Name: Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez l'assemblage de tableaux nucléosomiques avec des histones recombinantes et de l'ADN positionnant. Cette méthode utilise la sédimentation et la microscopie à force atomique pour évaluer la saturation et la structure chromatinienne.

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Ce travail a été soutenu par le NIH subventions GM45916 et GM66834 à JCH et une bourse de la Fondation internationale pour le syndrome de Rett AK Ce travail a également été soutenu par des subventions du NIH GM088409 et Howard Hughes Medical Institute contributions à KL

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<li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro%3A+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li>
<li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+%28FoxA%29+and+GATA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li>
<li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells%3A+correlation+of+accessibility%2C+methylation%2C+MeCP2+binding+and+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li>
<li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li>
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<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li>
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<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li>
<li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization%3A+roles+of+amino+acid+sequence%2C+domain+length%2C+and+charge+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li>
<li>Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li>
<li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li>
<li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li>
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<li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway%3A+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li>
<li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li>
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<li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+%26%2334%3B30+nm%26%2334%3B+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &#34;30 nm&#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt.

Modèle tableaux de nucléosomiques sont un outil très utile pour l&#39;étude in vitro de la structure et la fonction de la chromatine. Par exemple, ils ont été largement utilisés pour étudier le mécanisme de la condensation de la chromatine de la fibre dans une solution de 30 à 34, et a permis d&#39;obtenir une structure aux rayons X d&#39;un Tetranucleosome 35. Plus récemment, ils se sont avérés utiles à déchiffrer les effets structurels de variantes noyau d&#39;histone spécifique, des mut...

Génomes eucaryotes n&#39;existent pas d&#39;ADN nu, mais sont compactés et organisées par des protéines liées. Ces complexes d&#39;ADN et de protéines sont connues comme la chromatine. L&#39;unité de répétition de base de la chromatine est le nucléosome. Un nucléosome est constitué d&#39;histone octamère et 146 paires de bases d&#39;ADN enroulé autour de l&#39;octamère d&#39;histone environ 1,6 fois 1. L&#39;octamère d&#39;histones est composé de deux exemplaires de chacun des histones H2A le fondamentales, H2B, H3, et H4. Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d&#39;une molécule d&#39;ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. La structure étendue de tableaux nucléosomiques a été désigné comme la fibre de 10 nm ou les «perles sur un fil&quot; structure et est présent in vitro dans des conditions de faible teneur en sel 2. La fibre de 10 nm est capable de se condenser dans les structures d&#39;ordre supérieur par le compactage intra-groupe et / ou inter-réseau oligomérisation 2. Ces structures d&#39;ordre supérieur peuvent être induites en présence de sels,ou qui peut être influencé par la liaison des protéines de la chromatine à l&#39;architecture du réseau nucléosomale 3,4. Niveaux de compaction de la chromatine sont inversement corrélés avec un taux de transcription dans 5,6 vivo. Les dernières recherches soulignent l&#39;importance de l&#39;organisation structurale des génomes dans des procédés tels que la différenciation, le développement du cancer et d&#39;autres 7,8. L&#39;utilisation de tableaux nucléosomiques pour étudier la structure et la fonction de la chromatine s&#39;est généralisée. Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;assemblage de tableaux de nucléosomiques histones recombinantes et d&#39;ADN de positionnement des nucléosomes. Utilisation de l&#39;ADN recombinant avec des répétitions en tandem de séquences de positionnement des nucléosomes permet la reconstitution des tableaux qui contiennent des nucléosomes régulièrement espacés. Deux des séquences de positionnement plus populaires sont la séquence du gène d&#39;ARNr 5S et le &quot;601&quot; 9,10 de séquence. La séquence 601 a été obtenue à partir d&#39;expériences et la mortalité SELEXe positionne fortement nucléosomes que la séquence 5S 11. Par conséquent, la longueur de liaison de l&#39;ADN des 601 matrices est plus homogène. ADN de positionnement des nucléosomes répétée en tandem est obtenu par filtration sur gel 4,12. Histones recombinantes sont purifiées à partir de E. coli dans des conditions de dénaturation 13. L&#39;utilisation d&#39;histones recombinantes permet de contrôler avec soin la composition de l&#39;histone des matrices nucléosomiques. Par exemple, le noyau histones portant des mutations spécifiques 14 ou modifications post-traductionnelles 15,16 peut être substitué pour histones de type sauvage. expériences de vitesse de sédimentation de surveiller le taux de sédimentation des macromolécules en solution sous une force centrifuge appliquée 17. Cela donne des informations sur la taille et la forme des macromolécules dans un échantillon. expériences de vitesse de sédimentation sont donc un outil approprié pour l&#39;étude des changements d&#39;état de la solution dans la fibre de chromatinela structure due à la condensation de la chromatine 18. Surtout, il est d&#39;abord nécessaire d&#39;utiliser des expériences de vitesse de sédimentation comme une étape de contrôle de la qualité dans nucléosomique tableau reconstitution. Si l&#39;ADN et les nucléosomes sont pas combinées à un rapport molaire approprié, les tableaux peuvent être sous-ou sur-saturé avec histones. Ainsi, les informations obtenues à partir d&#39;expériences de vitesse de sédimentation est utilisé pour veiller à ce que l&#39;ADN est correctement saturé de nucléosomes. Il est important d&#39;utiliser d&#39;autres méthodes pour estimer la saturation de l&#39;ADN avec des nucléosomes, en particulier si l&#39;on travaille avec une matrice d&#39;ADN non caractérisée. Par conséquent, nous décrivons également un procédé pour l&#39;analyse de réseaux nucléosomales utilisant la microscopie à force atomique (AFM). L&#39;AFM est une technique puissante qui permet la visualisation des effets d&#39;un certain nombre de paramètres, tels que le niveau de saturation, l&#39;effet de la présence de variants d&#39;histones ou les effets de MgCl 2 19,20. AFM a également été applied pour étudier la dynamique des nucléosomes utilisant laps de temps imagerie 21. In vitro assemblés nucléosomiques tableaux 12-mer sont particulièrement favorables à des études de l&#39;AFM, car ils appartiennent à la gamme de la bonne taille pour l&#39;imagerie AFM 22. Dans la présente étude, nous avons utilisé l&#39;AFM de tableaux nucléosomiques comme un contrôle de la qualité ainsi que d&#39;un moyen d&#39;affirmer les données de l&#39;ASC (&quot;voir c&#39;est croire&quot;). En plus de la visualisation simple, l&#39;AFM permet de mesurer des profils de hauteur d&#39;échantillons comme une métrique supplémentaire.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triéthoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO Tube de dialyse</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 Colonne</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa MWCO Concentrateur centrifuge</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO Tube de dialyse</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I Ultracentrifugeuse analytique</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes adn positionnement

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d&#39;une molécule d&#39;ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. Tableaux nucléosomes sont obtenus dans une des deux façons suivantes: purification à partir de sources in vivo ou in vitro de reconstitution histones fondamentales recombinants et de l&#39;ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Cette dernière méthode a l&#39;avantage de permettre à l&#39;ensemble d&#39;un uniforme plus de composition et tableau nucléosomique positionné précisément. expériences de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique des informations d&#39;élasticité d&#39;environ la taille et la forme des macromolécules en analysant la vitesse à laquelle ils migrent à travers la solution sous la force centrifuge. Cette technique, en même temps que la microscopie à force atomique, peut être utilisé pour le contrôle de qualité, en veillant à ce que la majorité des matrices d&#39;ADN sont saturés avec des nucléosomes après reconstitution. Nous décrivons ici les protocoles nécessaires pour reconstituer quelques milligrammes de longueur et de composition dtableaux nucléosomiques efined appropriés pour les études biochimiques et biophysiques de la structure et la fonction de la chromatine.

Pour illustrer le protocole nous avons reconstitué à partir de matrices histones nucléosomiques recombinants de base de Xenopus et de l&#39;ADN comprenant des 12 séquences répétées en tandem de 207 bp de la séquence de positionnement 601 (601 207 x 12). Nous avons d&#39;abord assemblé octamers natives de histones fondamentales lyophilisées et ensuite purifié par des octamères FPLC en utilisant une colonne S200 (Figure 1A). Grands complexes élues tôt de la colonne S200. Les histones s...

Une méthode est présentée pour la reconstitution du modèle nucléosomiques tableaux de histones recombinantes et d&#39;ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Nous décrivons également comment les expériences de la vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, et la microscopie à force atomique (AFM) sont utilisés pour mesurer l&#39;ampleur de nucléosomique saturation de tableau après reconstitution.

Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Cette expérience vise à assembler des réseaux nucléosomiques contenant une série de séquences d'ADN positionnant les nucléosomes répétées en tandem, avec un nombre égal de nucléosomes. Commencez par replier d'abord les complexes d'histones en dialysant les histones centrales hors d'un tampon dénaturant. Ensuite, séparez les complexes d'histones à l'aide d'une colonne de chromatographie d'exclusion stérique. Puis, associez les complexes d'histones à l'ADN matrice à différentes proportions molaires et déposez-les sur l'ADN sous forme de nucléosomes par dialyse progressive, du sel élevé au sel faible.Ensuite, analyser les échantillons par vitesse de sédimentation afin de déterminer le rapport molaire approprié pour atteindre le niveau de saturation souhaité. Les résultats peuvent indiquer le degré de saturation des réseaux nucléosomiques en fonction de leur migration en solution sous l'effet d'une force centrifuge, ou à partir d'une image obtenue par microscopie à force atomique. Le principal avantage des réseaux nucléosomiques par rapport aux mononucléosomes est que les nucléosomes sont reliés par de l'ADN inter-nucléosomique, imposant ainsi une contrainte structurale supplémentaire.

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Dans cette vidéo, nous démontrons des techniques d’imagerie de microscopie à force atomique à haute vitesse, AFM, pour étudier la dynamique des complexes de nucléosomes. Lorsque l’extrémité de l’AFM balaie la surface du nucléosome, elle détecte les altérations de la hauteur du nucléosome et enregistre le déballage de l’ADN au fil du temps.

Microscopie à force atomique à intervalle rapide pour capturer la dynamique des nucléosomes

Ce protocole décrit la reconstitution de nucléosomes contenant différentiellement histones sœurs marqués d'un isotope. Dans le même temps, les nucléosomes asymétriquement modifications post-traductionnelles peuvent être générés après l'utilisation d'une copie préalablement modifiée de l'histone. Ces préparations peuvent être facilement utilisés pour étudier les mécanismes de modification de diaphonie, simultanément sur les deux histones sœurs, en utilisant la spectroscopie de RMN à haute...

Reconstitution de nucléosomes avec histones soeurs Différentiellement Isotope marqués

Nous présentons ici un protocole afin de caractériser les particules nucleosome à l’échelle de la molécule unique à l’aide de la microscopie à force atomique statiques et time-lapse (AFM) techniques d’imagerie. La méthode de la fonctionnalisation de surface décrite permet la capture de la structure et la dynamique des nucléosomes dans haute résolution à l’échelle nanométrique.

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Nous présentons ici une méthode pour exprimer les protéines histones acétylées en utilisant l’expansion du code génétique et assembler des nucléosomes reconstitués in vitro.

Acétylation spécifique de la lysine des histones pour la reconstitution des nucléosomes à l’aide de l’expansion du code génétique chez Escherichia coli

Ce protocole décrit en détail la préparation des complexes nucléosomiques à l’aide de deux méthodes de préparation des échantillons pour la congélation des grilles TEM.

Préparation de particules de noyau de nucléosomes complexées avec des facteurs de réparation de l’ADN pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique

Cet article présente une procédure expérimentale détaillée pour reconstituer des attaches d’ADN contenant des nucléosomes pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence à molécule unique. Il décrit en outre plusieurs expériences en aval qui peuvent être menées pour visualiser le comportement de liaison des protéines interagissant avec la chromatine et analyser les changements dans les propriétés physiques des nucléosomes.

Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

Cette vidéo montre la technique utilisée pour la préparation de l'organisateur et les explants pôle animal à partir d'embryons de Xenopus laevis, y compris l'utilisation du couteau sourcils - un outil de dissection spécialisée est fait de son sourcil. Le protocole pour l'assemblage d'un test d'adhérence est également donnée, ce qui sondes pour détecter la présence de molécules d'adhérence clés présents sur la surface de l'organisateur ou de cellules pôle animal qui sont critiques pour le bon...

Dissection de l&#39;organisateur et explants pôle animal à partir d&#39;embryons de Xenopus laevis et de l&#39;Assemblée d&#39;un test d&#39;adhésion cellulaire

Isolement de l&#39;ADN génomique de souris Tails

Nous présentons une intégration novatrice et puissante de la nanophotonique (QD-FRET) et de la microfluidique pour étudier la formation des polyplexes polyélectrolyte, qui est censé fournir un meilleur contrôle et une synthèse des polyplexes uniforme et personnalisables pour base d'acide nucléiques thérapeutiques futures.

Combinant QD-FRET et la microfluidique pour surveiller Nanocomplex ADN auto-assemblage en temps réel

L'ultracentrifugation analytique (AUC) de cellules de l'échantillon et le tampon de l'échantillon détient référence et au cours d'expériences et est exposé à vide élevé et des vitesses de rotor jusqu'à 60.000 rpm. Cette vidéo va démontrer le souci du détail nécessaire pour l'assemblage, le chargement et l'alignement de cette composante très importante d'une expérience ASC.

Assemblée, de chargement, et l&#39;alignement d&#39;une cellule échantillon ultracentrifugation analytique

Découvrez l'assemblage de tableaux nucléosomiques avec des histones recombinantes et de l'ADN positionnant. Cette méthode utilise la sédimentation et la microscopie à force atomique pour évaluer la saturation et la structure chromatinienne.

Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement

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