Name: Une In vitro Modèle pour étudier lhétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Apprenez à isoler des monocytes du sang périphérique humain et à les différencier en macrophages polarisés. Cette méthode utilise la centrifugation en gradient de densité et l'isolement par billes négatives pour étudier la polarisation cellulaire.

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Nous remercions Wambsganss Nadine pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) et en partie par une subvention du Fonds d&#39;innovation FRONTIER (Université de Heidelberg) à CAG

1. Protocole <ol><li> Préparation des tampons comme suit: <ol><li> Préparer tampon pour l&#39;isolation des PBMC: «Lavez-tampon&quot; = 0,02% d&#39;EDTA dans du PBS (utilisation d&#39;EDTA 0,5 M). </li><li> Préparer tampon pour l&#39;isolement des monocytes: &quot;tampon de rinçage MACS&quot; = 0,5% de BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 pi) + PBS (50 ml). Degas la mémoire tampon. </li><li> Préparer tampon pour FACS coloration et le stockage des cellules: «tampon FACS&quot; = 10% FCS dans du PBS et «tampon de fixation&quot; = 1% PFA dans du PBS. </li></ol></li><li> Dessinez 30 ml de sang dans une veine de l&#39;avant-bras. Utilisation de l&#39;EDTA comme anticoagulant. </li><li> Isoler CMSP (histopaque) comme suit: <ol><li> Préparer deux tubes de 50 ml stériles (pas de poly-styrène). </li><li> Diluer le sang à partir de l&#39;étape 2 avec PBS 1:1. </li><li> Ajouter 25 ml + 25 ml histopaque de sang total / PBS par tube. Assurez-vous que histopaque et le sang ne se mélangent pas. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante, pas de frein. </li><li> Aspirer plasma et le jeter. </li><li> Aspirer l&#39;interface opaque et pipette en propre de 50 ml baine. </li><li> Ajouter 20 ml d&#39;EDTA 0,02% en PBS. </li><li> Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Rejeter le surnageant. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;EDTA 0,02% en PBS. </li></ol></li><li> Compter les cellules comme suit: <ol><li> Bien mélanger au vortex pendant 10 secondes. </li><li> Prenez 200 pi suspension cellulaire + 300 pl EDTA 0,02% en PBS + 500 pi de bleu Trypan (200-500 cellules/10 places, sinon changer le facteur de dilution). </li></ol></li><li> Effectuer isolement négatif de monocytes comme suit: <ol><li> Centrifuger les cellules obtenues à l&#39;étape 3.10 pour 10 min, 120 x g. Rejeter le surnageant. </li><li> Laver le culot cellulaire 2x en ajoutant 10 ml de PBS + 0,02% EDTA et centrifuger pendant 10 min, 120 x g. </li><li> Ajouter 9 ml d&#39;eau stérile pendant 3 secondes, ajouter 1 ml PBS 10X. </li><li> Laver une fois de plus avec PBS + 0,02% EDTA et centrifuger 10 min, 120 x g. </li><li> Comptez pendant la centrifugation. </li><li> Diluer dans le tampon EasySep à 5 x 10 7 / ml. </li><li> Ajouter 50 pl / ml robinet d&#39;enrichissement monocytesqueue. </li><li> Incuber pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Perles Vortex pendant 30 sec. </li><li> Ajouter 50 perles pl / ml. </li><li> Incuber pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Remplir avec un tampon EasySep à compléter volume de 2,5 ml. La solution semble maintenant brunâtre. </li><li> Mettre en aimant. </li><li> Attendez 2,5 min à température ambiante. Pendant ce temps, les cellules monocytaires non liés à la bille magnétique se déplaceront sur la paroi du tube et y coller. </li><li> Verser tampon avec des monocytes non contraignants dans le tube stérile frais. Cette solution est blanchâtre. </li><li> Laver une fois avec PBS + 0,02% EDTA et centrifuger pendant 10 min, 120 x g. </li></ol></li><li> Cellules de la plaque dans un récipient de plastique ou d&#39;une plaque multi-parois à une densité de 0,5 x 10 6 / cm 2. Ajouter 1 ml de milieu de culture / 1 x 10 6 cellules. </li><li> cellules de culture dans des conditions d&#39;intérêt pour les 6-14 jours. </li><li> Changer médias après 3 jours en remplaçant 50% des médias avec les médias frais (voir le tableau 1 pour plus de détails). </li><li>Après six jours Récolte des cellules pour l&#39;isolement de l&#39;ARNm, la cytométrie en flux, Western blot, etc. </li></ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont pas à divulguer tout conflit d&#39;intérêt.

Les macrophages dérivés des monocytes représentent le type de cellule clé du système immunitaire innée. Ils jouent un rôle important dans de nombreuses maladies inflammatoires, y compris l&#39;athérosclérose ou le cancer 2. Ainsi, l&#39;étude de la biologie des macrophages est essentielle pour accroître nos connaissances sur la physiopathologie de nombreuses maladies et de permettre le développement de nouvelles thérapies. De nombreuses études s&#39;appliquent des souris surexprim...

Macrophages dérivés de monocytes représentent un composant cellulaire importante du système immunitaire inné et de contribuer à de nombreux processus inflammatoires aigus ou chroniques 1. Les macrophages jouent un rôle important dans de nombreuses maladies inflammatoires comme l&#39;athérosclérose ou le cancer 2. Macrophages montrent un haut degré de plasticité et sont en mesure d&#39;assumer des phénotypes différents en fonction de la micromilieu locale 3. Ainsi, l&#39;étude de la différenciation des macrophages et l&#39;hétérogénéité est essentielle pour accroître notre connaissance de la physiopathologie de nombreuses maladies et de permettre l&#39;identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouvelles thérapies. Dans de nombreux cas, les modèles murins sont utilisées pour étudier la physiopathologie des maladies spécifiques. Cependant, des études de biologie des macrophages en utilisant des modèles de souris est accompagné de plusieurs lacunes: (1) la proportion de numéros de sous-ensembles de leucocytes (c.-à-monocytes et granulocytes) dans peripheral sang de souris ou l&#39;homme diffère de manière significative suggérant différents rôles des monocytes dans la physiopathologie murin et humain. (2) Il existe des différences considérables dans l&#39;expression des gènes entre les monocytes du sang périphérique humain et murin suggérant des différences substantielles dans leur fonction pendant la santé et la maladie 4. (3) Un certain nombre de marqueurs qui sont utilisés pour identifier les monocytes et les macrophages (F4/80, Lyc, etc.) Murines n&#39;existe pas dans les cellules myéloïdes humaines, ce qui rend le transfert des résultats dans des modèles murins de la situation humaine difficile. Ainsi, afin d&#39;accroître notre compréhension de la différenciation des macrophages et l&#39;hétérogénéité dans les maladies humaines, nous avons besoin de faire usage de modèles de travail avec les macrophages humains. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle de production de macrophages primaires humain qui est facile à utiliser et permet d&#39;étudier les macrophages dérivés de monocytes humains in vitro dans des conditions différentes résultant en différents macrophage potypes de risation. Dans plusieurs études, nous avons utilisé le modèle in vitro de dérivés de monocytes macrophages humains primaires pour analyser la biologie des macrophages et son intérêt potentiel pour l&#39;athérosclérose humaine 5-7. Même s&#39;il n&#39;est pas entièrement remplacer les expérimentations animales ou tissus humains obtenus post mortem, le modèle décrit ici permet l&#39;identification et la validation des mécanismes de la maladie et de cibles thérapeutiques qui peuvent être très pertinents pour diverses maladies humaines.

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger de 50 ml (stérile)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X), liquide (sans calcium ni magnésium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit d’enrichissement de monocytes humains</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>humain M-CSF 10 &mu ; g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 6 puits</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

une<em&gt; in vitro</em&gt; modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Macrophages dérivés de monocytes représentent un type de cellules importantes du système immunitaire inné. Des modèles murins qui étudient la biologie des macrophages souffrent des différences phénotypiques et fonctionnels entre les macrophages dérivés de monocytes murins et humains. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle in vitro pour générer et étudier les macrophages humains primaires. En bref, après une centrifugation en gradient de densité du sang périphérique prélevé dans une veine de l&#39;avant-bras, les monocytes sont isolés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique en utilisant négative isolement bille magnétique. Ces monocytes sont ensuite cultivées pendant six jours dans des conditions propres à induire différents types de différenciation des macrophages ou de polarisation. Le modèle est facile à utiliser et évite les problèmes causés par les différences spécifiques entre la souris et l&#39;homme. En outre, il est plus proche de la conditions in vivo que l&#39;utilisation de lignées cellulaires immortalisées. En conclusion, le modèle décrit ici est adapté pour étudier macrophage biologie, identifier les mécanismes de la maladie et de nouvelles cibles thérapeutiques. Même s&#39;il n&#39;est pas entièrement remplacer les expérimentations animales ou tissus humains obtenus post mortem, le modèle décrit ici permet l&#39;identification et la validation des mécanismes de la maladie et de cibles thérapeutiques qui peuvent être très pertinents pour diverses maladies humaines.

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, on obtient systématiquement 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml de sang (moyenne ± écart-type de 26 expériences indépendantes, figure 1A). La pureté des monocytes, tel que déterminé par coloration de cytométrie en flux pour CD14 est systématiquement supérieure à 95% (97,1 ± 0,4%, moyenne ± écart-type de 3 expériences indépendantes, figure 1B). La viabilité cellulaire de monocytes fraîchement isolés, tel que détermin...

Macrophages dérivés de monocytes sont des cellules importantes du système immunitaire inné. Ici, nous décrivons un outil facile à utiliser<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour générer ces cellules. Utilisation de la centrifugation en gradient, l&#39;isolement bourrelet négative et des conditions de culture de cellules spécifiques, des macrophages dérivés des monocytes peuvent être générés pour les études phénotypiques et fonctionnelles.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’isoler les monocytes du sang périphérique humain et de les différencier en fonction de différents types de polarisation des macrophages. Ceci est réalisé en isolant d’abord les cellules mononucléées du sang périphérique humain par centrifugation à gradient de densité. Dans un deuxième temps, l’isolement des billes négatives est effectué pour obtenir des monocytes positifs CD 14 purs.Ensuite, les monocytes sont cultivés dans des conditions spécifiques afin d’induire des macrophages spécifiquement polarisés. En fin de compte, l’expression différentielle des marqueurs de polarisation des macrophages en réponse à leurs conditions de culture peut être déterminée par PCR quantitative. Cette méthode peut aider à disséquer la différenciation des macrophages vers différents types de polarisation.Une caractéristique extrêmement importante dans les maladies inflammatoires telles que l’athérosclérose. Après avoir prélevé 30 millilitres de sang total dans la veine de l’avant-bras d’un volontaire, divisez le sang uniformément en deux tubes coniques de 50 millilitres sans polystyrène. Diluez ensuite le sang dans chaque tube avec 10 millilitres de PBS.Ensuite, ajoutez 25 millilitres de histo pack aux 25 millilitres de sang total et de PBS dans chaque tube, en veillant à ce que le histo pack et le sang ne se mélangent pas. Ensuite, centrifugez les tubes pendant 30 minutes à 400 G et à température ambiante sans pause. Après l’essorage, aspirez d’abord la couche de plasma, puis transférez la couche d’interface opaque dans un tube frais de 50 millilitres.Lavez les cellules de l’interface dans 20 millilitres de PBS plus CDTA pendant cinq minutes à 250 G et quatre degrés Celsius. Ensuite, après avoir jeté le surnageant, suspendez la pastille dans 10 millilitres de PBS plus CDTA et mélangez bien les cellules en tourbillonnant pendant 10 secondes. Diluez maintenant 200 microlitres de suspension cellulaire dans 300 microlitres de PBS plus EDTA et 500 microlitres de triam blue.Pour obtenir environ 200 à 500 cellules par 10 carrés et un hémocytomètre, commencez l’isolement négatif en faisant tourner les cellules trois fois pendant 10 minutes à 120 G. Après le deuxième lavage, nous suspendons la pastille dans neuf millilitres d’eau stérile pendant trois secondes. Ajoutez ensuite un millilitre de 10 XPBS après avoir lavé et compté les cellules une fois de plus, diluez-les dans un tampon facile à régler à cinq fois 10 des sept cellules par millilitre. Maintenant, incubez les cellules pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans 50 microlitres par millilitre de cocktail d’enrichissement en monocytes.Pendant la dernière minute du vortex d’incubation, l’enrichissement en monocytes de l’eau perle pendant 30 secondes. Ajoutez ensuite 50 microlitres par millilitre de billes dans les cellules et incubez la bille en suspension cellulaire pendant encore cinq minutes. Après la deuxième incubation, portez le volume de la solution cellulaire à 2,5 millilitres.Avec plus de tampon eep, la solution apparaîtra maintenant d’une couleur brunâtre. Ensuite, placez le tube dans un aimant eep pendant deux minutes et demie à température ambiante. Une fois que les cellules liées aux billes ont eu la chance de coller, versez le tampon contenant les monocytes non liants dans un tube stérile frais.La solution prendra maintenant une couleur blanchâtre après avoir lavé les cellules non liées une fois avec du PBS plus de l’EDTA, transféré les cellules dans une plaque multi-puits, puis ajouté un millilitre de milieu de culture par un fois 10 aux six cellules dans la plaque de culture. Enfin, cultivez les cellules dans les conditions expérimentales d’intérêt pendant six jours pour induire la différenciation des macrophages. Remplacez la moitié du support après trois jours par un support frais après six jours.Récoltez les cellules pour l’analyse expérimentale souhaitée. En utilisant le protocole décrit ci-dessus, environ 25 fois 10 des six monocytes sont systématiquement obtenus à partir de 100 millilitres de pureté de monocytes sanguins, telle que déterminée par la coloration cytométrique en flux pour le CD 14, est régulièrement supérieure à 95 % lors de la première addition à la culture. Les monocytes sont d’abord de forme ronde et flottent en quelques heures.Cependant, ils adhèrent, leur donnant une apparence d’œuf au plat ou de fuseau après six jours. En culture avec du MCSF seul ou avec l’ajout de LDL oxydés pendant les dernières 24 heures, soit environ 80 % des cellules non exposées à des LDL oxydés sont viables, comme déterminé par l’iodure de propidium. Le traitement de coloration avec du LDL oxydé, en revanche, permet d’obtenir une viabilité cellulaire d’environ 70 % après six jours de culture.Avec le flux MCSF, l’analyse CYTOMÉTRIQUE démontre que pendant que les cellules continuent d’exprimer le marqueur leucocytaire CD 45 ro, elles régulent à la baisse le marqueur monocytaire CD 14. En fonction des conditions spécifiques qui peuvent induire la polarisation des macrophages pendant la culture cellulaire, des marqueurs supplémentaires sont nécessaires pour garantir une polarisation réussie. Des conditions spécifiques peuvent induire une polarisation des macrophages.Par exemple, les macrophages polarisés M1 expriment des marqueurs typiques tels que IL six et TNF alpha, tandis que les macrophages polarisés M deux expriment CD 36 et CD 2 0 6, les macrophages peuvent être étudiés plus en détail dans des expériences fonctionnelles. Par exemple, l’absorption des LDL oxydés peut être étudiée à l’aide de LDL marqués par fluorescence. Dans cette expérience, les cellules ont été exposées à 10 microgrammes par millilitre de LDL oxydé marqué DII pendant quatre heures, et les noyaux se sont colorés avec du dpi.L’histogramme montre la mesure par cytométrie en flux de l’absorption des LDL oxydés DII par les macrophages induits par MCSF, l’histogramme gris uni représentant les cellules témoins non traitées et l’histogramme ouvert noir. Représentant les macrophages oxydés traités au LDL après son développement. Cette technique permet aux chercheurs d’étudier la différenciation et l’hétérogénéité des macrophages humains.Il leur permet ainsi d’étudier des maladies inflammatoires telles que l’athérosclérose afin d’identifier de nouveaux mécanismes pathologiques et de nouvelles cibles thérapeutiques.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre l’amorçage des monocytes primaires dans les macrophages. Les monocytes humains primaires peuvent être isolés et différenciés en un phénotype pro-inflammatoire de type M1 à l’aide du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) ou en un phénotype anti-inflammatoire de type M2 à l’aide du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF).

Culture in vitro et différenciation des monocytes primaires en macrophages

Dans cette vidéo, nous démontrons une procédure pour induire la différenciation et la polarisation des monocytes dérivés du sang périphérique en macrophages M1 ou M2. L’incubation avec le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages, le lipopolysaccharide et l’interféron-gamma produit des macrophages M1 pro-inflammatoires, tandis que l’incubation avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages et l’interleukine-4 induit la production de macrophages M2...

Différenciation et polarisation de cellules dérivées de monocytes en cellules de type macrophage

L'article décrit une adaptation facile...

Enquête de la polarisation des macrophages aide de moelle osseuse macrophages dérivés

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d'immunofluorescence.

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

Ce protocole décrit la génération robuste de macrophages des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et les méthodes pour leur caractérisation ultérieure. L’expression de marqueur de surface de cellules, l’expression de gène, et les essais fonctionnels sont employés pour évaluer le phénotype et la fonction de ces macrophages iPSC-dérivés.

Production et caractérisation des macrophages humains à partir de cellules souches pluripotentes

Ce protocole fournit une méthode pour étudier l’infection de mycobactérie de tuberculose dans les macrophages humains M1- ou M2-polarisés basés sur la différenciation des monocytes périphériques de sang aux cellules macrophage-comme qui sont infectées par la souche virulente GFP-étiquetée H37Rv, et analysées avec la cytométrie de flux utilisant un panneau de 10 couleurs comprenant l’expression des marqueurs M1/M2 choisis.

Polarisation des cellules et analyses dérivées des monocytes humains M1 et M2 avec cytométrie du débit sur l’infection par mycobactérie tuberculeuse

Les macrophages associés aux tumeurs de type M2 (TAM) sont associés à la progression tumorale et à un mauvais pronostic dans le cancer. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier et polariser de manière reproductible les cellules monocytaires THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Ce modèle est la base pour étudier les effets anti-inflammatoires du TAM dans le microenvironnement tumoral.

Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain

Nous présentons ici un protocole détaillé d’évaluation du potentiel immunomodulateur des surfaces d’implants in vitro, dans le but d’améliorer la fiabilité et la reproductibilité des protocoles actuels et de promouvoir la poursuite des recherches. Les profils de cytokines sécrétoires, l’expression de l’ARNm et les marqueurs de surface cellulaire ont été surveillés à l’aide de macrophages dérivés de monocytes sanguins pour étudier la polarisation des macrophages cultivés sur du titane.

Polarisation et caractérisation de macrophages dérivés de monocytes humains M1 et M2 sur des surfaces d’implants 

Les monocytes et les macrophages sont des cellules immunitaires très plastiques et reprogrammables cruciales pour la santé et la maladie. Ils détectent et répondent à un large éventail de stimuli en adoptant des programmes de différenciation et des phénotypes spécifiques. Nous avons normalisé un modèle in vitro pour étudier la polarisation et la reprogrammation des macrophages, ce qui constitue un outil précieux pour la recherche.

Reprogrammation d’un modèle de macrophages dérivés de monocytes humains pour des essais in vitro

Apprenez à isoler des monocytes du sang périphérique humain et à les différencier en macrophages polarisés. Cette méthode utilise la centrifugation en gradient de densité et l'isolement par billes négatives pour étudier la polarisation cellulaire.

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