Name: Évaluer murin Fonction Artère résistance à laide myographie de pression (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Apprenez la myographie de pression pour évaluer la réactivité vasculaire des artères mésentériques de souris. Cette méthode permet d'étudier la vasodilatation dépendante de l'endothélium en temps réel.

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Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Paul Huang et Dmitriy Atochin pour l&#39;utilisation de DMT pression myographe et les Drs. Binglan Yu Chong et Lei pour fournir des souris nourries avec régime alimentaire riche en graisses ou un régime standard. SOURCE DE FINANCEMENT Ce travail a été soutenu par le scientifique Development Grant 10SDG2610313 de l&#39;American Heart Association (pour ES Buys), et un Eleanor et le programme de bourses du 50e anniversaire de la Rive Miles for Scholars de médecine à la Harvard Medical School (pour ES Buys).

1. Préparation de la solution <ol><li> 500X EDTA stock: peser 500 mg EDTA-Na 2 • 2H 2 O et les dissoudre dans 50 ml d&#39;eau déminéralisée. Stocker à température ambiante. </li><li> KCl solution dépolarisants. <ol><li> Préparer la solution mère K10X: 3,69 g NaCl, 18,64 g de KCl, 0,36 g MgSO4 anhydre, 0,41 g KH 2 PO 4, 0,46 g CaCl 2 • 2H 2 O. Dissoudre dans 250 ml d&#39;eau déminéralisée. Stocker à température ambiante. </li><li> Pour 100 ml KCl dernière solution 1X dépolarisants: Dissoudre 0,21 NaHCO 3, 0,18 g de glucose dans 90 ml d&#39;eau déminéralisée. Ajouter 10 ml de la solution mère K10X. Ajouter 95 ul de solution EDTA 500X. Mélangez bien. Conserver à 4 ° C. Utilisez moins d&#39;une semaine. </li></ol></li><li> Préparer une nouvelle solution HEPES PSS, le jour de l&#39;expérience (pour 1 litre). <ol><li> 6,96 g NaCl, 0,35 g de KCl, 0,288 g MgSO 4 • 7H 2 O, 0,1605 g de KH 2 PO 4, 2,38 g HEPES. Dissoudre dans 100 mlde l&#39;eau désionisée. Marquer comme flacon A. </li><li> 0,312 g CaCl 2 • 2H 2 O. Dissoudre dans 100 ml d&#39;eau déminéralisée. Marquer comme flacon B. </li><li> 1,25 g NaHCO3, 0,991 g de glucose. Dissoudre dans 98 ml d&#39;eau déminéralisée. Marquer comme flacon C. </li></ol></li><li> Ajouter 2 ml de 500X EDTA dans une fiole C. Prendre 700 ml d&#39;eau déminéralisée dans un grand flacon. Verser le contenu du flacon A, B et C dans le grand flacon avec vortex continue. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. </li></ol> 2. Médicaments utilisés <ol><li> Phényléphrine (10 -2 M): dissoudre 20,37 mg dans 10 ml d&#39;eau déminéralisée. Aliquote de 1 ml et conserver à -80 ° C. Série diluer pour obtenir 10 -3 10 -4, 10 -5 et 10 -6 mol / L le jour de l&#39;expérience. </li><li> L&#39;acétylcholine (10 -2 M): dissoudre 18,17 mg dans 10 ml d&#39;eau déminéralisée. Aliquote de 1 ml et conserver à -80 ° C. Série diluer pour obtenir 10 -3 10 -4, 10 -5 et 10 -6mol / L, le jour de l&#39;expérience. </li></ol> 3. Souris Homme WT et sGCα 1 - / - souris sur le fond S6 et B6 ont été étudiés tout au long de cette étude. Le sGCα 1 - / - ont été générés comme décrit précédemment 4,5. Logement et procédures impliquant des animaux de laboratoire (souris) ont été approuvés par le comité de protection des animaux de recherche du Massachusetts General Hospital, Boston, MA. 4. Mesure de la réactivité vasculaire dans l&#39;artère mésentérique <ol><li> Euthanasier les souris avec du pentobarbital (200 mg / kg, ip). Ouvrez la cavité abdominale et disséquer le tissu mésentérique. Isoler et disséquer une artère mésentérique du 3 ème sans conjonctif et le tissu adipeux ordre, et placez-le dans l&#39;artère glacée HEPES PSS solution pré-équilibrée avec 95% O 2/5% de CO 2 pendant 15 min. Couper anneaux de longueur de 2-3 mm avec pas de ramification de la mésentériqueartère. Différencier les artères et les veines au niveau micro des vaisseaux est problématique quand il n&#39;ya pas de sang dans les vaisseaux. Par conséquent, nous vous recommandons d&#39;identifier le navire pendant qu&#39;il est encore intact dans l&#39;animal avant dissection it out. </li><li> Remplissez les canules de verre dans la chambre myographe de pression (DMT modèle 110P 11P et la version 1.31, Figure 2) avec une solution HEPES-PSS à l&#39;aide d&#39;une seringue de 10 ml à travers soupapes d&#39;admission et de sortie. Le remplissage de la canule doit être fait soigneusement que la pression excessive peut endommager le capteur fragile connecté à canules. Après avoir rempli canules fermer les deux soupapes d&#39;admission et de sortie bien. </li><li> Monter une extrémité de la cuve sur une canule droite et l&#39;attacher soigneusement avec un brin amende de suture de nylon. Avec l&#39;aide d&#39;une seringue, rincer et remplir le réservoir avec une solution HEPES par la soupape d&#39;admission. Porter à la canule gauche près de la cuve et monter l&#39;autre extrémité du récipient sur celui-ci. Attachez avec suture de nylon. Remplirla chambre avec un maximum de 10 ml avec une solution HEPES. Arrivée de la fuite en poussant doucement solution HEPES via la vanne d&#39;entrée à l&#39;aide d&#39;une seringue. </li><li> Installation de la chambre sur le myographe et en vertu de la caméra vidéo. Commencez l&#39;oxygène et de la chaleur (37 ° C) dans la chambre. Raccorder la soupape d&#39;admission avec un tube P1 à partir du premier réservoir de solution tampon HEPES, tandis que la soupape est fermée. Soit une bulle et passe de la solution dans le tube jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles dans le tube. Ouvrez la vanne. </li><li> Raccorder la soupape gauche de la chambre avec le tube P2 provenant de régulateur de pression. Encore une fois vérifier toutes les bulles. Il ne devrait pas y avoir de bulles ou de fuite dans le système. </li><li> Allez dans le menu de la pression sur le panneau myo-interface ou dans le logiciel et mettre la pompe en tournant le débit. </li><li> Ouvrez le programme et cliquez sur Collecter. Navire devrait être visible à l&#39;écran maintenant (Figure 3). Le navire est visualisée à l&#39;aide d&#39;une caméra montée sur un microscope, ce qui permet monitoring et l&#39;analyse de la lumière du vaisseau, le diamètre du vaisseau, et l&#39;épaisseur de paroi. </li><li> Augmenter progressivement la pression interluminal via la soupape de P1 en sélectionnant la pression P1 dans le panneau myo-interface ou dans le programme et entrez la valeur de pression comme suit: 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Navire tend parfois à se tordre ou convoluer alors que la pression augmente, ajuster la tension ou de la souche en conséquence avec l&#39;aide de micropositionneur verticale ou longitudinale (Figure 2). Equilibrer la cuve à 60 mm Hg et 37 ° C au moins pendant 45 minutes. Changer la solution de bain une fois avec HEPES préchauffées pendant l&#39;équilibrage. </li><li> Appliquer 10 ml d&#39;une solution de KCl dépolarisant, préchauffée à 37 ° C, au bain de dépolariser entièrement les cellules musculaires lisses et de réaliser une constriction maximale. Après constriction stable, rincer le bain avec une solution HEPES 3 fois toutes les 10 min. </li><li> Vérifier la viabilité du navire et de l&#39;intégrité de l&#39;endothélium par la stabilité et la reproductionréponses Ible à l&#39;ajout de phényléphrine (10 -5 M) et l&#39;acétylcholine (10 -5 M). Rincer 3 fois avec une solution HEPES toutes les 10 min. </li><li> Ajouter phényléphrine (10 -5 M) à preconstrict le navire, et quand une constriction stable a été obtenu, effectuer une courbe de concentration-réponse cumulative vasodilatation (CRC) par l&#39;addition successive de doses croissantes d&#39;acétylcholine (10 -9, 3 x 10 - 9, 10 -8, 3 x 10 -8, 10 -7, 3 x 10 -7, 10 -6, 3 x 10 -6 et 10 -5 M). Après la dernière dose, rincer 3 fois avec une solution HEPES toutes les 10 min avant de commencer nouveau CRC. </li><li> Déterminer le diamètre de la lumière passive en appliquant Ca 2 + PSS-libres contenant 2 mM EGTA. De l&#39;tracés enregistrée mesurer le diamètre du flux lumineux pour chaque dose-réponse (figure 4), qui sera utilisé pour le calcul de tous les paramètres. </li><li> Exprimez toutes les réponses de relaxation à l&#39;acétylcholine comme percchangement entage en diamètre de la lumière après preconstriction de phényléphrine par rapport à la différence entre le diamètre sans calcium et le diamètre, après la constriction à la phényléphrine, en utilisant l&#39;équation suivante: </li><li> Pourcentage dilatation = 100% x [(D x - D i) / (D Ca-libre - D i)], où D est le diamètre de la lumière mesurée et x, i, et Ca sans désigner diamètres artériels à chaque dose d&#39;agoniste (x), suivant initial de diamètre phényléphrine constriction (i), et Ca 2 + tampon frais (Ca-free). </li></ol> 5. Analyse statistique Toutes les mesures continues sont exprimées en moyenne ± SEM. La réactivité vasculaire dans les artères mésentériques est analysé par mesures répétées ANOVA à deux voies. Dans tous les cas, P &lt;0,05 est considérée comme statistiquement significative.

<ol><li>Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+artery+contraction+and+relaxation+studies+using+automated+wire+myography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+.Exp%22%5BJournal%5D)">Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography.</a> J. Vis .Exp. (55), e3119(2011).</li>
<li>Arribas, S. M., Daly, C. J., McGrath, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+vascular+remodeling+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurements of vascular remodeling by confocal microscopy.</a> Methods Enzymol. 307, 246-273 (1999).</li>
<li>Lei, C., Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+Nitric+Oxide+Attenuates+the+Adverse+Effects+of+Transfusing+Stored+Syngeneic+Erythrocytes+in+Mice+with+Endothelial+Dysfunction+after+Hemorrhagic+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Inhaled Nitric Oxide Attenuates the Adverse Effects of Transfusing Stored Syngeneic Erythrocytes in Mice with Endothelial Dysfunction after Hemorrhagic Shock.</a> Anesthesiology. , (2012).</li>
<li>Buys, E. S., Cauwels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sGC%CE%B11%CE%B21+attenuates+cardiac+dysfunction+and+mortality+in+murine+inflammatory+shock+models%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">sGCα1β1 attenuates cardiac dysfunction and mortality in murine inflammatory shock models.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297 (2), H654-H663 (2009).</li>
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<li>Buys, E. S., Raher, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modifiers+of+hypertension+in+soluble+guanylate+cyclase+alpha1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic modifiers of hypertension in soluble guanylate cyclase alpha1-deficient mice.</a> J. Clin. Invest. 122 (6), 2316-2325 (2012).</li>
<li>Kauffenstein, G., Laher, I., Matrougui, K., Guerineau, N. C., Henrion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+G+protein-coupled+receptors+in+microvascular+myogenic+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging role of G protein-coupled receptors in microvascular myogenic tone.</a> Cardiovascular Research. 95 (2), 223-232 (2012).</li>
<li>Ruilope, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertension+in+2010%3A+Blood+pressure+and+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Hypertension in 2010: Blood pressure and the kidney.</a> Nat. Rev. Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).</li>
<li>Michael, S. K., Surks, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+blood+pressure+arising+from+a+defect+in+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High blood pressure arising from a defect in vascular function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (18), 6702-6707 (2008).</li>
<li>Mendelsohn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+hypertension%2C+the+kidney+is+not+always+the+heart+of+the+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">In hypertension, the kidney is not always the heart of the matter.</a> J. Clin. Invest. 115 (4), 840-844 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les souris sont le modèle expérimental de choix pour de nombreux chercheurs, en partie en raison de la possibilité d&#39;introduire des modifications génétiques, générant ainsi des modèles de souris pour la physiopathologie humaine. Le statut vasoactif de faible résistance, mais pas de grands navires de conduit définit en grande partie la régulation du flux sanguin dans le système vasculaire 11. La taille des artères de résistance chez les petits animaux comme les souris, empêche l&#39;utilisation d&#39;un my...

systèmes de myographe de pression sont utilisés pour mesurer la fonction physiologique et les propriétés des petites artères, veines et autres vaisseaux. Une petite partie intacte d&#39;une artère ou veine est monté sur deux petites canules en verre et mise sous pression à une pression intracavitaire appropriée, permettant à la cuve pour maintenir l&#39;essentiel de son en caractéristiques in vivo (figures 1 et 2). L&#39;état physiologique près dans un myographe de pression reflète le comportement in vivo du lit vasculaire, ce qui permet l&#39;étude des propriétés intrinsèques (par exemple tonus myogène) des navires isolés. Parmi les avantages de myographie de pression sur myographie de fil, où la contraction musculaire est évaluée par couplage mécanique direct à un capteur de force 1, y compris (i) que les micro-artères de résistance, qui définissent la résistance globale développée dans le système vasculaire, peuvent être étudiés, alors que myographe de fil est limitée à de plus grandes artères de conduit, (ii) tchapeau le risque d&#39;endommager l&#39;endothélium est réduite car aucun des fils doivent être passés par la lumière du vaisseau, (iii) que la forme naturelle de la cuve est mieux maintenu, et (iv) la dimension du navire peut être étudié à un large éventail de pressions ou des contraintes de cisaillement 2. L&#39;étude de micro-vaisseaux peut être plus instructif que d&#39;étudier les grandes artères de conduite pour aider à comprendre les mécanismes physiopathologiques et moléculaires qui contribuent à la tonicité vasculaire altérée dans les maladies cardiovasculaires comme l&#39;hypertension. Par exemple, altération de la fonction endothéliale associée à l&#39;alimentation des souris un régime riche en graisses pendant 8 semaines a pu être démontrée dans 2 nd ordre artères mésentériques 3 mais pas dans les anneaux aortiques (figure 3). Un autre avantage de myographie de pression, c&#39;est que la constriction myogénique intrinsèque de la cuve sous pression est présente, et que le rôle et la fonction de l&#39;endothélium dans ce phénomène peut être étudié. Ici, nous descrBIE l&#39;utilisation d&#39;un myographe de pression pour étudier la réactivité vasculaire des souris mésentériques ordre 3 artères de résistance dans un contexte de l&#39;oxyde nitrique avec facultés affaiblies (NO)-cGMP de signalisation.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 </td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Phényléphrine</td><td>Acros Organics</td><td>AC20724</td><td></td></tr><tr><td>Acétylcholine</td><td>Sigma</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>Système de myographe de pression</td><td>DMT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluer murin fonction artère résistance à l&#39;aide myographie de pression

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

systèmes de myographe de pression sont extraordinairement utile dans l&#39;évaluation fonctionnelle des petites artères, sous pression à une pression transmurale approprié. L&#39;état physiologique près réalisés dans myographie de pression permet la caractérisation en profondeur des réponses intrinsèques aux stimuli pharmacologiques et physiologiques qui peuvent être extrapolés à l&#39;comportement in vivo du lit vasculaire. myographe de pression a plusieurs avantages sur myographs de fils classiques. Par exemple, les navires de moindre résistance peuvent être étudiés à des pressions intraluminaux étroitement contrôlés et physiologiquement pertinents. Ici, nous étudions la possibilité de 3ème artères mésentériques de commande (3-4 mm de long), précontractés avec la phényléphrine, à vaso-relax en réponse à l&#39;acétylcholine. Artères mésentériques sont montés sur deux canules connectées à un système sous pression et étanche qui est maintenue à une pression constante de 60 mmHg. Le diamètre de la lumière et extérieure de la cuve sont continuously enregistré en utilisant une caméra vidéo, permettant la quantification en temps réel de la vasoconstriction et vasorelaxation en réponse à la phényléphrine et l&#39;acétylcholine, respectivement. Pour démontrer l&#39;applicabilité de myographie de pression pour étudier l&#39;étiologie des maladies cardiovasculaires, nous avons évalué la fonction vasculaire dépendant de l&#39;endothélium dans un modèle murin de l&#39;hypertension systémique. Les souris déficientes en une sous-unité α de la guanylate cyclase soluble (sGCα 1 - / -) sont hypertendus quand sur un (S6) de fond 129S6 (sGCα une -/-S6) mais pas lorsque les souris C57BL / 6 (B6) de fond (sGCα une -/-B6). Utiliser myographie de pression, nous démontrons que sGCα résultats 1 à la carence en déficience vasorelaxation endothélium-dépendante. La dysfonction vasculaire est plus prononcée dans sGCα 1 -/-S6 que dans sGCα 1 -/-B6 souris, probablement contributing de la pression artérielle plus élevée dans une sGCα -/-S6 que dans sGCα -/-B6 une souris. myographie de pression est une technique relativement simple, mais sensible et mécaniste utile qui peut être utilisé pour évaluer l&#39;effet de divers stimuli sur la contraction et la relaxation vasculaire, augmentant ainsi notre compréhension des mécanismes qui sous-tendent les maladies cardiovasculaires.

NO joue un rôle central dans le maintien de l&#39;homéostasie de la pression artérielle à la fois chez l&#39;homme et 6 dans des modèles animaux 7. La capacité du NO à contrôler vasculaire relaxation des muscles lisses est médiée par la guanylate cyclase soluble (CGT), une enzyme hétérodimérique hème contenant qui génère cGMP 8. Récemment, une modificateurs de pression variant génétique du sang a été identifié dans un lieu qui contient le sGCα 1 et 1 gènes sGCβ, ill...

Dans myographie de pression, un petit segment intact d&#39;un navire est montée sur deux petites canules et mis sous pression à une pression intracavitaire approprié. Ici, nous décrivons la méthode pour mesurer la réponse de vasorelaxation de la souris 3<sup&gt; Rd</sup&gt; Commander artères mésentériques dans c57 et sGCα<sub&gt; 1</sub<sup&gt; - / -</sup&gt; Souris en utilisant myographie de pression.

Évaluer murin Fonction Artère résistance à l&#39;aide myographie de pression

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer la réactivité vasculaire en temps réel d'une artère de résistance chez la souris in vitro dans des conditions proches des conditions physiologiques. Cela est réalisé en montant un petit segment du vaisseau sur deux canules microscopiques et en maintenant une pression intraluminale physiologique. Le vaisseau est ensuite contracté à l'aide d'un agoniste des récepteurs alpha-1, la phényléphrine, afin d'étudier la capacité d'un médicament quelconque à provoquer la dilatation du vaisseau.La mise en déficit du vaisseau constricté par l'acétylcholine évalue sa capacité à se dilater en temps réel par un mécanisme dépendant de l'endothélium. Les résultats montrent le pourcentage de variation du diamètre de la lumière en réponse à l'acétylcholine et confirment qu'une déficience en SGC alpha un entraîne une vasodilatation dépendante de l'endothélium altérée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la mammographie par fil, est que la mammographie sous pression permet la caractérisation de petits vaisseaux microscopiques, qui sont plus impliqués dans le maintien de l'homéostasie de la pression artérielle que les vaisseaux conducteurs de plus grande taille.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiovasculaire, comme l'hypertension, où les vaisseaux macroscopiques résistants jouent un rôle critique. Commencez par euthanasier une souris à l'aide de pentobarbital. Ouvrez ensuite la cavité abdominale et commencez à disséquer le tissu mésentérique.Identifiez maintenant une artère mésentérique de troisième ordre et isolez-la du tissu conjonctif et adipeux. La distinction entre artères et veines au niveau des microvaisseaux est problématique lorsqu'il n'y a pas de sang dans les vaisseaux. Il est donc préférable de réaliser cette étape sur un animal intact.Ensuite, découpez un segment de deux à trois millimètres de longueur d'une artère mésentérique de troisième ordre et placez-le dans une boîte contenant du tampon PSS. Le segment artériel ne doit pas contenir de branchement.Préparez la chambre myo en remplissant délicatement les canules par les vannes d'entrée et de sortie avec une solution PSS à l'aide d'une seringue de 10 millilitres. Veillez à ne pas exercer une pression excessive, qui pourrait endommager le transducteur fragile relié aux canules. Une fois les canules remplies complètement, fermez les deux vannes. Transférez ensuite le segment artériel isolé dans la chambre et fixez une extrémité du vaisseau sur la canule droite.Attachez-le soigneusement à l’aide d’un fin brin de suture en nylon en utilisant une seringue pour rincer et remplir le vaisseau avec la solution heap par la vanne d’entrée. Fixez maintenant l’autre extrémité du vaisseau sur la canule gauche et sécurisez la canule au vaisseau à l’aide de la suture en nylon. Remplissez la chambre avec jusqu’à 10 millilitres de solution heap.Vérifiez les fuites en poussant doucement la solution de perfusion par la vanne d'entrée à l’aide d’une seringue. Placez ensuite la chambre sous la caméra vidéo. Démarrez l’apport d’oxygène et chauffez la chambre à 37 degrés Celsius tandis que la vanne d’entrée est fermée et reliée au tube P1 du réservoir de la première solution de perfusion.Laisser toute bulle et solution traverser le tube jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de bulles dans le tube. Ouvrir ensuite la vanne. Connecter à la vanne gauche de la chambre avec le tube P deux.En provenance du régulateur de pression, vérifiez qu’il n’y a pas de bulles ou de fuites dans l’ensemble du système. Accédez au menu de pression sur le panneau d’interface de myo ou dans le logiciel, puis activez la pompe tout en désactivant le débit. Ouvrez le programme et cliquez sur collecter.La surveillance et l'analyse du diamètre de la lumière du vaisseau et de l'épaisseur de la paroi sont désormais possibles. Pour augmenter progressivement la pression intraluminale, sélectionnez la pression P1 et saisissez une séquence de pressions croissantes. Des valeurs allant de cinq à 60 millimètres de mercure peuvent entraîner un torsionnement ou une convolution des vaisseaux pendant l'augmentation de la pression ; ajustez donc la tension ou la déformation en conséquence à l’aide d’un micropositionneur vertical ou longitudinal.Une fois que la pression atteint 60 millimètres et que le bain est à 37 degrés Celsius, équilibrez le vaisseau pendant au moins 45 minutes et jusqu'à une heure au cours de la période d'équilibre. Remplacez la solution du bain une fois par des solutions préchauffées. Maintenant que la section artérielle est équilibrée, appliquez 10 millilitres de solution dépolarisante de chlorure de potassium à 37 degrés Celsius.Le muscle lisse se dépolarisera complètement et atteindra une constriction maximale. Après avoir obtenu une constriction stable, rincez le bain trois fois avec la solution de Ringer-Hepes à des intervalles de 10 minutes. Vérifiez maintenant la viabilité du vaisseau et l'intégrité de l'endothélium.Tout d'abord, préconstrictez le vaisseau en ajoutant de la phényléphrine à une concentration finale de 10⁻⁵ moles par litre. Une fois qu'une constriction stable est obtenue, réalisez une courbe de réponse vasodilatatrice en concentration cumulative par addition séquentielle de doses croissantes d'acétylcholine, allant de 10⁻⁹ à 10⁻⁵ moles par litre. Après la dernière dose d'acétylcholine, rincez le prélèvement trois fois avec du liquide de HEPES, à des intervalles de 10 minutes.Déterminez maintenant le diamètre passif de la lumière en appliquant une solution saline PSS sans calcium contenant deux millimoles par litre d'EGTA à partir des enregistrements obtenus. Mesurez le diamètre de la lumière pour chaque réponse à la dose, qui sera utilisé pour calculer tous les paramètres. Exprimez la réponse de relaxation à l'acétylcholine comme une comparaison entre le traitement avec l'agoniste et le tampon sans calcium, en fonction de la modification induite sur le diamètre de la lumière par rapport à la constriction provoquée par la phényléphrine.La myographie en pression a été utilisée pour étudier la relaxation vasculaire en réponse à l'acétylcholine dans des artères mésentériques de résistance isolées de souris de type sauvage et de souris déficientes en SGC alpha un, sur fond génétique S six et black six, et pré-construites à la phényléphrine. Le déficit en SGC alpha un était associé à une capacité réduite de l'acétylcholine à induire la relaxation vasculaire, indépendamment du fond génétique des souris étudiées. Toutefois, la relaxation dépendante de l'endothélium chez les souris nulles pour SGC alpha un était plus fortement altérée sur fond génétique S six que sur fond black six.Ensemble, ces résultats suggèrent que la sensibilité réduite de la vascularisation à la relaxation dépendante de l'endothélium pourrait contribuer à l'hypertension spécifique à la souche chez les souris knock-out pour la sous-unité alpha 1 de la GC. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux heures si elle est effectuée correctement. En complément de cette procédure, d'autres méthodes telles que la microscopie confocale peuvent être réalisées simultanément sur les vaisseaux sanguins vivants. Cela permettrait, par exemple, de mesurer les concentrations intracellulaires de fer, ce qui pourrait aider à identifier les mécanismes de signalisation sous-jacents.

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