La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

L’objectif global de cette procédure est de générer des neurones céphaliques à partir de cellules souches embryonnaires humaines ou CSE H en passant par des points de contrôle similaires à ceux observés au cours du développement humain. Ceci est accompli en permettant d’abord aux CSH de se différencier spontanément en suspension dans le milieu HESC, puis en les transférant dans le milieu d’induction neuronale pour se différencier de manière plus sélective. Ensuite, les corps embryonnaires ou les agrégats de CSP sont autorisés à se fixer sur des plaques traitées pour la culture tissulaire où les cellules se dilatent et se différencient en une monocouche.

Les centres formant des cellules neuro-épithéliales morphologiquement similaires aux cellules kilométriques. Ensuite, les cellules neuroépithéliales sont isolées et placées dans des cultures en suspension où elles forment des neurosphères. Enfin, les neurosphères sont plaquées sur des lamelles de recouvrement où elles peuvent se différencier davantage.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent les types spécifiques de neurones formés par immunocoloration ou électrophysiologie. Les implications de cette technique s’étendent à une grande variété de maladies héréditaires, car des neurones spécifiques au patient peuvent également être générés à partir de cellules souches pluripotentes induites où le mécanisme d’action ainsi que les thérapies potentielles peuvent être élucidés. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du développement des sous-types de neuro céphaliques à partir de cellules souches pluripotentes.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les maladies humaines liées aux neurones céphaliques de talon Pour générer des agrégats de cellules souches pluripotentes humaines commencer par cultiver des cellules souches pluripotentes humaines sur des fibroblastes embryonnaires de souris se nourrissant dans un milieu HESC complété par un FGF de base pendant cinq à sept jours, les colonies seront grandes, mais toujours indifférenciées. Lorsque les colonies ont atteint le bon stade dans un tube de 50 millilitres. Préparez une solution d’un milligramme par millilitre de baies de diss dans un milieu D-M-E-M-F 12 selon le protocole de texte.

Aspirez le milieu des cellules, puis rincez-les une fois avec D-M-E-M-F 12. Après avoir retiré le lavage, ajoutez un millilitre de dis bays dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Au bout de trois minutes, vérifiez au microscope s’il n’y a pas de bords recroquevillés qui semblent un peu plus foncés.

Si nécessaire, incubez les cellules plus longtemps. Lorsque les cellules sont prêtes, retirez la solution de dase et lavez-les une fois avec D-M-E-M-F 12 avant de remplacer le lavage par 1,5 millilitre de milieu HESC pour détacher et briser les cellules. Placez l’extrémité d’une pipette en verre de 10 millilitres sur les cellules vers la paroi inférieure droite d’un puits et, avec un petit mouvement de haut en bas, déplacez-vous de l’autre côté du puits avant de revenir dans la direction opposée.

Une fois que toutes les cellules sont en suspension, placez-les dans des tubes de 15 millilitres et centrifugez-les à 200 G pendant deux minutes avant de retirer le milieu de la pastille. À l’aide d’un milieu HESC, transférez les cellules dans une fiole pour la culture. Par exemple, pour les cellules de six puits de CSH, utilisez une fiole T 75 avec 50 millilitres de CSH. Douleur moyenne.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Ensuite, pour enlever tous les débris cellulaires, transférez les cellules et le milieu dans un tube de 50 millilitres et lavez les cellules une fois avant de les transférer avec 50 millilitres de milieu frais dans un nouveau flacon. Continuez à nourrir les cellules de cette manière jusqu’au cinquième jour.

Le cinquième jour, faites tourner les cellules et transférez-les dans une nouvelle fiole T 75. Avec 50 millilitres de milieu d’induction neurale ou NIM, incubez-les pendant deux à trois jours en remplaçant la moitié du NIM chaque jour après la plaque d’incubation, les cellules utilisant soit de la laminine, soit du FBS pour les aider à se fixer aux plaques à plaque. À l’aide de FBS, ajoutez 1,5 millilitre de milieu avec des cellules à chacun.

Eh bien, secouez doucement la plaque pour étaler les agrégats et laissez les cellules se fixer pendant la nuit. À 37 degrés Celsius le lendemain, remplacez tout le milieu par deux millilitres de NIM par puits. Après un jour ou deux d’incubation, chaque agrégat s’étalera pour former une monocouche et en quelques jours, les centres de la plupart de ces cellules apparaîtront morphologiquement similaires aux cellules de Columer.

Vers les jours 14 à 17, les cellules de Columer apparaîtront plus compactes. Parfois, les cellules forment des crêtes ou des anneaux avec une lumière visible à l’intérieur. Avant d’isoler les cellules, examinez-les pour détecter la présence de cellules épithéliales non européennes et utilisez une pointe de pipette pour les gratter.

Pour isoler les cellules neuroépithéliales qui se trouvent au centre des colonies. Utilisez une micro-pipette et une pipette stérile filtrée d’un millilitre pour appliquer une pression au centre de la colonie afin qu’elle se décolle. Veillez à ne pas laisser la partie extérieure de la colonie se détacher également.

Transférez deux plaques de cellules isolées dans un tube de 15 millilitres et faites tourner à 200 G pendant deux minutes. Après avoir retiré le milieu, transférez les cellules dans une fiole T 25 non traitée de culture tissulaire contenant 10 millilitres de NIM. Avec l’ajout de B 27 incuber pendant la nuit le lendemain, les cellules devraient avoir une apparence sphérique.

Parfois, les cellules périphériques seront également isolées et elles se fixeront généralement au fond du flacon. Si cela se produit, transférez les cellules sphériques dans un nouveau flacon, en laissant les cellules attachées derrière la culture. Les neurosphères et la suspension pendant une semaine en NIMB 27 pour favoriser l’endurance et la prolifération cellulaire.

Ajoutez le MP cyclique A et le facteur de croissance analogue à l’insuline un. À la fin de la semaine, les neurosphères contiendront des progéniteurs céphaliques et seront prêtes à être plaquées sur des lamelles pour la différenciation terminale. Pour préparer des lamelles de polyuréthane recouvertes de laminine de polyuréthane en 24, des plaques de puits commencent par enduire des lamelles propres avec une solution de polyuréthane de 0,1 milligramme par millilitre à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour enduire les lamelles de laminine à 50 microlitres de 20 microgrammes par millilitre de laminine dans la différenciation neurale.

Moyen à chaque lamelle traitée au polyuréthane. Veillez à ce que le liquide ne touche que la lamelle elle-même. Incuberez-les à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures.

Après l’incubation de la laminine, recueillir et laver les neurosphères dans D-M-E-M-F 12. Si les cellules sont trop grandes pour s’attacher correctement, ajoutez environ deux millilitres d’Accutane et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez un volume égal d’inhibiteur de trypsine et, après la centrifusion, les cellules à 200 G pendant trois minutes, remplacez la solution par du NDM et utilisez un P 200 pour briser les cellules en petits amas.

Placez-les sur des lamelles pré-enduites, aspirez la majeure partie du milieu et transférez les cellules dans une boîte de Pétri de six centimètres en quelques gouttes de milieu afin que leur sélection devienne plus facile sans retirer la laminine des lamelles pré-enduites. Transférez environ quatre à cinq neurosphères à chacune. Laissez les neurosphères se fixer pendant au moins deux à quatre heures avant d’ajouter 0,5 millilitre de milieu de neurodifférenciation complété par B 27 cyclique.

Une MP et des facteurs neurotrophiques remplacent la moitié du milieu tous les deux jours. Les cellules peuvent être maintenues pendant plusieurs mois, comme indiqué ici. Ce protocole décrit comment différencier les CSP humaines en neurones glutamatergiques céphaliques à travers plusieurs étapes critiques.

La formation de la CSP agrège l’induction de cellules neuroépithéliales, la génération de progéniteurs céphaliques talon et la différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones céphaliques talons. Ce système est robuste et efficace dans la génération de neurones céphaliques, progéniteurs et glutamatergiques, par exemple. Sans l’ajout de facteurs d’isation, les CSH se sont différenciées dans la lignée neurale et 24 jours après la différenciation.

La majorité des précurseurs neuronaux étaient positifs pour Fox G one, facteur de transcription A exprimé par le céphalon, mais négatifs pour les HOK B quatre, un marqueur A pour les cellules du cerveau postérieur et de la moelle épinière, ce qui suggère que les progéniteurs céphaliques du télon ont été générés avec succès. Ces progéniteurs céphaliques du télon possèdent un phénotype dorsal comme l’indique l’expression de PAC six. Un marqueur exprimé par les progéniteurs dorsaux, mais pas par NK X 2.1 Un marqueur pour les progéniteurs ventraux.

Suite à une différenciation plus poussée, ces progéniteurs dorsaux céphaliques se sont différenciés en neurones glutamatergiques, qui étaient positifs pour le marqueur glutamatergique. Les neurones de TBR 1 qui se sont maintenus positifs pour TBR 1 étaient également positifs pour les marqueurs neuronaux bêta trois, tubuline ou carte deux. Ces cellules ont également exprimé le transporteur vésiculaire du glutamate un ou V glutamate un, un marqueur des neurones glutamatergiques matures, suggérant la génération efficace de neurones glutamatergiques céphaliques dans la culture.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’électrophysiologie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la capacité de ces neurones à établir des connexions synaptiques avec d’autres cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension. Il a dû différencier les cellules souches pluripotentes humaines et les neurones glutamatergiques céphaliques à travers plusieurs étapes critiques.

La formation de cellules souches pluripotentes agrège l’induction des cellules neuroépithéliales, la génération de progéniteurs céphaliques et la différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones céphaliques.