Une méthode à haut débit pour la mesure de débit de filtration glomérulaire chez des souris conscientes

L’objectif global de cette procédure est de montrer à d’autres chercheurs comment déterminer la fonction rénale chez les souris éveillées. Ceci est accompli en dialysant d’abord l’isothiocyanate de fluorescéine ou l’inuline FSE pendant 24 heures et en déterminant sa concentration pour injection. La deuxième étape consiste à peser la souris, à préparer des volumes précis d’inuline fitzy pour l’injection rétrobulbaire et à anesthésier la souris.

Ensuite, l’injection d’inuline Retrobulbbar Fitzy est effectuée et huit échantillons de sang sont prélevés sur une période de 75 minutes. La dernière étape consiste à mesurer Fitz Nulin à l’aide d’un spectromètre fluoré à microvolume et à calculer la fonction rénale à l’aide d’un modèle de décroissance exponentielle à deux phases. En fin de compte, la combinaison de la sensibilité de la méthode d’injection en bolus unique Fiti Nulin avec la capacité de micro-volume du spectromètre fluoré permet de détecter les différences de fonction rénale causées par des modifications génétiques chez la souris, des changements alimentaires ou des applications médicamenteuses.

Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la perfusion continue et les conditions anesthésiées, l’implantation de mini-pompes osmotiques utilisant de l’inuline radioactive sont qu’aucune intervention chirurgicale n’est nécessaire. Il ne s’agit pas d’une expérience finale. Il n’est pas nécessaire de prélever de l’urine et il est possible de mesurer jusqu’à 24 M par jour.

Je vais faire la démonstration de cette procédure avec Maria Azimo, une associée de recherche de mon laboratoire, pour préparer la solution d’injection de Fitzy Nulin. Pesez suffisamment d’inuline ZI pour deux millilitres d’une solution à 5 %, dissolvez l’inuline marquée dans une solution de chlorure de sodium à 0,85 % en chauffant à 90 degrés Celsius jusqu’à dissolution complète. Placez un morceau de membrane de dialyse de 20 centimètres dans de l’eau distillée deux fois pendant 30 minutes pour éliminer l’acide sodium résiduel de la membrane, rincez la membrane plusieurs fois par la suite, remplissez la membrane de dialyse avec de l’inuline dissoute correctement avec des fermetures, puis pesez toute la membrane.

Laissez l’inuline fitzy dissoute dialyser dans un litre de solution de chlorure de sodium à 0,85 % et agitez lentement à l’abri de la lumière pendant 24 heures à température ambiante après la dialyse, pesez à nouveau toute la membrane de dialyse et calculez la nouvelle concentration. L’eau se déplacera osmotiquement dans la membrane et le FSI non lié sortira de la membrane. Ainsi, la concentration d’inuline FSI diminuera considérablement.

Calculez la concentration de new fit e inuline à l’aide de cette formule où C est la nouvelle concentration. N est la quantité initiale d’inuline E, et V est le nouveau volume, qui est la différence de poids de la tubulure de dialyse avant et après la dialyse, plus le volume de la solution initiale d’inuline fitzy. Ensuite, stérilisez la solution dialysée par filtration à travers un filtre de seringue de 0,22 micron.

N’oubliez pas de toujours garder l’inuline à l’abri de la lumière pour éviter le photoblanchiment avant l’expérience. Prenez le poids corporel des souris après les avoir anesthésiées brièvement avec 4 à 5 % de fluor ISO. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par réflexe toïn, aspirez deux microlitres par gramme de poids corporel de nulin fitzy dialysé à l’aide d’une seringue Hamilton de 100 microlitres avec une aiguille d’un demi-pouce de long de calibre 26 pour éliminer les bulles d’air, puis passez à une aiguille d’un demi-pouce de long de calibre 30 pour l’injection.

Procédez à l’injection de l’inuline fitzy dialysée dans le plexus rétroorbitaire. Permettez aux souris de récupérer spontanément dans leur cage domestique. Coupez une fois un millimètre de queue de souris avec des ciseaux et collectez du sang à plusieurs moments après l’injection dans des mini-capillaires d’héparine de sodium.

Scellez les mini-capillaires après le prélèvement sanguin avec cha seal et protégez les échantillons de la lumière. Placez les mini-capillaires scellés dans les capillaires d’hématocrite et centrifugez-les pendant cinq minutes après la centrifugation. Cassez les mini-capillaires à l’aide d’un coupe-diamant et transférez tout le plasma par pipetage dans un tube de 0,2 millilitre.

Faites une dilution de un à 10 en utilisant deux microlitres de plasma et 18 microlitres de 0,5 mole par litre dans un nouveau tube de 0,2 millilitre. Ensuite, mesurez deux microlitres de l’échantillon dilué avec le NanoDrop 3, 300 en doubles pour un débit élevé de six souris. Veuillez suivre le protocole d’organigramme fourni dans le protocole textuel pour mesurer le DFG du rein entier par la méthode d’injection unique en bolus : huit échantillons de sang doivent être prélevés à 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 et 75 minutes après l’injection de nuline FSE.

Dans cet organigramme, les chiffres indiquent les points de temps de collecte tandis que les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre d’échantillons, les points de temps à gauche de la ligne rouge verticale indiquent les points de temps d’injection. Chaque souris est marquée d’une couleur différente. Pour obtenir des prélèvements sanguins séquentiels, suivez les flèches.

Les cases grises indiquent quand la souris suivante doit être préparée pour l’anesthésie au fluor avant l’injection à l’aide de ce protocole. Le temps minimum entre deux prélèvements sanguins de souris différentes est d’une minute de solution injectable de nulin dilué avec du plasma de souris dilué pour obtenir les dilutions standard énumérées dans le protocole de texte. La concentration des étalons dépendra de la dialyse et sera toujours différente pour chaque préparation de nuline FSI.

Par conséquent, il est nécessaire d’entrer la concentration de la courbe standard à chaque fois. Analysez les données pour calculer le débit de filtration glomérulaire ou DFG avec un logiciel approprié en utilisant une fonction de décroissance exponentielle diphasique comme décrit en détail dans le protocole de texte pour mesurer le DFG chez les souris conscientes. La cinétique plasmatique de l’inuline ZI après une injection intraveineuse à dose unique est utilisée pour le calcul de la GFRA, le modèle à deux compartiments est utilisé dans le modèle à deux compartiments.

La phase initiale de décomposition rapide représente la redistribution de l’inuline du compartiment intravasculaire vers le liquide extracellulaire. La phase ultérieure avec une décomposition plus lente de la concentration d’inuline en forme reflète principalement la clairance systémique du plasma. Le diabète sucré de type 1 a été induit par l’application intrapéritonéale de streptozotocine.

Le DFG a été déterminé avant et cinq semaines après l’induction du diabète Les animaux diabétiques de type 1 présentent clairement une hyperfiltration glomérulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer le DFG chez une grosse souris en utilisant une technique d’injection en bolus unique et en utilisant un modèle DK exponentiel à deux phases.