Name: Formation de lépithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Découvrez comment isoler le mésenchyme du sinus urogénital de rongeurs pour former un épithélium prostatique humain. Cette méthode combine UGSM et cellules souches pluripotentes implantées sous la capsule rénale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à souligner le soutien de l&#39;Université de Chicago Section d&#39;urologie dirigée par le Dr Arieh Shalhav, et le directeur de la recherche urologique Dr Carrie Rinker-Schaeffer. Nous tenons également à souligner l&#39;appui de l&#39;Université de Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) dirigée par le Dr Michelle Le Beau. Nous avons également à remercier l&#39;assistance technique d&#39;experts de l&#39;installation Human Tissue Resource Center de base dirigée par le Dr Mark Lingen, et l&#39;aide de Leslie Martin et Mary Jo Fekete. Nous remercions également le Core Facility immunohistochimie dirigée par Terri Li. Ce travail a été financé par l&#39;Université de Chicago Département de chirurgie, la Section d&#39;urologie, un American Cancer Society subvention de recherche institutionnelle (ACS-IRG, # IRG-58-004), un Cancer Center Subvention d&#39;appui (P30 CA14599); La Brinson Foundation, le Fonds Alvin Baum de la famille, de l&#39;Université du conseil de Chicago Cancer Research Foundation femmes; S. Kregel est soutenu par un HHMI: Med-en-Grad Fellowshanche (56006772) et une biologie Subvention de formation sur le cancer (T32-CA09594). Enfin, nous tenons à remercier Robert Clark, Dr. VenkateshKrishnan, et Nathan Stadick pour leur évaluation critique du manuscrit.

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire du National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par l&#39;Université de Chicago Institutional Animal Care et le Comité d&#39;utilisation (IACUC, numéros protocole 72066 et 72231). Tout chirurgie a été effectuée sous anesthésie, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. L&#39;cellules souches embryonnaires humaines ligne WA01 (H1; NIH-enregistrement # 0043) a été acquis auprès WiCell (Madison, WI) et cultivées en utilisant le protocole d&#39;alimentation indépendante en utilisant mTeSR1 médias (technologies des cellules souches, Vancouver, BC). Les cellules ES ont été utilisés dans les dix passages de décongélation. 1. Isolation du sinus urogénital de souris ou rat embryons <ol><li> Euthanasier une souris timed-enceinte (jour 17.5) ou rat (18,5 jours) par inhalation de CO 2 pendant 5 min. La mort a été confirmée par l&#39;arrêt des signes vitaux chez le rat. Puis casser le cou humanité. Le rà se euthanasiés à ce point. Vaporiser l&#39;éthanol à 70% pour stériliser la peau et les flancs abdominale. Coupez la peau de l&#39;abdomen et les couches musculaires, puis couper l&#39;utérus, séparez les embryons de rat du sac amniotique, et couper le cordon ombilical. Transférer les embryons dans un tube Falcon de 50 ml contenant une solution saline équilibrée de Hank glacée (HBSS) et garder sur la glace. Les foetus sont euthanasiés par décapitation avec des ciseaux chirurgicaux. </li><li> Placez l&#39;embryon en 100 mm boîte de Petri. Bissecter l&#39;embryon avec des ciseaux au niveau de l&#39;ombilic (figure 1A). Retirer l&#39;estomac et l&#39;intestin grêle. Révéler les ovaires et les testicules de l&#39;embryon femelle chez l&#39;embryon mâle (figure 1B et 1C). (Les ovaires sont situés au niveau des pôles caudal des reins. Les testicules sont à peu près au niveau de la vessie). A ce stade de développement, UGSM isolé de deux embryons mâles et femelles sont capables d&#39;induire une lignée épithéliale prostatique en présence de l&#39;hôtela testostérone. 4 Après ce point de temps de développement, cependant, les bourgeons prostatiques commencent à se former dans le UGSM, et l&#39;isolement de UGSM pur est très difficile. 4 </li><li> Sous le microscope de dissection, couper la paroi abdominale dans la ligne médiane avec Vannas ciseaux pour exposer la vessie et la paroi postérieure de l&#39;abdomen. Libérer le tractus génital supérieur de pièces jointes (dans les embryons mâles, couper l&#39;uretère, Wolff conduit et conduit Müllerian; dans les embryons femelles, couper l&#39;uretère et Müllerian conduit). Libérer la vessie du cordon ombilical. Couper os pubien et carrément séparée de la paroi antérieure du sinus urogénital avec Dumont pince fine de pointe. Enfin, séparer la paroi postérieure du sinus urogénital du rectum. Couper le sinus urogénital avec la vessie à l&#39;extrémité inférieure (à partir de l&#39;urètre) et stocker le sinus urogénital en bloc (avec la vessie) dans du HBSS froid glace. </li></ol> 2. La séparation de la Mesenchyme des sinus urogénital <ol><li&gt; Retirez la vessie du sinus urogénital sous le microscope de dissection (figure 1D). </li><li> Transférer le sinus urogénital dans un tube Falcon contenant 1% de trypsine en calcium (Ca2 +) et magnésium (Mg 2 +) de HBSS libres. Placer le tube dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant 75 min. </li><li> Retirez la trypsine et de neutraliser la trypsine avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) en milieu DMEM/F12. </li><li> Taquiner soigneusement le manchon mésenchymateuses collant du tube épithélial avec une aiguille ou Dumont pince fine de pointe (maintenir le tube épithélial intact réduit les risques de contamination des cellules épithéliales du mésenchyme, ce qui peut entraîner des glandes de rongeurs formant avec votre cellule souche dérivée de l&#39;homme épithélium glandulaire) (figure 1D). 12 </li><li> Transfert UGSM dans un nouveau tube Falcon contenant du milieu DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% pénicilline / streptomycine (Pen / Strep; 0,5 mg / ml) + 1% d&#39;acides aminés non essentiels (NEAA) plus 1 nM R1881. Place le tube dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant la nuit. </li><li> Centrifuger le tissu à 200 xg et jeter le surnageant. Laver avec tampon phosphate salin (PBS) (ne pas perturber le culot tissulaire). </li><li> Ajouter 0,2% de collagénase (en DMEM/F12) pour remettre en suspension les tissus. Incuber à 37 ° C avec doux balancement pendant 1 heure. </li><li> Vigoureusement vortex du tissu digestion trois fois jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne mélange unique cellule homogène et ajouter du milieu DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% P / S + 1% NEAA + 1 nM R1881 pour neutraliser la collagénase. </li><li> Centrifuger à 200 xg, puis lavez en re-suspension des cellules de UGSM dans HBSS, et répéter trois fois pour se laver entièrement le UGSM. Enfin suspendre cellules mésenchymateuses en DMEM/F12 et compter les cellules en utilisant un hématimètre ou dispositif de comptage cellulaire. </li><li> Dissocier les cellules hES culture protocole utilisant des liaisons de libre avec mTeSR1 médias (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) en utilisant une digestion Accutase (Millipore, Billerica, MA). Laver les cellules hESau cours de la phase logarithmique de la croissance de leur chaleureux DMEM/F12 médias, puis ajouter la solution chaude Accutase 1x, et incuber à 37 ° C pendant 15-20 min jusqu&#39;à ce que les cellules individuelles sont uniformément dissociées de colonies. Ajouter une quantité égale de 1x défini trypsine inhibiteur (Invitrogen, Grand Island, NY) pour neutraliser l&#39;Accutase et la pipette doucement de haut en bas pour mélanger et diviser amas de cellules. cellules de pipette dans un tube à centrifuger et centrifuger 3 min à 200 xg, et remettre en suspension le culot cellulaire dans DMEM/F12 médias. Tube à centrifuger 3 min à 200 xg encore et éliminer le surnageant, puis remettre en suspension dans HBSS froid ou DMEM/F12 au volume désiré. </li><li> Ajouter cellules hES avec un ratio 1:2,5 de hES / cellules mésenchymateuses. 3 Ce sera une composition cellulaire de 1E 5 cellules UGSM avec 4E 4 CSEh par 10 ml (injection d&#39;un seul rat UGS généralement des rendements d&#39;environ 6 cellules mésenchymateuses 2E). Centrifuger à 200 g pendant 5 min, puis jeter le surnageant. Re-suspendre avec 75% Matrigel (BD Biosciences,San José, en Californie, mélangé avec 25% HBSS froid pour une manipulation facile) et placer le tube dans la glace pour l&#39;injection de la capsule sous-rénale. </li></ol> 3. La transplantation de tissu recombinant Sous la capsule rénale <ol><li> Préparer une zone chirurgicale stérile. </li><li> Anesthésier la souris nude athymique mâle avec ip kétamine / xylazine, utiliser un mélange frais contenant un rapport de la kétamine 01:01:08: xylazine: saline. Le dosage sera de 100 mg / kg de kétamine et 2,5 mg / kg de xylazine. Les animaux qui ne répondent pas à un orteil-pincement doivent être entièrement sous pendant 20-30 min. </li><li> Préparer chirurgicalement la souris par le rasage du site opératoire (si vous n&#39;utilisez pas une souris nude), le nettoyage avec trois lingettes alternance de 70% d&#39;alcool suivie d&#39;une solution de bétadine et en appliquant un champ opératoire. </li><li> Mettez œil salve d&#39;humidité (Altalube pommade ophtalmique) aux yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant l&#39;anesthésie. </li><li> Au cours de la chirurgie, la vitesse de respiration et la température centrale du corps de la souris sont surveillés. Les taux de respiration shoULD être stable et maintenu à l&#39;intérieur de 40-90 respirations / min. la température du corps de base est contrôlé par l&#39;observation de la couleur des muqueuses et de la plante des pieds roses. </li><li> Faire une incision cm de la peau longitudinal 1,0 longtemps sur le dos. Continuer à couper la paroi abdominale dans une incision longitudinale de 0,5 cm. </li><li> Appuyez doucement sur le rein de l&#39;abdomen et de garder l&#39;humidité de la surface du rein en utilisant des gouttes de solution saline stérile. </li><li> Doucement percer la capsule rénale en utilisant un vide de calibre 27 aiguille de seringue. Une ponction très faible est suffisante. Ce sera le lieu où vous insérez votre aiguille émoussée d&#39;injecter votre mélange cellulaire. </li><li> Remplir une aiguille de seringue émoussée de calibre 28 avec 10 pl de votre mélange de cellules. Insérez délicatement le site de ponction et pénétrer dans le parenchyme rénal pour atteindre une zone en dessous de la capsule rénale. Injecter 10 ul du mélange cellulaire pour former un bolus sur le rein sous la capsule rénale. Retrait de l&#39;aiguille. </li><li> Retour du rein à la abdocavité terminal. Fixez la couche musculaire du péritoine avec des sutures de nylon 4-0. </li><li> Fermez la peau soit avec suture ou des agrafes. </li><li> Nettoyer le sang de la peau en utilisant une solution saline stérile. </li></ol> 4. L&#39;analgésie post-opératoire et suivi <ol><li> Injecter l&#39;animal avec la buprénorphine (0,1 mg / kg toutes les 12 heures) ou le kétoprofène (3-5 mg / kg dans une solution saline chaque 12 h) pour gérer la douleur post-opératoire, et 1 ml de 37 ° C IP saline pour garder l&#39;animal au chaud et de prévenir la déshydratation. </li><li> Placez l&#39;animal dans une cage propre et placez-le sur un coussin chauffant doux. </li><li> Envoyez les animaux dos à la salle des animaux une fois qu&#39;ils reprennent conscience et se déplacent à l&#39;intérieur de la cage. </li><li> Observez l&#39;animal quotidiennement les signes inattendus de maladie et d&#39;infection pour les trois jours suivants. Les souris sont surveillés par l&#39;observation des activités dans des cages dont la nourriture accéder et d&#39;eau 1 jour post-opératoire. Si les souris présentent moins d&#39;activités, kétoprofène est intrapéritonéale annonceson ministère à nouveau une fois par jour. </li><li> Retirez les agrafes de la peau ou des sutures deux semaines post-chirurgie. </li><li> Tissus xénogreffes peuvent être récoltées dès 8 semaines après la chirurgie. Xénogreffes peuvent être imagées in vivo en utilisant des ultrasons pour petits animaux (figure 2A), et des tissus fixés peuvent être sectionnés et colorés pour diverses protéines par immunohistochimie (Figure 3). </li></ol>

<ol><li>Taylor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+human+prostate+tissue+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-induced+morphogenesis+and+growth%3A+role+of+mesenchymal-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Prog.+Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions.</a> Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).</li>
<li>Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+urogenital+development%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mouse urogenital development: a practical approach.</a> Differentiation. 71, 402-413 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+male+urogenital+tract.+Role+of+androgens%2C+mesenchymal-epithelial+interactions%2C+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors.</a> J. Androl. 13, 465-475 (1992).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+as+mediators+of+androgen+action+during+the+development+of+the+male+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract.</a> World J. Urol. 13, 264-276 (1995).</li>
<li>Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+reprogramming+of+adult+human+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation.</a> Differentiation. 65, 113-118 (1999).</li>
<li>Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+control+of+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development.</a> Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterospecific+induction+of+prostatic+development+in+tissue+recombinants+prepared+with+mouse%2C+rat%2C+rabbit+and+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues.</a> Differentiation. 24, 174-180 (1983).</li>
<li>Van der Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD133+in+Normal+Human+Prostate+Stem+Cells+and+Malignant+Cancer+Initiating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells.</a> Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).</li>
<li>Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. , (2009).</li>
<li>Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. 69, 1557-1564 (2009).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).</li>
<li>Prokhorova, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells+is+site+dependent+and+enhanced+by+the+presence+of+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel.</a> Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).</li>
<li>Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+stains+for+p63+and+alpha-methylacyl-CoA+racemase%2C+versus+a+cocktail+comprising+both%2C+in+the+diagnosis+of+prostatic+carcinoma%3A+a+comparison+of+the+immunohistochemical+staining+of+430+foci+in+radical+prostatectomy+and+needle+biopsy+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues.</a> Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+prostatic+epithelial+model+of+hormonal+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis.</a> Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).</li>
<li>Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+expression+of+prostate-specific+membrane+antigen%2C+a+tissue+differentiation+antigen+and+folate+hydrolase%2C+facilitates+prostate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis.</a> Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).</li>
<li>Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stromal-epithelial+interactions+in+hormonal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).</li>
<li>Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regeneration+of+murine+prostate+from+dissociated+cell+populations+of+postnatal+epithelia+and+urogenital+sinus+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).</li>
<li>Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+normal+macrophages+from+human+embryonic+stem+%28hES%29+cells+for+applications+in+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy.</a> Retrovirology. 3, 24(2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt avec le travail présenté.

recombinaison de tissus à l&#39;aide UGSM est une technique extrêmement utile pour étudier l&#39;évolution de la prostate et les événements moléculaires menant à l&#39;initiation du cancer de la prostate. Le potentiel d&#39;induction de UGSM a été utilisé pour de nombreuses applications dans la recherche de la prostate, il s&#39;agit notamment de renforcer la tumeur prendre des lignes et des tumeurs des cellules de la prostate, l&#39;étude des interactions stroma-épithéliales, et former des recombinants de la prostate i...

Il ya un énorme besoin de meilleurs systèmes de modèles humains de cancer de la prostate. En particulier, des systèmes modèles pertinents de l&#39;homme, des tissus de la prostate non malignes normales qui peuvent être manipulées génétiquement pour discerner directement le rôle des gènes spécifiques dans le déclenchement du cancer de la prostate serait extrêmement instructif. L&#39;avènement de l&#39;ère de la génomique a identifié de nombreux gènes qui pourraient avoir un rôle dans la formation du cancer. Un manque de systèmes modèles expérimentaux humains, cependant, compromet gravement notre capacité à tester fonctionnellement et caractériser les gènes de susceptibilité au cancer de la prostate candidats. Un système modèle idéal serait de faciliter les analyses fonctionnelles rapides et plus rapide de gènes de susceptibilité au cancer en combinaison avec des systèmes modèles de rongeurs transgéniques appropriés. En outre, un tel système de modèle humain permettrait caractérisation moléculaire des mécanismes de signalisation de la carcinogenèse prostatique vers la découverte et la validation de nouvelles thérapies pourprévenir la formation de cancer de la prostate. Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont capables de former des tissus prostatiques humains comme des xénogreffes. En 2006, Taylor, et al. Rapporté que les CSEh peuvent être amenés à former des épithéliums de la prostate in vivo lors d&#39;une nouvelle combiné avec rongeur sinus urogénital mésenchyme (UGSM) dans un délai de 8-12 semaines. 1 Ces études étaient fondées sur les travaux antérieurs de le laboratoire Cunha montrant que les rongeurs UGSM embryonnaire peut favoriser la différenciation de la prostate des cellules souches et des populations de cellules épithéliales embryonnaires in vivo. 2,3 La prostate se développe à partir d&#39;une anlagen embryonnaire appelé le sinus urogénital (UGS), et avant le jour embryonnaire 17 (E17 souris ; jour E18 chez le rat) l&#39;UGS peuvent être enlevés et physiquement divisé en épithélium (UGSE) et le mésenchyme (UGSM) 4 Cette approche de recombinaison de tissu a considérablement amélioré notre compréhension du développement de la prostate et la carcinogenèse, en particulier.facteur de croissance des Ly et des voies de signalisation hormonales et les relations moléculaires entre la prostate stroma et de l&#39;épithélium. 5-8 Cette méthode implique la combinaison ex vivo de UGSM avec la tige ou les cellules épithéliales de même ou d&#39;espèce distincte et ces recombinants cellulaires / tissu sont implantées et développées et xénogreffes au sein souris hôte. 4,9 Après une période de croissance in vivo, l&#39;implant contient la prostate structures glandulaires épithéliales intégrés dans le tissu stromal. En outre coloration peut être effectué afin de déterminer si ces structures sont vraiment de la prostate et d&#39;origine humaine 10,11.

<table><tbody><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>GIBCO</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>R1881</td><td>Sigma</td><td>965-93-5</td><td>Mélanger à 1 μg/ml dans de l’éthanol (1 000x stock)</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Solution</td><td>GIBCO</td><td>15070</td><td>100x stock</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>KETASET (chlorhydrate de kétamine) </td><td>Fort Dodge Santé animale</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>100 mg/ml ; diluer 1:10 dans une solution saline stérile </td></tr><tr><td>AnaSed (xylazine) </td><td>VET-A-MIX, Inc.</td><td>NADA 139-236</td><td>20 mg/ml ; dilué 1:10 dans une solution saline stérile</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>BD Biosciences</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase </td><td>Sigma</td><td>C2014</td><td></td></tr><tr><td>Kétoprofène </td><td>Fort Dodge</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td>100 mg/ml ; dilué 1:1 000 dans une solution saline stérile</td></tr><tr><td>Pommade pour les yeux Altaire </td><td>Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NLC 56641-19850</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 F Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td></td><td>N’importe quelle bonne lunette de dissection peut être utilisée.</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Hamilton</td><td>84855</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille Hamilton, petite RN, calibre 28, 0,5 pouces, Point Style #3 (Blunt)</td><td>Hamilton</td><td>7803-02</td><td> </td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’éthanol</td> à aiguille personnalisée <td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de gaze stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)</td><td>MedVet International</td><td>J392H</td><td>Aiguille, suture soluble </td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Wound Clips</td><td>Becton Dickenson</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>PVP Iodine Prep Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-98</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection avec extrémité émoussée</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pointe fine Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille avec ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

formation de l&#39;épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progrès dans la recherche du cancer de la prostate est sévèrement limitée par la disponibilité des systèmes modèles d&#39;origine humaine et hormones naïve, qui limitent notre capacité à comprendre les événements génétiques et moléculaires qui sous-tendent l&#39;initiation de la maladie de la prostate. Vers le développement de meilleurs systèmes modèles pour l&#39;étude de la prostate humaine carcinogenèse, nous et d&#39;autres avons profité de l&#39;unique potentiel inductif pro-prostatique embryonnaire rongeur prostate stroma, appelés sinus urogénital mésenchyme (UGSM). Quand recombiné avec certaines populations de cellules pluripotentes comme les cellules souches embryonnaires, UGSM induit la formation de la prostate humaine normale épithéliums d&#39;une manière dépendante de la testostérone. Un tel système de modèle humain peut être utilisée pour étudier expérimentalement et tester la capacité des gènes de susceptibilité au cancer de la prostate candidats à un rythme accéléré par rapport aux études typiques transgéniques de rongeurs. Comme les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) peuvent être génétiquement modifiés dans la culture usinvecteurs knock-down avant recombinaison des tissus expression génique inductible g ou siRNA, un tel modèle facilite tester les conséquences fonctionnelles des gènes ou des combinaisons de gènes, qui sont pensés pour favoriser ou empêcher la cancérogenèse. La technique d&#39;isolement de populations pures de cellules UGSM, cependant, est difficile et l&#39;apprentissage nécessite souvent quelqu&#39;un avec une expertise précédente pour enseigner personnellement. Par ailleurs, l&#39;inoculation de mélanges de cellules sous la capsule rénale d&#39;un hôte immunodéprimé peut être techniquement difficile. Ici, nous décrivons et illustrons bonne isolation de UGSM à partir d&#39;embryons de rongeurs et rénale implantation de la capsule de mélanges de tissus pour former l&#39;épithélium de la prostate humaine. Une telle approche, à son stade actuel, nécessite in vivo de xénogreffes de cellules souches embryonnaires, les applications futures pourraient inclure dans la formation de la glande vitro ou l&#39;utilisation de populations de cellules souches pluripotentes induites (CISP).

S&#39;appuyant sur ​​le rapport passionnant par Taylor, et al., Notre laboratoire a élaboré un protocole greffe utilisant le H1 couramment utilisé (NIH, désignée WA01, génétiquement mâle) lignée de cellules souches embryonnaires humaines. 1 Cette ligne a été rigoureusement testé pour le contrôle de la qualité et est caryotype normale 13 Lorsqu&#39;elle est cultivée de manière appropriée, les cellules hES peuvent être maintenues, élargi, et cryoconservés dans un état ​​indifférencié et plur...

Pour élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent premiers cancer de la prostate initiation, roman et systèmes de modèles humains et des approches novatrices ont désespérément besoin. Le potentiel de pré-prostatique sinus urogénital mésenchyme (UGSM) pour inciter les populations de cellules souches pluripotentes pour former l&#39;épithélium de la prostate humaine est un outil puissant dans la recherche expérimentale de la prostate.

Formation de l&#39;épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler le mésenchyme du sinus urogénital, ou UGSM, de fœtus de rongeurs et d'implanter des mélanges tissulaires sous la capsule rénale afin de former un épithélium prostatique humain. Cette étape est réalisée en isolant d'abord le sinus urogénital de fœtus de souris ou de rat. Ensuite, le mésenchyme du sinus urogénital est séparé de l'épithélium.Ensuite, des suspensions uniques de cellules de mésenchyme du sinus urogénital sont combinées à des cellules souches pluripotentes. Enfin, le mélange cellulaire est implanté sous la capsule rénale d'une souris hôte. En définitive, des résultats peuvent être obtenus montrant un épithélium prostatique humain formé sur le rein de la souris, validé par l'expression spécifique de la PSA humaine.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la fonction de la prostate et l'initiation des maladies, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que le xénogreffe de tumeurs prostatiques humaines et l'induction de lignées cellulaires tumorales hebdomadaires pour former des tumeurs. Après avoir sacrifié une souris ou un rat gravide à un moment précis et isolé les embryons, séparez-

formation-human-prostate-epithelium-using-tissue-recombination-rodent

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Dans cette vidéo, nous démontrons la culture de cellules épithéliales de prostate isolées de souris à l’aide d’une technique de culture basée sur un gel matriciel. Cette approche peut fournir des informations complémentaires sur la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate à former des structures glandulaires 3D en réponse à une manipulation génétique ou pharmacologique.

Dosage des organoïdes de la prostate : une technique de culture ex vivo basée sur un anneau de gel matriciel pour étudier la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure de dissection du système urogénital ou UGS à partir d’un modèle de souris mâle. Cet UGS est ensuite disséqué ex vivo pour isoler la prostate et étudier son rôle dans le développement du cancer de la prostate.

Extraction de la prostate du système urogénital de souris : une technique pour séparer la prostate des autres organes du système urinaire et génital chez la souris mâle

Nous décrivons la fabrication de pastilles comprimées d'hormones, ainsi que l'implantation chirurgicale sous-cutanée à des souris. Cette stratégie peut être combinée avec la croissance de xénogreffes de cellules et de tissus sous la capsule rénale de souris nudes athymiques pour évaluer la carcinogenèse hormonale et la régulation de la croissance bénigne de la prostate.

Rénale Capsule xénogreffe sous-cutanée et Pellet implantation pour l&#39;évaluation de la carcinogenèse prostatique et l&#39;hyperplasie prostatique bénigne

Ce protocole décrit la décellularisation des reins de rat Sprague Dawley par perfusion antérograde de détergents à travers le système vasculaire, produisant des matrices extracellulaires rénales acellulaires qui servent de modèles pour le repeuplement avec des cellules épithéliales rénales humaines. La recellularisation et l’utilisation du test de perfusion de résazurine pour surveiller la croissance sont effectuées dans des bioréacteurs de perfusion spécialement conçus.

Épithéliale repeuplement cellulaire et préparation des rongeurs matrice extracellulaire échafaudages pour le développement de tissu rénal

Ce manuscrit décrit les protocoles de la prostate microdissection et la castration chirurgicale chez la souris de laboratoire. Nous représentons également des résultats représentatifs produits par ces protocoles. Enfin, nous discutons des avantages et de l'utilisation de ces protocoles.

Murine Prostate Micro-dissection et Castration chirurgicale

Souris génétiquement modifiées sont des modèles utiles pour l’étude des mécanismes du cancer de la prostate. Nous présentons ici un protocole en vue d’identifier et de disséquer les lobes de la prostate depuis un système urogénital de la souris, de différencier basé sur l’histologie et d’isoler et de culture primaire de cellules prostatiques in vitro comme sphéroïdes pour analyses en aval.

Identification, Caractérisation histologique et Dissection des Lobes de la Prostate souris pour modèles In Vitro sphéroïde 3D Culture

Nous présentons ici un protocole visant à guider la manipulation humaine primaire organoïde la prostate puis indiquent les points de terminaison pour évaluer le phénotype. Semis, entretien de la culture, recouvrement de gel de matrice, quantification morphologique, enrobage et sectionnement, FFIP sectionnement, entier-montez coloration et application d’essais commerciaux sont décrites.

Manutention et évaluation de la Culture humaine Organoïde la Prostate primaire

Les organoïdes de prostate de souris représentent un contexte prometteur pour évaluer des mécanismes qui règlent la différenciation. Cet article décrit une approche améliorée pour établir des organoïdes de prostate, et introduit des méthodes pour (1) recueillir le lysate de protéine des organoïdes, et (2) fixer et tacher des organoïdes pour la microscopie confocale de monture entière.

Évaluer la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate de la souris à l'aide de la culture organoïde

Les implants issus de l’ingénierie tissulaire pour la chirurgie reconstructive dépassent rarement les essais précliniques en raison de la culture ex vivo laborieuse, qui comprend des composants d’échafaudage complexes et coûteux. Ici, nous présentons une procédure en une seule étape conçue pour la dérivation urinaire avec un échafaudage tubulaire accessible à base de collagène contenant des microgreffes autologues.

Modèle chirurgical pour des tubes urothéliales à ingénierie tissulaire unique chez les miniporcs

Ce protocole décrit la génération d’un modèle murin à base d’organoïdes prostatiques cultivé en 2D. Elle comprend la dissociation organoïde, l’ensemencement cellulaire, la différenciation, l’évaluation de l’intégrité épithéliale et l’infection in vitro par Escherichia coli uropathogène. Le modèle offre une accessibilité apicale et convient à l’étude des interactions hôte-pathogène, surmontant ainsi les limites des systèmes organoïdes 3D traditionnels.

Génération d’un modèle à base d’organoïdes prostatiques de souris pour étudier les interactions hôte-pathogène

Ce protocole propose une méthode optimisée pour isoler la muqueuse épithéliale de l’urètre de la femelle adulte de souris pour des analyses en aval, incluant la cytométrie en flux, l’immunocoloration et la culture d’organoïdes. Les méthodes ont permis de produire des cellules épithéliales urétrales enrichies et viables, comme en témoignent l’analyse de cytométrie en flux, l’imagerie de montage complet et la formation efficace d’organoïdes.

Une méthode optimisée pour isoler l’épithélium urétral chez la souris femelle pour l’analyse unicellulaire et immunofluorescence

Découvrez comment isoler le mésenchyme du sinus urogénital de rongeurs pour former un épithélium prostatique humain. Cette méthode combine UGSM et cellules souches pluripotentes implantées sous la capsule rénale.

Formation de lépithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines (Vidéo) | JoVE Journal

Formation de l'épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

Explorer plus de vidéos