Name: La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Découvrez la différenciation de neurones télencéphaliques glutamatergiques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode reproduit les étapes clés du développement neuronal humain.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Y. Sasai pour avoir généreusement fourni l&#39;anticorps FOXG1. Ce travail a été soutenu par des subventions souches Connecticut recherche sur les cellules (08-SCB-UCHC- 022 et 11-SCB24) et la Fondation paraplégie spastique.

1. Génération des agrégats cellules souches pluripotentes humaines (D1 à D4) <ol><li> Cellules souches pluripotentes humaines sont mises en culture sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) alimentateurs en présence d&#39;un milieu additionné de CSEh facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, 4 ng / ml). Après 5-7 jours de culture, lorsque les colonies sont grandes, mais encore indifférencié, ils sont prêts pour la prochaine étape. </li><li> La solution enzymatique doit d&#39;abord être préparé. Dans un tube de 50 ml, dissoudre la dispase (ou collagénase) à un 1 mg / ml dans du milieu DMEM/F12 concentration. Comme ces solutions mélanger meilleur lorsqu&#39;il est réchauffé, placez le tube contenant le milieu et de l&#39;enzyme dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau pendant 10-15 minutes, puis le stériliser à l&#39;aide d&#39;un filtre Steriflip. </li><li> Aspirer le milieu des cellules, les rincer à l&#39;DMEM/F12, et aspirer ce lui aussi. Ajouter 1 ml de dispase à chaque puits et les placer dans l&#39;incubateur pendant 3-5 min pour CSEh (jusqu&#39;à 10 min pour iPSCs). Regardez les cellules au microscope, quandles bords se recourbent légèrement / regarder un peu plus sombre, les cellules sont prêtes pour l&#39;étape suivante. Il est préférable de vérifier les cellules après 3 minutes et remettez-les en cas de besoin. Lorsque vous utilisez ce protocole pour la première fois, il est préférable de commencer avec une seule plaque de cellules à la fois, il est important d&#39;éliminer les cellules de la dispase aussi rapidement que possible. </li><li> Aspirer la dispase à partir des cellules. Doucement (les cellules sont très vulnérables à ce stade et se détache de la plaque relativement facilement) ajouter 1,5 ml de DMEM/F12 dans chaque puits afin de rincer le dispase. Aspirer le DMEM/F12 et ajoutez 1,5 ml de milieu de CSEh à chaque puits. </li><li> Pour détacher et briser les cellules, placez la pointe d&#39;une pipette en verre de 10 ml vers le coin en bas à droite d&#39;un puits (toucher les cellules) et déplacez la pipette de haut en bas (verticalement) - l&#39;attiser la hausse devrait se trouver à proximité à la course à la baisse procédure. Une fois de l&#39;autre côté du puits est atteint, répéter à l&#39;horizontale direction. </li><li> Une fois que toutes les cellules sont en suspension, les placer dans des tubes de 15 ml et centrifuger les à 200 xg pendant 2 min. Il doit y avoir un culot de cellules au fond du tube. Aspirer hors du milieu au-dessus du culot. </li><li> La taille du flacon de culture cellulaire qui devraient être utilisés pour maintenir les agrégats en fonction de la quantité initiale de cellules. Pour 6 puits plaque (1) de CSEh, un non-culture de tissus traités flacon T75 avec 50 ml de milieu de CSEh devraient être utilisés. Transférer les cellules de l&#39;étape 1.6 à la fiole et incuber à 37 ° C. </li><li> Afin de se débarrasser des débris cellulaires, le milieu cellulaire et le ballon doit être remplacé environ 12 heures plus tard. Pour ce faire, placer tous les moyens / cellules dans un tube de 50 ml, tourner les cellules vers le bas (200 g pendant 2 min), et aspirer hors l&#39;ancien milieu. Ensuite, ajoutez 50 ml de milieu frais CSEh dans les cellules, et les placer dans un nouveau flacon T75. Les cellules peuvent ensuite être nourris quotidiennement suivant la même procédure (jusqu&#39;à ce jour 5). </li></ol><ol><li> Transférer les cellules / moyen d&#39;un tube de 50 ml et centrifuger les cellules pendant 2 min à 200 x g. Ensuite, aspirer le surnageant et transférer les cellules à une nouvelle (non-culture de tissus traités) flacon T75 avec 50 ml de milieu d&#39;induction neurale (NIM). </li><li> Une fois que les cellules sont en NIM, la moitié du milieu doit être remplacé tous les deux jours. Les agrégats doivent être suffisamment grande à l&#39;endroit où ils se déposent au fond d&#39;un tube de 50 ml conique sur eux-mêmes après quelques minutes (pas de centrifugation nécessaire). Après 2-3 jours de NIM (D7-D8 total), les cellules doivent être prêts à l&#39;assiette. Laminine ou de sérum foetal bovin (FBS) peut être utilisé pour aider les cellules s&#39;attachent aux plaques. </li><li> Le nombre de cultures de tissus traités plaques à 6 puits qui sont nécessaires dépend de la densité des cellules dans chaque agrégat doit être capable de se développer sur la plaque pendant plusieurs jours sans toucher aucun des autres. En moyenne, les cellules d&#39;unFlacon T75 donnera environ 4-6 6 plaques ainsi une valeur de cellules. </li><li><ol class="ualpha"><li> Si vous utilisez la laminine, le diluer dans NIM à 10-20 g / ml pour enduire la plaque à 6 puits (~ 0,5 ml / puits). Après le revêtement pendant 2-3 h, agrégats cellulaires plaque sur des plaques 6 puits (~ 20-30 agrégats par puits). Après les agrégats ont été fixées, ajoutez 1,5 ml d&#39;NIM. </li><li> Si vous utilisez FBS, préparer un mélange de 90% de FBS NIM et 10% (1,5 ml / puits). Ajouter 1,5 ml de milieu avec les cellules à chaque puits, agiter doucement la plaque avant en arrière pour répartir les agrégats, et de permettre aux cellules de se fixer O / N dans un incubateur. Assurez-vous de changer le support (2 ml / puits de NIM) le lendemain matin pour enlever le FBS. </li></ol></li><li> Après un jour ou deux d&#39;être plaqué, chaque agrégat sera étalée pour former une monocouche. En quelques jours, les centres de la plupart de ces cellules morphologiquement ressembler à des cellules cylindriques (forme allongée). Au cours de cette période, modifier le NIM tous les deux jours. Certaines lignes CFP (spécialement iPSC), peuvent former des cellules cylindriques de manière moins efficace. Dans ce cas, l&#39;ajout de BMP et les inhibiteurs de TGF (Dorsomorphin 29, SB431542 19 à 2 pM) pendant la phase 2 peut être utile. </li><li> Autour des jours 14-17, les cellules cylindriques apparaîtront plus compact. Parfois, ces cellules forment des crêtes ou des anneaux de lumière visibles à l&#39;intérieur. Outre la morphologie colonnaire, les cellules à ce stade expriment des marqueurs neuro-épithéliales, comme PAX6 et SOX1 12,26. </li><li> Avant l&#39;isolement peut commencer, il faut d&#39;abord examiner les cellules afin de déterminer s&#39;il ya des cellules neuro-épithéliales non-présents. Un marqueur objectif peut être utilisé pour indiquer les colonies non-neuroépithéliales. Ceux-ci peuvent ensuite être éliminées en les grattant avec un embout de pipette. </li></ol> 3. Génération de progéniteurs télencéphaliques (D17-D24) <ol><li> Les centres des colonies contenant des cellules neuroépithéliales, et doivent être isolés du reste de la colonie. Cela peut être fait en utilisantune micropipette et un embout de pipette stérile de 1 ml filtré. Quand une petite quantité de pression est appliquée sur la partie centrale de la colonie, la soulève généralement hors assez facilement. Soyez prudent de ne pas laisser la partie extérieure de la colonie se détacher ainsi. Si les centres sont d&#39;être têtu et ne se détache pas de leur propre chef, ils peuvent être enlevés en les retranchant l&#39;aide d&#39;une aiguille sous un microscope dans une hotte stérile. Transférez les parties centrales des colonies à un tube de 15 ml et centrifuger à 200 xg pendant 2 min. </li><li> Le milieu doit être aspiré hors de la cellule. Deux plaques de dollars de cellules peuvent ensuite être transférées vers une culture de non-tissu traité T25 flacon contenant 10 ml de NIM avec l&#39;ajout de B27 (sans vitamine A, 1:50). Utilisez 5-10 ml de milieu par une plaque de cellules. </li><li> Lorsque les cellules sont vus le lendemain, ils devraient avoir une sphère comme l&#39;aspect. Il est nécessaire de transférer ces cellules dans un nouveau flacon (en présence du NIM et B27, 1:50) que ce sont souvent les cellules périphériquesqui se faufiler à l&#39;intérieur et attacher au fond du flacon. </li><li> Le neurosphères devrait ensuite être cultivées en suspension pendant une semaine en utilisant NIM complété avec B27 (1:50). Dans le but de promouvoir l&#39;endurance et la prolifération cellulaire, l&#39;AMP cyclique (AMPc, 1 uM) et du facteur de croissance d&#39;insuline (IGF-1, 10 ng / ml) peut être ajoutée dans le milieu au cours de la culture en suspension. À ce stade, les neurosphères contiennent des progéniteurs télencéphaliques (FOXG1 +) et sont prêts à être étalées sur des lamelles de différenciation terminale. </li></ol> 4. Différenciation plus loin dans les neurones télencéphaliques (D25 +) <ol><li><ol class="ualpha"><li> Préparer les lamelles recouvertes poly-ornithine/laminin (en plaques de 24 puits) pour l&#39;étalement des cellules. Lamelles sont d&#39;abord nettoyées et sont ensuite enrobés avec stratagème-ornithine (à 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, et stocké au congélateur). Poly-ornithine revêtement: <ol><li> Stériliser les lamelles: Placez les lamelles dans unbécher contenant de l&#39;acide nitrique et secouez doucement sous la hotte pendant une heure. Verser l&#39;acide nitrique, rincer plusieurs fois avec de l&#39;eau DI, et de laisser les lamelles sous l&#39;eau courante DI pendant au moins 15 min. Placez les lamelles dans de l&#39;éthanol à 95% et soit agiter pendant 30 min (si vous utilisez immédiatement) ou un magasin dans l&#39;éthanol à température ambiante. </li><li> Dans une hotte stérile, verser le contenu du tube de 50 ml contenant des lamelles stérilisés dans le couvercle d&#39;une plaque à 6 puits. En utilisant des pinces stérilisées, ramasser une lamelle à la fois et placé debout dans un seul puits d&#39;une plaque de 24 puits. Répétez sorte que chaque bien a une lamelle. </li><li> Après avoir sécher complètement, appuyez sur les plaques jusqu&#39;à ce que des lamelles sont tombés à plat dans chaque puits. Suivant ajouter 100 ul de poly-ornithine (0,1 mg / ml dans des conditions stériles dH 2 O) à chaque lamelle et incuber les plaques O / N à 37 ° C. </li><li> Le lendemain, enlever les plaques de l&#39;incubateur et les laisser refroidir à température ambiante. Aspirer poly-ornithine hors de chaque lamelle (à partir de l&#39;arête de til lamelle) veillant à ne pas toucher ou rayer les lamelles dans le processus. Laisser sécher les lamelles pendant environ 30 min avant de les laver. </li><li> Ajouter 1 ml stérile dH 2 O dans chaque puits et laisser reposer pendant 10 min, et aspirer hors de l&#39;eau de chaque puits. Répétez cette étape de lavage à deux reprises. Après que les plaques sécher complètement, (congé couvre off dans la hotte) placer les couvercles sur, couvrir de papier d&#39;aluminium, et conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li><ol><li> Pour enrober les lamelles avec la laminine, ajouter 50 ul d&#39;un mélange de milieu de différenciation neuronale et la laminine (concentration finale de 20 pg / ml) à chaque lamelle de poly-ornithine traités en prenant soin d&#39;avoir seulement le liquide de toucher la lamelle lui-même (et non pas renverser off). Les incuber à 37 ° C pendant 1-2 heures avant de préparer les cellules pour la fixation. </li></ol></li></ol></li><li> Recueillir et centrifuger les neurosphères à 200 xg pendant 2 min dans un tube de 15 ml. Aspirer le surnageant. </li> &lt;li&gt; <ol class="ualpha"><li> Rincer les cellules avec du DMEM-F12 et centrifuger les cellules à nouveau. Si les neurosphères sont trop grands pour fixer correctement, ils peuvent être dissociées avec Accutase à cette étape. </li><li> Si vous utilisez Accutase: Après avoir lavé les cellules avec du DMEM-F12, les neurosphères sont dissociées de petites grappes en ajoutant Accutase (~ 2 ml) et incuber les cellules à 37 ° C pendant 3 min. Ensuite, ajoutez la même quantité d&#39;inhibiteur de trypsine (~ 2 ml) et centrifuger les cellules à 200 xg pendant 3 min. Les cellules doivent ensuite être remis en suspension dans NDM et brisée à l&#39;aide d&#39;une pipette P200. Les petits groupes peuvent ensuite être étalées sur des lamelles de pré-enduits. </li></ol></li><li> Aspirer la majorité du support et placer les cellules sur un plat 6 cm de Petri dans quelques gouttes de telle sorte que le moyen de les sélectionner devient plus facile. Ajouter environ 4-5 neurosphères à chaque lamelle pré-enduit. Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;aspirer au large de la laminine premier. </li><li> Laissez le neurosphères joindre pendant au moins 2-4 heures. Une fois qu&#39;ils ont unttached bien, plus moyen (0,5 ml / lamelle) devrait être ajouté. Il devrait être composé de milieu de différenciation neurale complété avec B27 (1:50), l&#39;AMPc (1 uM), et les facteurs neurotrophiques (BDNF, le GDNF, et de l&#39;IGF, le tout à 10 ng / ml). A ce stade, la moitié de la moyenne peut être changé tous les deux jours, et ces cellules peuvent être maintenues pendant plusieurs mois. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Il ya plusieurs étapes importantes au cours du processus de différenciation neurale. Il est important de s&#39;assurer que les CSP sont pluripotentes humaines car, sinon, les cellules peuvent déjà être biaisée en vue de devenir une lignée non neuronales. Cela peut être confirmé par coloration des CSP de l&#39;homme avec des anticorps contre les marqueurs de pluripotence comme Oct4, Sox2, Nanog, et Tra-1-60 1-3. Si les guichets de l&#39;homme n&#39;attache pas très bien après les passages, inhibiteur de ROCK (...

Les cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (CISP), ont la capacité de produire tous les types de cellules dans le corps, y compris les neurones 1-3. Différenciation dirigée des différents sous-types neuronaux du PSC de l&#39;homme détient la clé de l&#39;application de ces cellules en médecine régénérative. La génération des sous-types neuronaux fonctionnels au cours du développement est un processus complexe impliquant l&#39;induction de la lignée neuronale, la spécification des progéniteurs régionales le long de l&#39;axe rostro-caudal, et la différenciation des types de neurones post-mitotiques des progéniteurs régionaux 4,5. A partir de 2001, plusieurs systèmes ont été mis en place pour générer des lignées de CSEh neurones, qui ont fourni une plate-forme pour la génération suivante de sous-types neuronaux 6,7. Basé sur les principes de développement, les types de neurones plusieurs comme la colonne vertébrale neurones moteurs 8-12, mésencéphale dopneurones aminergiques 13-15, les cellules rétiniennes neuronales 16,17 ont été efficacement spécifié dans les CSP de l&#39;homme. Cela a été fait en appliquant morphogènes essentiels qui sont importants pour la spécification de ces types de neurones au cours du développement in vivo. D&#39;autres protocoles ont également été élaborées pour promouvoir la différenciation des CSEh dans les neurones en utilisant soit des facteurs supplémentaires tels que les 18-20 petites molécules ou par co-culture avec d&#39;autres types cellulaires pour aider à promouvoir la différenciation 21. Le néocortex humain est très développé et contient de nombreux types cellulaires, y compris les neurones glutamatergiques qui jouent un rôle important dans l&#39;apprentissage, la mémoire et la fonction cognitive 22,23. La première étape pour générer des neurones glutamatergiques dans la culture est de spécifier des cellules progénitrices télencéphaliques. Groupe de Yoshiki Sasai le premier signalé la différenciation dirigée des précurseurs télencéphaliques de la souris CES (mESCs) en utilisant une suspensio sans sérumn culture en présence de DKK1 (qui inhibe la signalisation Wnt) ainsi que LeftyA (qui inhibe la signalisation nodal) 24. Par la suite, plusieurs groupes, dont le nôtre ont également signalé la spécification des précurseurs télencéphaliques du PSC de l&#39;homme dans le sérum 25-27 milieu exempt. La génération des précurseurs télencéphaliques du PSC de l&#39;homme n&#39;exige pas l&#39;utilisation de morphogènes exogènes et l&#39;efficacité dans la production de ces précurseurs est beaucoup plus élevé que celui de mESCs 26,27. Ici, un système chimique définie pour l&#39;induction neurale qui a été bien établi par le groupe de Zhang 7 a été décrite. Sans l&#39;ajout de facteurs exogènes caudalizing, ce protocole génère efficacement les précurseurs télencéphaliques du PSC de l&#39;homme 27. Ces progéniteurs peuvent alors se différencier en progéniteurs dorsales ou ventrales en régulant la signalisation de Wnt et sonic hedgehog (SHH). Les progéniteurs dorsaux peuvent en outre se différencier en neurones glutamatergiques efficiently 27. En outre, ce protocole fonctionne aussi bien pour la génération de neurones glutamatergiques de l&#39;homme iPSCs 28, qui permet de générer des neurones spécifiques du patient qui peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme d&#39;action ainsi que des thérapies potentielles pour un large éventail de maladies . De plus, notre système offre également une plate-forme pour explorer le développement et la spécification des divers types de neurones dans le télencéphale.

<table><tbody><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco avec mélange de nutriments F12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Substitut de sérum Knockout</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211 ; thanol (14.3 M)</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine hydrobromure (polyornithine)</td><td>Sigma</td><td>116K5103</td><td></td></tr><tr><td>Laminine (humain)</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>Laminine (souris)</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphine</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2, bFGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de trypsine</td><td>Gibco</td><td>17075</td><td></td></tr><tr><td>0,1 % gélatine</td><td>Anticorps Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Foxg1</td><td>Anticorps Dr. Y. Sasai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoxb4 (1:50)</td><td>Études développementales Hybridoma Bank</td><td>I12</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 anticorps (1:5000)</td><td>Études développementales Hybridoma Bank</td><td>PAX6</td><td></td></tr><tr><td>Nkx2.1 anticorps (1:200)</td><td>Chemicon</td><td>MAB5460</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1 anticorps (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>Anticorps AB9616</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 (1:100)</td><td>Systèmes synaptiques</td><td>135302</td><td></td></tr><tr><td>facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance de l’insuline 1 (IGF1)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>Cyclique AMP (cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D-0260</td><td></td></tr><tr><td>Sonic hedgehog (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 50 ml</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>352097</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits</td><td>BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Flacons 353047</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25 (non traités)</td><td></td><td>Flacons 353009</td><td></td></tr><tr><td>T75 (non traités)</td><td>Sacs</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-objectifs</td><td>Chemiglass Life Sciences</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Boîtes de Pétri</td><td>BD</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>9'' pipettes en verre</td><td>Fisher</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Filtres Steriflip (0.22 &mu ; M)</td><td>Filtres Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 1 000 ml (0,22 &mu ; M)</td>Microscope à contraste de phase <td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>(Observer A1)</td>Incubateur <td>de dioxyde de carbone Zeiss</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>(Hera Cell 150)</td>Capot de biosécurité <td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Sterilgard III Advance)</td><td>Centrifugeuse The Baker Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5702 R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Ici, une procédure par étapes pour générer efficacement télencéphaliques neurones glutamatergiques de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) a été décrite. Le processus de différenciation est déclenchée par la rupture des CPP de l&#39;homme en touffes qui complètent pour former des agrégats lorsque les cellules sont placées dans une culture en suspension. Les agrégats sont ensuite cultivées dans un milieu de CSEh jours 1-4 pour permettre une différenciation spontanée. Pendant ce temps, les cellules ont la capacité de devenir l&#39;une des trois feuillets embryonnaires. De 5-8 jours, les cellules sont placées dans un milieu d&#39;induction neurale pour les pousser dans la lignée neuronale. Autour jour 8, les cellules sont autorisés à fixer sur plaque de 6 puits et de se différencier au cours de laquelle la forme des cellules neuro-épithéliale. Ces cellules neuro-épithéliales peuvent être isolés au jour 17. Les cellules peuvent ensuite être conservé sous forme de neurosphères jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à être étalées sur des lamelles. L&#39;utilisation d&#39;un milieu de base sans aucun facteur de caudalizing, les cellules neuro-épithéliales sont précisésd télencéphaliques en précurseurs, qui peuvent ensuite être davantage différenciées en progéniteurs télencéphaliques dorsales et les neurones glutamatergiques efficacement. Dans l&#39;ensemble, notre système offre un outil pour générer des neurones glutamatergiques de l&#39;homme pour les chercheurs d&#39;étudier le développement de ces neurones et les maladies qui les affectent.

Ici, un protocole de différencier les CSP de l&#39;homme dans télencéphaliques neurones glutamatergiques au travers de plusieurs étapes essentielles: la formation d&#39;agrégats de la CFP, l&#39;induction de cellules neuro-épithéliales, la production de progéniteurs télencéphaliques et la différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones télencéphaliques (Figure 1) a été décrits. Ce système est robuste et efficace dans la production de progéniteurs des neurones glutamatergiques et télencéphaliqu...

Cette procédure donne des neurones télencéphaliques en passant par les points de contrôle qui sont similaires à ceux observés au cours du développement humain. Les cellules peuvent se différencier spontanément, sont exposés à des facteurs qui les poussent vers la lignée neuronale, sont isolés et sont étalées sur des lamelles couvre-objet pour permettre une différenciation terminale et de maturation.

La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des neurones céphaliques à partir de cellules souches embryonnaires humaines ou H ESCs en passant par des points de contrôle similaires à ceux observés au cours du développement humain. Cela est réalisé en permettant d'abord aux HSCs de se différencier spontanément en suspension dans un milieu HESC, puis en les transférant dans un milieu d'induction neuronale afin d'orienter plus spécifiquement leur différenciation. Ensuite, les corps embryonnaires ou agrégats de PSC sont laissés s'attacher sur des plaques traitées pour culture cellulaire, où les cellules s'étendent et se différencient en une monocouche.Avec la formation de cellules neuroépithéliales ayant une morphologie similaire à celle des cellules kilométriques. Ensuite, les cellules neuroépithéliales sont isolées et placées en cultures en suspension où elles forment des neurosphères. Enfin, les neurosphères sont ensemencées sur des lamelles où elles peuvent poursuivre leur différenciation.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les types spécifiques de neurones formés par immunomarquage ou par électrophysiologie. Les implications de cette technique

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Nous avons établi un protocole pour l'induction de neuroblastes direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs neuronaux humains et neuronale types de cellules dans le développement du SNC pour les neurones de réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

Les protocoles de différenciation neuronale des cellules souches humaines pluripotentes (hPSCs) sont souvent beaucoup de temps et nécessitera d'importantes compétences de culture cellulaire. Ici, nous avons adapté une procédure de différenciation petite molécule à base d'un format de plaque multititre, permettant la génération simple, rapide et efficace des neurones humains d'une manière contrôlée.

Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Cette vidéo démontre le processus de différenciation des corps embryoïdes (EB) en agrégats neuroépithéliaux et leur division ultérieure en cellules neuronales et gliales. Cette méthode permet de générer efficacement des cellules neuronales et gliales in vitro, qui servent de systèmes d’essai pour les tests de toxicité ainsi que pour l’évaluation des différentes voies impliquées dans la neurotoxicité.

Génération de neurones et de cellules gliales à partir de corps embryoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Cette vidéo démontre le processus d’induction de cellules souches pluripotentes humaines à se différencier en neurones en les transfectant avec des lentivirus modifiés portant un gène de facteur de transcription neurogène sous le contrôle d’un élément sensible à la tétracycline, suivi d’un traitement avec un dérivé de la tétracycline et un milieu de maturation.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines dans les neurones à l’aide de lentivirus modifiés

Nous, sur la base des connaissances de la biologie du développement et des recherches publiées, avons développé un protocole optimisé pour générer efficacement des neurones dopaminergiques A9 du mésencéphale à partir de cellules souches embryonnaires humaines et de cellules souches pluripotentes induites humaines, ce qui serait utile pour la modélisation de la maladie et la thérapie de remplacement cellulaire pour la maladie de Parkinson.

Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) sont considérées comme un outil puissant pour le dépistage médicamenteux et chimique et pour le développement de nouveaux modèles in vitro pour les tests de toxicité, y compris la neurotoxicité. Ici, un protocole détaillé pour la différenciation des hiPSC dans les neurones et la glie est décrit.

Protocole pour la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme dans des cultures mixtes de neurones et Glia pour des tests de neurotoxicité

Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

Le transport mitochondrial altéré et la morphologie sont impliqués dans diverses maladies neurodegenerative. Le protocole présenté utilise des neurones de cerveaux avant dérivés de cellules souches pluripotentes induits pour évaluer le transport mitochondrial et la morphologie dans la paraplégie spastique héréditaire. Ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie, ce qui facilitera l’étude des maladies neurodégénératives.

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

Nous décrivons une méthode de différenciation des astrocytes et des neurones dérivés pluripotents induits par l’homme et leur co-culture pour l’enregistrement électrophysiologique.

Mise en place d’une plateforme électrophysiologique pour la modélisation de la SLA avec des astrocytes et des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines spécifiques à une région

La dérivation de lignées du système nerveux entérique (ENS) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) fournit une source évolutive de cellules pour étudier le développement et la maladie de l’ENS, et à utiliser en médecine régénérative. Ici, un protocole in vitro détaillé pour dériver des neurones entériques à partir de hPSC en utilisant des conditions de culture chimiquement définies est présenté.

Différenciation des lignées du système nerveux entérique à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Découvrez la différenciation de neurones télencéphaliques glutamatergiques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode reproduit les étapes clés du développement neuronal humain.

La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

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