Name: Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez l'assemblage de tableaux nucléosomiques avec des histones recombinantes et de l'ADN positionnant. Cette méthode utilise la sédimentation et la microscopie à force atomique pour évaluer la saturation et la structure chromatinienne.

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Ce travail a été soutenu par le NIH subventions GM45916 et GM66834 à JCH et une bourse de la Fondation internationale pour le syndrome de Rett AK Ce travail a également été soutenu par des subventions du NIH GM088409 et Howard Hughes Medical Institute contributions à KL

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<li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro%3A+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li>
<li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+%28FoxA%29+and+GATA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li>
<li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells%3A+correlation+of+accessibility%2C+methylation%2C+MeCP2+binding+and+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li>
<li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li>
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<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li>
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<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li>
<li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization%3A+roles+of+amino+acid+sequence%2C+domain+length%2C+and+charge+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li>
<li>Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li>
<li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li>
<li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li>
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<li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway%3A+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li>
<li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li>
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<li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+%26%2334%3B30+nm%26%2334%3B+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &#34;30 nm&#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt.

Modèle tableaux de nucléosomiques sont un outil très utile pour l&#39;étude in vitro de la structure et la fonction de la chromatine. Par exemple, ils ont été largement utilisés pour étudier le mécanisme de la condensation de la chromatine de la fibre dans une solution de 30 à 34, et a permis d&#39;obtenir une structure aux rayons X d&#39;un Tetranucleosome 35. Plus récemment, ils se sont avérés utiles à déchiffrer les effets structurels de variantes noyau d&#39;histone spécifique, des mut...

Génomes eucaryotes n&#39;existent pas d&#39;ADN nu, mais sont compactés et organisées par des protéines liées. Ces complexes d&#39;ADN et de protéines sont connues comme la chromatine. L&#39;unité de répétition de base de la chromatine est le nucléosome. Un nucléosome est constitué d&#39;histone octamère et 146 paires de bases d&#39;ADN enroulé autour de l&#39;octamère d&#39;histone environ 1,6 fois 1. L&#39;octamère d&#39;histones est composé de deux exemplaires de chacun des histones H2A le fondamentales, H2B, H3, et H4. Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d&#39;une molécule d&#39;ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. La structure étendue de tableaux nucléosomiques a été désigné comme la fibre de 10 nm ou les «perles sur un fil&quot; structure et est présent in vitro dans des conditions de faible teneur en sel 2. La fibre de 10 nm est capable de se condenser dans les structures d&#39;ordre supérieur par le compactage intra-groupe et / ou inter-réseau oligomérisation 2. Ces structures d&#39;ordre supérieur peuvent être induites en présence de sels,ou qui peut être influencé par la liaison des protéines de la chromatine à l&#39;architecture du réseau nucléosomale 3,4. Niveaux de compaction de la chromatine sont inversement corrélés avec un taux de transcription dans 5,6 vivo. Les dernières recherches soulignent l&#39;importance de l&#39;organisation structurale des génomes dans des procédés tels que la différenciation, le développement du cancer et d&#39;autres 7,8. L&#39;utilisation de tableaux nucléosomiques pour étudier la structure et la fonction de la chromatine s&#39;est généralisée. Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;assemblage de tableaux de nucléosomiques histones recombinantes et d&#39;ADN de positionnement des nucléosomes. Utilisation de l&#39;ADN recombinant avec des répétitions en tandem de séquences de positionnement des nucléosomes permet la reconstitution des tableaux qui contiennent des nucléosomes régulièrement espacés. Deux des séquences de positionnement plus populaires sont la séquence du gène d&#39;ARNr 5S et le &quot;601&quot; 9,10 de séquence. La séquence 601 a été obtenue à partir d&#39;expériences et la mortalité SELEXe positionne fortement nucléosomes que la séquence 5S 11. Par conséquent, la longueur de liaison de l&#39;ADN des 601 matrices est plus homogène. ADN de positionnement des nucléosomes répétée en tandem est obtenu par filtration sur gel 4,12. Histones recombinantes sont purifiées à partir de E. coli dans des conditions de dénaturation 13. L&#39;utilisation d&#39;histones recombinantes permet de contrôler avec soin la composition de l&#39;histone des matrices nucléosomiques. Par exemple, le noyau histones portant des mutations spécifiques 14 ou modifications post-traductionnelles 15,16 peut être substitué pour histones de type sauvage. expériences de vitesse de sédimentation de surveiller le taux de sédimentation des macromolécules en solution sous une force centrifuge appliquée 17. Cela donne des informations sur la taille et la forme des macromolécules dans un échantillon. expériences de vitesse de sédimentation sont donc un outil approprié pour l&#39;étude des changements d&#39;état de la solution dans la fibre de chromatinela structure due à la condensation de la chromatine 18. Surtout, il est d&#39;abord nécessaire d&#39;utiliser des expériences de vitesse de sédimentation comme une étape de contrôle de la qualité dans nucléosomique tableau reconstitution. Si l&#39;ADN et les nucléosomes sont pas combinées à un rapport molaire approprié, les tableaux peuvent être sous-ou sur-saturé avec histones. Ainsi, les informations obtenues à partir d&#39;expériences de vitesse de sédimentation est utilisé pour veiller à ce que l&#39;ADN est correctement saturé de nucléosomes. Il est important d&#39;utiliser d&#39;autres méthodes pour estimer la saturation de l&#39;ADN avec des nucléosomes, en particulier si l&#39;on travaille avec une matrice d&#39;ADN non caractérisée. Par conséquent, nous décrivons également un procédé pour l&#39;analyse de réseaux nucléosomales utilisant la microscopie à force atomique (AFM). L&#39;AFM est une technique puissante qui permet la visualisation des effets d&#39;un certain nombre de paramètres, tels que le niveau de saturation, l&#39;effet de la présence de variants d&#39;histones ou les effets de MgCl 2 19,20. AFM a également été applied pour étudier la dynamique des nucléosomes utilisant laps de temps imagerie 21. In vitro assemblés nucléosomiques tableaux 12-mer sont particulièrement favorables à des études de l&#39;AFM, car ils appartiennent à la gamme de la bonne taille pour l&#39;imagerie AFM 22. Dans la présente étude, nous avons utilisé l&#39;AFM de tableaux nucléosomiques comme un contrôle de la qualité ainsi que d&#39;un moyen d&#39;affirmer les données de l&#39;ASC (&quot;voir c&#39;est croire&quot;). En plus de la visualisation simple, l&#39;AFM permet de mesurer des profils de hauteur d&#39;échantillons comme une métrique supplémentaire.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triéthoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO Tube de dialyse</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 Colonne</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa MWCO Concentrateur centrifuge</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO Tube de dialyse</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I Ultracentrifugeuse analytique</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes adn positionnement

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d&#39;une molécule d&#39;ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. Tableaux nucléosomes sont obtenus dans une des deux façons suivantes: purification à partir de sources in vivo ou in vitro de reconstitution histones fondamentales recombinants et de l&#39;ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Cette dernière méthode a l&#39;avantage de permettre à l&#39;ensemble d&#39;un uniforme plus de composition et tableau nucléosomique positionné précisément. expériences de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique des informations d&#39;élasticité d&#39;environ la taille et la forme des macromolécules en analysant la vitesse à laquelle ils migrent à travers la solution sous la force centrifuge. Cette technique, en même temps que la microscopie à force atomique, peut être utilisé pour le contrôle de qualité, en veillant à ce que la majorité des matrices d&#39;ADN sont saturés avec des nucléosomes après reconstitution. Nous décrivons ici les protocoles nécessaires pour reconstituer quelques milligrammes de longueur et de composition dtableaux nucléosomiques efined appropriés pour les études biochimiques et biophysiques de la structure et la fonction de la chromatine.

Pour illustrer le protocole nous avons reconstitué à partir de matrices histones nucléosomiques recombinants de base de Xenopus et de l&#39;ADN comprenant des 12 séquences répétées en tandem de 207 bp de la séquence de positionnement 601 (601 207 x 12). Nous avons d&#39;abord assemblé octamers natives de histones fondamentales lyophilisées et ensuite purifié par des octamères FPLC en utilisant une colonne S200 (Figure 1A). Grands complexes élues tôt de la colonne S200. Les histones s...

Une méthode est présentée pour la reconstitution du modèle nucléosomiques tableaux de histones recombinantes et d&#39;ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Nous décrivons également comment les expériences de la vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, et la microscopie à force atomique (AFM) sont utilisés pour mesurer l&#39;ampleur de nucléosomique saturation de tableau après reconstitution.

Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Cette expérience vise à assembler des réseaux nucléosomiques contenant une série de séquences d'ADN positionnant les nucléosomes répétées en tandem, avec un nombre égal de nucléosomes. Commencez par replier d'abord les complexes d'histones en dialysant les histones centrales hors d'un tampon dénaturant. Ensuite, séparez les complexes d'histones à l'aide d'une colonne de chromatographie d'exclusion stérique. Puis, associez les complexes d'histones à l'ADN matrice à différentes proportions molaires et déposez-les sur l'ADN sous forme de nucléosomes par dialyse progressive, du sel élevé au sel faible.Ensuite, analyser les échantillons par vitesse de sédimentation afin de déterminer le rapport molaire approprié pour atteindre le niveau de saturation souhaité. Les résultats peuvent indiquer le degré de saturation des réseaux nucléosomiques en fonction de leur migration en solution sous l'effet d'une force centrifuge, ou à partir d'une image obtenue par microscopie à force atomique. Le principal avantage des réseaux nucléosomiques par rapport aux mononucléosomes est que les nucléosomes sont reliés par de l'ADN inter-nucléosomique, imposant ainsi une contrainte structurale supplémentaire.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la structure de la chromatine, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme l'étude de la transcription in vitro sur des modèles de chromatine. Ryan et Anna vont maintenant démontrer l'assemblage de réseaux nucléosomiques à partir d'histones recombinantes de type sauvage sur un ADN positionnant les nucléosomes. Commencez par les protéines d'histones recombinantes lyophilisées et purifiées H2A, H2B, H3 et H4 ; dissolvez environ cinq milligrammes de chacune dans trois millilitres de tampon de dépliage et incubez pendant au moins une heure à température ambiante sous agitation.Mesurez maintenant l'absorbance de chaque solution d'histone à 276 nanomètres en utilisant le tampon de dépliage comme référence. Calculez ensuite la molarité de chaque histone en utilisant leurs coefficients d'extinction. Comparez la concentration déterminée par absorbance au poids sec lyophilisé et estimez si la majeure partie de la protéine est dissoute.Identifier l'échantillon d'histone qui contient le moins de moles, car ce sera le nombre limite de moles pour toutes les histones. Ensuite, combiner les histones en quantités équimolaires. Diluer le mélange d'histones avec du tampon de dépliage jusqu'à une concentration finale de un milligramme par millilitre.Transférez maintenant l'échantillon dans un tube de dialyse. Scellez le tube et placez-le dans deux litres de tampon de repliement froid. Effectuez la dialyse de l'échantillon pendant 18 heures à quatre degrés Celsius sous agitation.Veillez à ce que le tube de dialyse puisse tourner librement et vigoureusement afin d'éviter la précipitation de ce composé. Changez le tampon de dialyse toutes les six heures ; même si un précipité se forme, ne jetez pas l'échantillon, car une partie des octi pourrait être récupérée, bien que le rendement soit réduit. Connectez la colonne S 200 à un système FPLC en veillant à ce que des bulles d'air n'entrent pas dans le système.Nettoyez la colonne S 200 toute la nuit avec de l'eau filtrée à 0,2 micromètre en utilisant un débit de 0,3 millilitre par minute et une limite de pression arrière de 0,5 mégapascal. Ensuite, équilibrez le système avec un litre de tampon de repliement filtré à 0,2 micromètre pendant environ deux heures. Équilibrez également un concentrateur centrifuge avec un millilitre de tampon de repliement. Retirez maintenant l'échantillon du tube de dialyse.Centrifuger l'échantillon à quatre degrés Celsius pour éliminer tout précipité. Prélever le surnageant de l'échantillon à l'aide d'une pipette et le transférer dans le concentrateur. Concentrer l'échantillon jusqu'à un volume d'environ 500 microlitres.Transférez l'échantillon Optimus concentré dans un nouveau récipient. Rincez le concentrateur avec un millilitre de tampon de repliement. Concentrez le rinçage jusqu'à 500 microlitres et ajoutez-le à l'échantillon ER.Faites centrifuger l'échantillon dans un tube microfuge de 1,5 millilitre pendant cinq minutes à 10 000 tr/min à 4 degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau tube. Chargez maintenant l'échantillon sur la colonne S 200.Éluer l'échantillon avec 400 millilitres de tampon de repliement fraîchement préparé et recueillir des fractions de deux millilitres. Surveiller l'absorbance à 280 nanomètres pendant l'élution. Les agrégats d'His stone s'éluent généralement à environ 45 millilitres de MER, vers 65 millilitres et à un moment donné.Environ 84 millilitres. Analyser les fractions éluées provenant des pics d'intérêt en faisant courir les échantillons sur un gel SDS-PAGE à 18 à 20 %. Les fractions contenant des émus purifiés doivent présenter des quantités équimolaires des quatre protéines d'histones fondamentales.Regroupez maintenant les fractions contenant les OCR purifiées et concentrez-les à l’aide d’un filtre centrifuge pour déterminer la concentration finale en OCR. Mesurez l’absorbance à 280 nm, puis calculez la concentration en utilisant le coefficient d’extinction.Reconstituez des réseaux nucléosomiques à partir de l'ADN et des ER purifiés comme indiqué dans le texte du protocole. Ensuite, diluez l'échantillon jusqu'à une absorbance de 0,5 à 260 nanomètres. Chargez 400 microlitres de l'échantillon dans une cellule munie d'un centre à deux compartiments, en plaçant l'échantillon d'un côté et le tampon de référence 10 de l'autre.Bien que le niveau du liquide dans les deux secteurs doive être sensiblement le même, maintenez le ménisque de référence plus haut que le ménisque de l'échantillon. Chargez les cellules dans le rotor et alignez correctement les cellules.À l’aide des repères situés sur la partie inférieure des cellules du rotor, dépoussiérez délicatement les lentilles des cellules à l’air comprimé. Mettez le centrifugeur X-L-A-X-L-I en marche. Insérez le rotor et fixez les optiques comme indiqué dans le mode d’emploi, puis assurez leur bon maintien.Ouvrez le logiciel du laboratoire de protéomique et sélectionnez Fichier Nouveau. Configurez un cycle de balayage unique à 3000 tr/min à une température de 25 degrés Celsius. Pour chaque cellule, nommez les échantillons, sélectionnez une longueur d'onde, choisissez l'absorbance et indiquez un emplacement de sauvegarde sur votre ordinateur.Dans les options, sélectionnez arrêt. Après le dernier balayage et l'exécution de l'étalonnage radial, commencez l'exécution du balayage unique. Utilisez le balayage unique pour déterminer la longueur appropriée du balayage radial.À l'aide du panneau de contrôle X-L-A-X-L-I, entrez une vitesse nulle et appuyez sur astérisque pour équilibrer la chambre. À l'aide du logiciel, réglez la vitesse souhaitée et le nombre de balayages.Des vitesses plus élevées de centrifugation augmentent la résolution du coefficient de sédimentation. Toutefois, on doit acquérir au moins 20 balayages avant que l'échantillon entier ne soit sédimenté au fond de la cellule. Surveiller les deux ou trois premiers balayages afin de s'assurer du bon fonctionnement.Superposez les dernières analyses afin de surveiller l'avancement de l'expérience et détecter d'éventuels problèmes tels que des cellules en fuite. L'analyse des résultats de vitesse de sédimentation, ainsi qu'un protocole pour visualiser les réseaux à l'aide de la microscopie à force atomique, sont détaillées dans le texte du protocole. Dans cette expérience.Les histones centrales lyophilisées de Xenopus ont été reconstituées dans l'octamère purifié par FPLC sur une colonne S 200. L'analyse des fractions d'octamères purifiées par électrophorèse SDS-PAGE révèle des quantités équimolaires des quatre protéines histoniques, après élimination préalable des agrégats histoniques non spécifiques. On notera que les poids moléculaires de Xip H2A et H2B diffèrent d'environ 200 daltons seulement, et apparaissent donc souvent comme une seule bande sur les gels SDS.Les fractions 64 à 67 ont été regroupées et conservées pour la reconstitution de réseaux nucléosomiques. Une capture d'écran du logiciel Proteome Lab, issue d'un balayage unique effectué à 3000 tr/min, a servi à définir la plage de mesures pour un balayage de cellule UC. Ensuite, une série de balayages de vitesse de sédimentation est modifiée afin de générer un jeu de données ; les lignes rouge et verte représentent deux méthodes différentes pour visualiser la distribution des coefficients de sédimentation.Dans UltraScan. La ligne rouge représente la distribution intégrale des coefficients de sédimentation, tandis que la ligne verte représente la dérivée dans l'étude de l'organisation de la chromatine. La microscopie à force atomique in vitro complète la centrifugation analytique pour établir le degré de saturation du modèle après reconstitution.Ici, la majorité des 27 SRA utilisées en imagerie contenaient de 10 à 11 nucléosomes. Ce balayage de 500 par 500 nanomètres montre clairement des réseaux de nucléosomes avec l'ADN des régions inter-nucléosomiques. Sont également représentés le tracé d'amplitude, le tracé de phase, et le même tracé de hauteur avec une ligne dessinée à main levée traversant les nucléosomes afin de déterminer leur profil de hauteur. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre jours si elle est effectuée correctement.Lors de cette procédure, il est très important de se rappeler d'être très précis lors de la mesure des concentrations de vos réactifs. Après avoir suivi cette procédure, vous pouvez également tester les niveaux de saturation des réseaux nucléosomiques à l'aide de techniques telles que la microscopie à force atomique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la chromatine pour étudier la structure de la chromatine et sa compaction.

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