Une In vitro Modèle pour étudier l'hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

L’objectif général de l’expérience suivante est d’isoler les monocytes du sang périphérique humain et de les différencier en fonction de différents types de polarisation des macrophages. Ceci est réalisé en isolant d’abord les cellules mononucléées du sang périphérique humain par centrifugation à gradient de densité. Dans un deuxième temps, l’isolement des billes négatives est effectué pour obtenir des monocytes positifs CD 14 purs.

Ensuite, les monocytes sont cultivés dans des conditions spécifiques afin d’induire des macrophages spécifiquement polarisés. En fin de compte, l’expression différentielle des marqueurs de polarisation des macrophages en réponse à leurs conditions de culture peut être déterminée par PCR quantitative. Cette méthode peut aider à disséquer la différenciation des macrophages vers différents types de polarisation.

Une caractéristique extrêmement importante dans les maladies inflammatoires telles que l’athérosclérose. Après avoir prélevé 30 millilitres de sang total dans la veine de l’avant-bras d’un volontaire, divisez le sang uniformément en deux tubes coniques de 50 millilitres sans polystyrène. Diluez ensuite le sang dans chaque tube avec 10 millilitres de PBS.

Ensuite, ajoutez 25 millilitres de histo pack aux 25 millilitres de sang total et de PBS dans chaque tube, en veillant à ce que le histo pack et le sang ne se mélangent pas. Ensuite, centrifugez les tubes pendant 30 minutes à 400 G et à température ambiante sans pause. Après l’essorage, aspirez d’abord la couche de plasma, puis transférez la couche d’interface opaque dans un tube frais de 50 millilitres.

Lavez les cellules de l’interface dans 20 millilitres de PBS plus CDTA pendant cinq minutes à 250 G et quatre degrés Celsius. Ensuite, après avoir jeté le surnageant, suspendez la pastille dans 10 millilitres de PBS plus CDTA et mélangez bien les cellules en tourbillonnant pendant 10 secondes. Diluez maintenant 200 microlitres de suspension cellulaire dans 300 microlitres de PBS plus EDTA et 500 microlitres de triam blue.

Pour obtenir environ 200 à 500 cellules par 10 carrés et un hémocytomètre, commencez l’isolement négatif en faisant tourner les cellules trois fois pendant 10 minutes à 120 G. Après le deuxième lavage, nous suspendons la pastille dans neuf millilitres d’eau stérile pendant trois secondes. Ajoutez ensuite un millilitre de 10 XPBS après avoir lavé et compté les cellules une fois de plus, diluez-les dans un tampon facile à régler à cinq fois 10 des sept cellules par millilitre. Maintenant, incubez les cellules pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans 50 microlitres par millilitre de cocktail d’enrichissement en monocytes.

Pendant la dernière minute du vortex d’incubation, l’enrichissement en monocytes de l’eau perle pendant 30 secondes. Ajoutez ensuite 50 microlitres par millilitre de billes dans les cellules et incubez la bille en suspension cellulaire pendant encore cinq minutes. Après la deuxième incubation, portez le volume de la solution cellulaire à 2,5 millilitres.

Avec plus de tampon eep, la solution apparaîtra maintenant d’une couleur brunâtre. Ensuite, placez le tube dans un aimant eep pendant deux minutes et demie à température ambiante. Une fois que les cellules liées aux billes ont eu la chance de coller, versez le tampon contenant les monocytes non liants dans un tube stérile frais.

La solution prendra maintenant une couleur blanchâtre après avoir lavé les cellules non liées une fois avec du PBS plus de l’EDTA, transféré les cellules dans une plaque multi-puits, puis ajouté un millilitre de milieu de culture par un fois 10 aux six cellules dans la plaque de culture. Enfin, cultivez les cellules dans les conditions expérimentales d’intérêt pendant six jours pour induire la différenciation des macrophages. Remplacez la moitié du support après trois jours par un support frais après six jours.

Récoltez les cellules pour l’analyse expérimentale souhaitée. En utilisant le protocole décrit ci-dessus, environ 25 fois 10 des six monocytes sont systématiquement obtenus à partir de 100 millilitres de pureté de monocytes sanguins, telle que déterminée par la coloration cytométrique en flux pour le CD 14, est régulièrement supérieure à 95 % lors de la première addition à la culture. Les monocytes sont d’abord de forme ronde et flottent en quelques heures.

Cependant, ils adhèrent, leur donnant une apparence d’œuf au plat ou de fuseau après six jours. En culture avec du MCSF seul ou avec l’ajout de LDL oxydés pendant les dernières 24 heures, soit environ 80 % des cellules non exposées à des LDL oxydés sont viables, comme déterminé par l’iodure de propidium. Le traitement de coloration avec du LDL oxydé, en revanche, permet d’obtenir une viabilité cellulaire d’environ 70 % après six jours de culture.

Avec le flux MCSF, l’analyse CYTOMÉTRIQUE démontre que pendant que les cellules continuent d’exprimer le marqueur leucocytaire CD 45 ro, elles régulent à la baisse le marqueur monocytaire CD 14. En fonction des conditions spécifiques qui peuvent induire la polarisation des macrophages pendant la culture cellulaire, des marqueurs supplémentaires sont nécessaires pour garantir une polarisation réussie. Des conditions spécifiques peuvent induire une polarisation des macrophages.

Par exemple, les macrophages polarisés M1 expriment des marqueurs typiques tels que IL six et TNF alpha, tandis que les macrophages polarisés M deux expriment CD 36 et CD 2 0 6, les macrophages peuvent être étudiés plus en détail dans des expériences fonctionnelles. Par exemple, l’absorption des LDL oxydés peut être étudiée à l’aide de LDL marqués par fluorescence. Dans cette expérience, les cellules ont été exposées à 10 microgrammes par millilitre de LDL oxydé marqué DII pendant quatre heures, et les noyaux se sont colorés avec du dpi.

L’histogramme montre la mesure par cytométrie en flux de l’absorption des LDL oxydés DII par les macrophages induits par MCSF, l’histogramme gris uni représentant les cellules témoins non traitées et l’histogramme ouvert noir. Représentant les macrophages oxydés traités au LDL après son développement. Cette technique permet aux chercheurs d’étudier la différenciation et l’hétérogénéité des macrophages humains.

Il leur permet ainsi d’étudier des maladies inflammatoires telles que l’athérosclérose afin d’identifier de nouveaux mécanismes pathologiques et de nouvelles cibles thérapeutiques.