Fabrication puce microfluidique et méthode pour la détection de la grippe

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter le virus de la grippe A à l'aide d'une puce microfluidique. Tout d'abord, faire circuler l'échantillon avec le tampon de lyse à travers le canal SPE afin de lyser le virus et d'extraire l'ARN. Charger le réactif RT-PCR avec l'ARN extrait et faire passer le mélange dans le canal de transcription inverse pour convertir l'ARN viral en ADNc. Ensuite, faire circuler le mélange dans le canal PCR afin d'amplifier l'ADN. Les résultats obtenus indiquent la taille et la concentration de l'amplicon en fonction du signal de fluorescence provenant de l'électrophorèse capillaire.

Le principal avantage de cette technologie est qu'elle accepte l'échantillon brut du patient et intègre l'extraction, la purification, la transcription inverse et l'amplification des acides nucléiques dans une seule puce. Pour créer deux plaques, répartir environ neuf grammes de pastilles XN X uniformément au centre d'une plaque métallique, puis placer sur une presse chauffée à 198 degrés Celsius pendant cinq minutes. Appliquer ensuite lentement une pression jusqu'à 2 500 PSI pendant cinq minutes supplémentaires. Placer maintenant une plaque sur le moule en époxy préchauffé à 157 degrés Celsius pendant 10 minutes, et appliquer lentement une pression jusqu'à 1 000 PSI pendant encore 10 minutes.

Ensuite, en portant des gants thermiques, retirez la plaque et le moule de la presse chaude, puis retirez la plaque du moule avant qu'elle ne refroidisse. Percez trois trous dans la puce embossée, un à l'entrée, un au port de déchets et un à la sortie du canal microfluidique. Lavez ensuite les puces avec de l'IPA, puis avec RNAs away et de l'eau dianna's.

Séchez les puces à l'air pour les fixer ; préchauffez-les d'abord à 131 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis appliquez une pression de 350 PSI pendant 10 minutes supplémentaires. À l’aide de l’époxy JB Weld, fixez séparément les nano-ports à l’entrée, au réservoir de déchets et aux sorties, puis laissez durcir de 15 à 24 heures. Conformément aux instructions du fabricant, rincez le canal SPE avec 50 microlitres de RNAs away, puis avec 100 microlitres d’eau sans nucléase.

Chargez maintenant le canal SPE avec quatre microlitres de solution de greffage fraîchement préparée pour réticuler l'incubat de méthacrylate pendant 10 minutes dans un four à UV, puis éliminez la solution de greffage résiduelle à l’aide d’un vide. Disperser le culot de microsphères séchées en tapotant sur le tube avec le couvercle fermé. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution fraîchement préparée pour colonne SPE et vortexez pour homogénéiser.

Chargez quatre microlitres de la solution SPE dans le même canal et réticulez par irradiation UV pendant 2,5 minutes de chaque côté, ce qui donne une colonne SPE polymérisée opaque et blanche. Lavez le canal avec 500 microlitres de méthanol à 100 % pour éliminer les réactifs en excès et les solvants pyrogènes intrapolymères. Fixez deux chauffages à film mince sur le dessous de la puce à l’aide de ruban thermiquement conducteur.

Remarquez que les côtés des chauffe-eau doivent être alignés avec le bord des canaux larges pendant la durée Dene et, séparément, insérez cinq thermocouples dans la puce à travers les canaux latéraux ouverts borgnes de chaque ruban de puce. Pour fixer la position des thermocouples, ajoutez quatre microlitres de 25 XRNA secure à 96 microlitres d'éthanol à 70 % dans un tube, et à de l'éthanol à 100 % dans un second tube. Préparez également 300 microlitres de tampon de canal et 316 microlitres de tampon de lyse.

Chauffer les solutions à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes. Activer l'ARN secure, puis équilibrer le canal microfluidique. Faire circuler le tampon de canal à travers le canal SPE à un débit de 0,8 millilitre par heure.

Placez maintenant l'échantillon de test rapide au fava dans le milieu de transport viral (VTM) à 37 degrés Celsius. Retirez l'échantillon dès qu'il est décongelé. Faites centrifuger l'échantillon à 13 000 tr/min pendant 10 minutes.

Transférez 100 microlitres du surnageant dans 300 microlitres du tampon de lyse, puis ajoutez six microlitres de porteur à une concentration de un microgramme par microlitre, vortexez l'ARN pour homogénéiser. Ensuite, centrifugez pendant cinq secondes et chargez l'ensemble du lysat dans une seringue munie d'un embout verrou un CC. Faites passer le lysat à travers le canal SPE à un débit de 0,8 millilitre par heure.

Ensuite, lavez le canal SPE avec 100 microlitres d'éthanol à 70 %, suivi de 100 microlitres d'éthanol à 100 % à un débit de un millilitre par heure. Placez une seringue vide à la graduation 0,5 millilitre et faites passer de l'air à travers le canal pour le sécher à un débit de un millilitre par heure. Faites ensuite circuler 67,5 microlitres d'eau sans nucléase à travers le canal pour éluer les acides nucléiques liés à un débit de 0,5 millilitre par heure, et récupérez 13,5 microlitres provenant du nano-port au niveau du port de déchets.

Charger 36,5 microlitres du mélange maître R-T-P-C-R. Mélanger dans le nanoport au niveau du port de déchets et combiner avec l'ARN matrice pour une réaction R-T-P-C-R de 50 microlitres. Ensuite, charger le mélange R-T-P-C-R dans le canal RT par aspiration douce sous vide.

Scellez le nano-port avec un raccord fermé. Appliquez 35 volts au réchauffeur 1. Conservez les réactifs dans le canal de température ambiante pendant 30 minutes après que le réchauffeur 1 ait atteint l'équilibre à 50 degrés Celsius.

Conserver les réactifs dans le canal RT pendant 15 minutes après que le réchauffeur un a atteint l'équilibre à 95 degrés Celsius. Ensuite, appliquer 27 volts sur le réchauffeur un et 50 volts sur le réchauffeur deux pour amener le réchauffeur un à 60 degrés Celsius et le réchauffeur deux à 95 degrés Celsius. Pousser les réactifs dans le canal PCR à raison de 0,5 microlitre par minute.

Environ 20 minutes plus tard, lorsque les réactifs atteignent l'extrémité du canal sinueux, récupérez les produits de PCR à la sortie à l'aide d'une pipette et d'une pointe adaptées au test d'ADN haute sensibilité d'Agilent. Sortez le kit d'ADN haute sensibilité Agilent du réfrigérateur 30 minutes avant le test. Allumez le bioanalyseur et ouvrez le logiciel expert 2 100.

Chargez un microlitre des produits de PCR pour le test et suivez le protocole Agilent. Analysez et enregistrez les données dans ce flux de travail. L'échantillon nasal pharyngé du patient est mélangé avec le tampon de lyse et appliqué sur la puce.

La puce est utilisée et les produits de PCR du virus de la grippe apparaissent rouges sur une puce d'électrophorèse capillaire commerciale. En raison des quantités différentes de virus de la grippe présentes dans chaque échantillon de patient, la concentration finale du produit de PCR variera. Un bon résultat doit présenter un bruit faible, des pics en échelle bien distincts à 35 et 10 paires de bases, ainsi qu’un pic unique correspondant à la taille prévue du produit, soit 107 paires de bases, pour l'échantillon positif.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de fabriquer et d'utiliser la puce microfluidique pour détecter le virus de la grippe A.