Formation de l'épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

L’objectif global de cette procédure est d’isoler l’urogénital de rongeur, le mésenchyme sinusal ou l’UGSM des embryons de rongeurs et d’implanter des mélanges de tissus dans la capsule rénale qui peuvent former l’épithélium de la prostate humaine. Ceci est accompli en isolant d’abord le sinus urogénital d’embryons de souris ou de rat. Ensuite, le mésenchyme du sinus urogénital est séparé de l’épithélium.

Ensuite, des suspensions unicellulaires de mésenchyme du sinus urogénital sont combinées avec des cellules souches pluripotentes. Enfin, le mélange cellulaire est implanté sous la capsule rénale d’une souris hôte. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent que l’épithélium de la prostate humaine s’est formé sur le rein de souris grâce à la validation de l’expression spécifique du PSA humain.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la fonction de la prostate et de l’initiation de la maladie, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que la xénogreffe de tumeurs de la prostate humaine et l’induction de lignées cellulaires tumorogènes hebdomadaires pour former des tumeurs. Après avoir euthanasié une souris ou un rat enceinte et isolé les embryons, séparez-les du sac amniotique, coupez le cordon ombilical et transférez-les dans un tube de 50 millilitres contenant des écheveaux glacés. Équilibrez la solution saline et conservez-la sur de la glace.

Placez un embryon dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et utilisez des ciseaux pour le couper en deux au niveau du bolus. Retirez l’estomac et l’intestin grêle, puis localisez les ovaires chez l’embryon féminin, qui se trouvent aux pôles de la coddlerie des reins ou le testicule chez l’homme situé au niveau de la vessie. Dans le cadre d’une dissection.

Utilisez des ciseaux de Venise pour couper la paroi abdominale afin d’exposer la vessie et la paroi postérieure de l’abdomen. Libérez l’appareil génital supérieur des attaches et libérez le cordon ombilical. Coupez l’os pubien à l’aide d’une pince à pointe fine Dumont.

Franchement, séparez-le de la paroi antérieure du sinus urogénital. Séparez la paroi postérieure du sinus urogénital du rectum et coupez le sinus urogénital avec la vessie à l’extrémité inférieure. Séparez ensuite la vessie du sinus urogénital.

Stockez le sinus urogénital et le bloc dans le HBSS glacé. Transférez le sinus urogénital dans un tube de 50 millilitres contenant 1 % de trypsine dans HBSS sans calcium ni magnésium et incubez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez la trypsine et ajoutez 10 % de FBS et DM UN MILIEU MF 12 pour neutraliser la digestion.

Ensuite, utilisez une aiguille ou une pince à pointe fine pour taquiner soigneusement le manchon mésenchymateux collant du tube épithélial. Le maintien du tube épithélial intact réduit les risques de contamination du mésenchyme par les cellules épithéliales. Cela peut entraîner la formation de glandes de rongeurs avec l’épithélium glandulaire humain dérivé des cellules souches.

Transférez l’UGSM dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant du milieu DMM F 12 contenant 10 % de FBS, 1 % de streptocoque, 1 % d’acides aminés non essentiels et une nanomolaire. R 1 8 81 Incuber le tube à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant la nuit. Le lendemain, centrifugez le tissu à 200 G.Jetez le surnageant et utilisez du PBS pour laver la pastille.

Après avoir retiré le PBS, remettez le tissu en suspension dans 0,2 % de collagénase en D-M-A-M-F 12 et incubez à 37 degrés Celsius avec un léger balancement pendant une heure, agitez vigoureusement le tissu digestif trois fois jusqu’à ce qu’il devienne un mélange homogène de cellules uniques et neutralisez la collagénase en ajoutant du milieu D-M-A-M-F 12 avec 10 % FBS, 1 % de streptocoque, 1 % d’acides aminés non essentiels et une nanomolaire R 1 8 81. Lavez les cellules trois fois en les granulant à 200 G et en les suspendant dans HBSS. Enfin, résuscitez, suspendez les cellules mésenchymateuses dans le DMM F 12 et utilisez un hémocytomètre pour les compter afin de réaliser la transplantation.

Après avoir préparé une zone chirurgicale stérile et anesthésié une souris nue athymique mâle avec une injection IP de kétamine xylazine, selon le protocole de texte, effectuez un pincement de l’orteil pour confirmer le niveau de sédation, préparez chirurgicalement la souris en rasant le site chirurgical si nécessaire, et nettoyez-la avec trois lingettes alternées de 70 % d’alcool suivies d’une solution de bétadine. Après avoir appliqué une pommade oculaire, faites une incision longitudinale d’un centimètre sur le dos et continuez à couper la paroi abdominale avec une incision longitudinale de 0,5 centimètre. Pressez doucement le rein pour l’extraire de l’abdomen et utilisez des gouttes de solution saline stérile pour le garder humide.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille de seringue de calibre 27, percez doucement la capsule rénale pour créer un site d’injection pour le mélange de cellules. Remplissez ensuite une aiguille de seringue de calibre 28 avec 10 microlitres de mélange cellulaire et insérez-la lentement dans le site de ponction, pénétrant dans le parenchyme rénal. Pour atteindre une zone située sous la capsule rénale.

Injectez 10 microlitres du mélange cellulaire pour former un bolus sur le rein sous la capsule rénale et retirez l’aiguille. Remettez le rein dans la cavité abdominale et fixez la couche musculaire du péritoine avec quatre sutures en nylon. Fermez la peau avec des sutures ou des agrafes et utilisez une solution saline stérile pour nettoyer le sang de la peau.

Voici une image échographique d’une xénogreffe en croissance huit semaines après l’implantation. La zone encerclée représente la xénogreffe à la surface du rein. Ces images montrent la croissance de xénogreffes à la surface du rein.

Après 12 semaines, les cellules ES humaines implantées en l’absence de sinus urogénital, le mésenchyme formeront un grand tératome, tandis que le mésenchyme du sinus urogénital implanté seul ne formera aucune structure discernable. Montré au centre. Les panneaux de cette figure sont des colorations immunohistochimiques représentatives de l’épithélium de la prostate humaine dérivé de cellules souches par rapport au tissu prostatique humain adulte.

Comme indiqué ici à gauche, les glandes contiennent une couche épithéliale luminale AR positive. Il s’agit également d’un PSA positif, d’une couche de cellules épithéliales basales P 63 positive et d’une chromogranine rare. Cellules neuroendocrines, les glandes ne sont pas cancéreuses comme le montre la coloration négative A-M-A-C-R lors de la castration de l’hôte.

Les cellules luminales AR PSA positives ne sont plus présentes, démontrant une dépendance androgénique caractéristique. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de faire très attention à séparer le mésenchyme du sinus urogénital de l’épithélium. Comme contaminant, l’épithélium des sinus urogénitaux formera des glandes et pourrait fausser vos résultats.