Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d'un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer les effets d'une inhibition à long terme de l'expression d'intersectine 1 sur la structure et la fonction des poumons de souris. Cette inhibition est obtenue en préparant tout d'abord des complexes spécifiques de liposomes duplex INA afin de cibler la vascularisation pulmonaire de la souris dans une deuxième étape. Les complexes de liposomes INA sont administrés par injection rétro-orbitaire, répétée toutes les 72 heures pendant 24 jours consécutifs, afin d'assurer une inhibition efficace de l'expression d'intersectine 1S.

Ensuite, le tissu pulmonaire de souris injectées est prélevé pour des analyses biochimiques et des examens en microscopie électronique afin d'évaluer les niveaux de la protéine et de l'ARNm d'intersectine-1 et d'effectuer des analyses morphologiques approfondies des poumons. Les résultats obtenus par immunotransfert sur des lysats pulmonaires à l'aide d'anticorps spécifiques dirigés contre l'intersectine-1 et par analyses de RT-qPCR montrent une inhibition spécifique et efficace de l'intersectine-1 pendant 24 jours consécutifs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodologies existantes, telles que les polymères ou les lentivirus, réside dans le fait que l'administration pulmonaire de liposomes oniques est reproductible, sûre, non toxique et hautement efficace au niveau de l'endothélium pulmonaire.

L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous avons décidé d'évaluer les effets de l'intersection de N vers le bas in vivo, et lorsque d'autres méthodes de livraison d'ARNi n'ont pas fonctionné. Pour préparer les liposomes oniques, ajoutez 315 microlitres d'une solution mère de bromure de diméthyl dioctadécyl ammonium, ou DOAB, dans un ballon à fond rond, puis 200 microlitres de solution mère de cholestérol et 9,5 millilitres de chloroforme, en mélangeant par agitation douce. Fixez le ballon au rotavapor réglé à 37 degrés Celsius et à 100 tours par minute ou plus.

Ouvrez complètement la première vanne pour l'argon en la tournant dans le sens horaire. Ouvrez et fermez toujours cette vanne en premier. La deuxième vanne régule la pression de l'argon soufflé dans le ballon.

Ouvrez-le partiellement pour assurer une pression douce. Une fois que la glace sèche commence à couler sur le tube reliant le réservoir de gaz d'Argonne au rotavapor, abaissez le rotavapor dans le bain d'eau jusqu'à ce que le ballon touche l'eau sans être complètement immergé. Réglez le bouton de vitesse à 100 à 120 tr/min. Lorsque tout le chloroforme contenu dans le ballon s'est évaporé, arrêtez l'appareil.

Régler la vitesse du rotavapor sur zéro et fermer les vannes du réservoir d'argon. Retirer le flacon. Ajouter deux millilitres d'une solution de glucose à 5 % dans le flacon pour resuspendre les lipides.

À l’aide d’une pipette d’un millilitre, gratter soigneusement le fond du flacon afin de dissoudre tous les lipides. Incuber la solution obtenue dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant une heure tout en vortexant lentement le flacon. Soniquer la solution pendant au moins 20 à 30 minutes, en tenant le flacon verticalement et en plaçant son fond légèrement en contact avec l’eau froide du bain à ultrasons.

Ensuite, chauffer le ballon dans le bain d'eau du rotavapor pendant 20 minutes à 42 degrés Celsius à vitesse nulle, le fond rond étant immergé dans l'eau. Filtrer les liposomes à l'aide d'un filtre à seringue de 0,47 micron, suivi d'un filtre à seringue de 0,22 micron. À l'aide d'un petit extrudeur, filtrer les liposomes à travers une membrane de 50 nanomètres afin d'obtenir une population homogène de vésicules liposomiques unilamellaires.

Transférez les liposomes dans un tube Eppendorf et placez-les sur de la glace. Préparez les complexes ARN-liposomes ITSN selon un rapport de huit moles de liposomes pour deux microgrammes d'ARN. Dans cet exemple, 50 microlitres de I-A-I-T-S-N.

À partir d'une solution mère de 50 micromolaire, on ajoute 100 microlitres de liposomes fraîchement préparés en utilisant un tube EOR exempt de A-R-N-A-D-N-A. Conserver le mélange sur de la glace jusqu'à l'injection chez les souris. Les souris utilisées dans cette étude ont environ quatre à six semaines et pèsent environ 25 grammes.

Confirmez par une pincée du orteil que l'animal est complètement anesthésié avant l'injection. Les seringues utilisées sont des seringues tuberculiniques d'un millilitre avec l'aiguille fixée d'une seule main. Tenez les oreilles de la souris et retournez-la sur le côté afin d'exposer l'angle interne de l'œil.

Viser médialement par rapport aux PIKA semi-lunaires et éviter de toucher le globe oculaire. Approcher le caroncule lacrymal de l'œil avec la seringue chargée selon un angle de 45 degrés sur les trois axes. Injecter lentement le mélange, replacer la souris dans sa cage et lui permettre de se remettre du côté injecté.

Haut. La souris reçoit un traitement par ARNi ciblant le gène ITSN1 toutes les 72 heures pendant 24 jours. Pour commencer cette procédure, vérifiez que la souris est complètement anesthésiée en l'absence du réflexe de retrait. Effectuez une laparotomie et excisez le diaphragme.

Ensuite, réalisez une thoracotomie afin d'exposer les poumons et le cœur. Retirez le thymus à l'aide d'un microscope StereoZoom pour une meilleure précision. Cathétérisez l'artère pulmonaire.

Ensuite, réalisez une trachéotomie et intubez la souris en utilisant la stomie trachéale. Réglez le ventilateur sur une fréquence de 150 mouvements par minute et un volume courant de 150 microlitres. En tant qu'orifice de sortie, ouvrez l'oreillette gauche à l'aide d'une pompe péristaltique réglée à 1,5 millilitre par minute et d'une solution de Hank réchauffée à 37 degrés Celsius.

Parcourez la vascularisation pulmonaire de la souris sans sang pendant cinq minutes, suivie d'une perfusion avec le traceur pendant 10 minutes. Après avoir éliminé le traceur non lié, effectuez une fixation in situ des poumons par une perfusion de 10 minutes avec du formaldéhyde à 4 %, du glutaraldéhyde à 2,5 % et de l'acide tannique à 1 %. Prélevez les poumons et retirez les tissus excédentaires.

Découper les poumons en petits blocs et les transférer dans un flacon de scintillation étiqueté contenant deux millilitres d'un mélange fixateur. Pour commencer le traitement du tissu pulmonaire en microscopie électronique, laver brièvement les blocs pulmonaires trois fois dans du tampon au citrate de sodium 0,1 molaire.

Ensuite, fixer les échantillons dans un mélange d'aldéhyde 4 % et de glutaraldéhyde 2,5 % dans un tampon Pipee 0,1 M pendant une heure à température ambiante, puis effectuer une post-fixation avec 1 % d'osmium tétraoxyde pendant une heure dans la hotte, sur de la glace et à l'abri de la lumière, après un rinçage avec le tampon Callen burger. Incuber les échantillons dans le tampon Callen burger pendant deux heures à toute la nuit à température ambiante. Rincer une fois dans de l'éthanol 50 %, puis déshydrater à l’aide d’une série progressive d’éthanol.

70 % d'éthanol pendant cinq minutes, 95 % d'éthanol pendant cinq minutes, puis deux fois dans de l'éthanol à 100 % pendant 15 minutes chacun. Ensuite, passez à l'oxyde de propylène à 100 %. Deux incubations de 15 minutes chacune.

Retirer l'oxyde de propylène et ajouter un mélange contenant 50 % d'oxyde de propylène et 50 % d'epon. Incuber toute la nuit en agitant par rotation sur une roue à température ambiante. Le lendemain matin, retirer le mélange et ajouter de l'epon frais. Agiter par rotation sur une roue pendant au moins quatre à cinq heures.

Ajouter les spécimens sélectionnés dans des moules à double affinement remplis à moitié avec de l’Epon 100 % frais huit 12. Les placer sur les bords, transférer les moules dans un incubateur à 60 degrés Celsius et laisser polymériser pendant 48 à 72 heures. L'inhibition chronique de l'expression de ITSN un s pendant 21 jours consécutifs par administration répétée de complexes de liposomes d'ARNi contre ITSN un s entraîne des niveaux significativement plus faibles de la protéine ITSN un dans les poumons de souris, comme le montrent ces résultats représentatifs : des lysats pulmonaires provenant d’un témoin non traité et de souris traitées ont été transférés sur membrane et révélés avec des anticorps dirigés contre ITSN un et l’actine à plusieurs points temporels après l’administration d’ARNi, comme indiqué.

L'analyse densitométrique de films CL représentatifs à signal élevé et l'analyse quantitative RT-PCR du ARNm d'ITSN1s confirment davantage que le traitement par des complexes de liposomes d'ARNsi ciblant ITSN1s régule efficacement à la baisse la protéine ITSN1s dans les poumons de souris. La diminution des niveaux d'intersectine 1 conduit à un endocytose déficient, à une perturbation du transport endothélial, à une altération de la barrière interendothéliale et à un œdème pulmonaire. Ces micrographies électroniques représentatives de tissu pulmonaire montrent des jonctions interendothéliales ou JIE ouvertes, marquées sur toute leur longueur par des particules d'albumine-or de huit nanomètres.

Le panneau A1 est un agrandissement du panneau A ; les flèches indiquent trois à quatre particules d'albumine marquées à l'or situées à proximité les unes des autres dans le même plan, ce qui suggère l'ouverture étendue de l'IEJ. Des particules d'or sont également associées à la sortie abluminale des IJ, indiquée par les flèches sur les panneaux A1 et B. On observe également le nombre limité de CVE A et la dilatation de l'espace péricapillaire, indiquée par l'astérisque dans le panneau A. Une régulation à la baisse aiguë de l'expression de l'intersectine 1 entraîne une activation compensatoire de voies de transport alternatives pour pallier l'endocytose déficiente.

Ces images de ME montrent des anneaux membranaires dans les panneaux A et A', des tubules pleomorphes dans le panneau B et des endosomes agrandis fusionnés avec des cve LA typiques dans le panneau C, activement impliqués dans l'absorption et le transport de l'albumine marquée à l'or. Une dilatation sévère de l'espace périvasculaire et un œdème protéique sont également observés. Une inhibition prolongée de l'expression de l'intersectine pendant 24 jours réduit l'œdème pulmonaire chez la souris en restaurant partiellement l'intégrité de la barrière inter-endothéliale.

Les études morphologiques en microscopie électronique ont montré que le traceur d'albumine marqué à l'or de huit nanomètres ne pouvait pas pénétrer l'IEJ à ce moment précis, et formait plutôt des résidus de filtration à l'orifice luminal de la jonction, indiqués par la flèche. Toutefois, les espaces péri-vasculaires ou PVS présentaient une certaine dilatation et un œdème léger, suggérant que les jonctions sont imperméables à des particules de cette taille, mais que des corps multivésiculaires ou MVB, situés à proximité de la membrane plasmique et présentant une certaine fuite, possèdent certains de leurs petits vésicules internes marqués par des particules d'albumine d'or de huit nanomètres. Ce tableau indique le nombre de structures transcytotiques endocytiques dans les cellules endothéliales pulmonaires de souris contrôles et déficientes.

Une découverte importante est la diminution des cavées dans l'endothélium pulmonaire de souris déficientes en ITSN1. L'inhibition chronique de l'expression d'intersectine 1 a entraîné l'activation de voies cytoplasmiques endocytiques alternatives et une réduction partielle du nombre de cavées, ainsi que du nombre d'anneaux ou de tubules membranaires marqués par des particules d'albumine dorée. Dans l'endothélium pulmonaire de souris déficientes chroniquement en ITSN1, le nombre de ces structures a également augmenté de 14 fois par rapport aux témoins.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme celle utilisant Eliza appliquée à des lysats de poumon de souris, peuvent être réalisées afin d'estimer quantitativement le transport transendothélial de différents traceurs hnic. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de délivrer spécifiquement des complexes de liposomes oniques et de SRNA à l'endothélium pulmonaire de souris afin d'induire l'extinction du gène codant pour la protéine d'intérêt et d'évaluer sa fonction.