres dans le même plan, ce qui suggère l'ouverture étendue de l'IEJ. Des particules d'or sont également associées à la sortie abluminale des IJ, indiquée par les flèches sur les panneaux A1 et B. On observe également le nombre limité de CVE A et la dilatation de l'espace péricapillaire, indiquée par l'astérisque dans le panneau A. Une régulation à la baisse aiguë de l'expression de l'intersectine 1 entraîne une activation compensatoire de voies de transport alternatives pour pallier l'endocytose déficiente.Ces images de ME montrent des anneaux membranaires dans les panneaux A et A', des tubules pleomorphes dans le panneau B et des endosomes agrandis fusionnés avec des cve LA typiques dans le panneau C, activement impliqués dans l'absorption et le transport de l'albumine marquée à l'or. Une dilatation sévère de l'espace périvasculaire et un œdème protéique sont également observés. Une inhibition prolongée de l'expression de l'intersectine pendant 24 jours réduit l'œdème pulmonaire chez la souris en restaurant partiellement l'intégrité de la barrière inter-endothéliale.Les études morphologiques en microscopie électronique ont montré que le traceur d'albumine marqué à l'or de huit nanomètres ne pouvait pas pénétrer l'IEJ à ce moment précis, et formait plutôt des résidus de filtration à l'orifice luminal de la jonction, indiqués par la flèche. Toutefois, les espaces péri-vasculaires ou PVS présentaient une certaine dilatation et un œdème léger, suggérant que les jonctions sont imperméables à des particules de cette taille, mais que des corps multivésiculaires ou MVB, situés à proximité de la membrane plasmique et présentant une certaine fuite, possèdent certains de leurs petits vésicules internes marqués par des particules d'albumine d'or de huit nanomètres. Ce tableau indique le nombre de structures transcytotiques endocytiques dans les cellules endothéliales pulmonaires de souris contrôles et déficientes.Une découverte importante est la diminution des cavées dans l'endothélium pulmonaire de souris déficientes en ITSN1. L'inhibition chronique de l'expression d'intersectine 1 a entraîné l'activation de voies cytoplasmiques endocytiques alternatives et une réduction partielle du nombre de cavées, ainsi que du nombre d'anneaux ou de tubules membranaires marqués par des particules d'albumine dorée. Dans l'endothélium pulmonaire de souris déficientes chroniquement en ITSN1, le nombre de ces structures a également augmenté de 14 fois par rapport aux témoins.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme celle utilisant Eliza appliquée à des lysats de poumon de souris, peuvent être réalisées afin d'estimer quantitativement le transport transendothélial de différents traceurs hnic. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de délivrer spécifiquement des complexes de liposomes oniques et de SRNA à l'endothélium pulmonaire de souris afin d'induire l'extinction du gène codant pour la protéine d'intérêt et d'évaluer sa fonction.

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Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée dun siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique (Vidéo) | JoVE Journal

Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d'un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

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