Name: À haut débit, lextraction automatisée de lADN et de lARN dans des échantillons cliniques utilisant la technologie TruTip sur des robots de manipulation de liquide commune (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Découvrez l'extraction automatisée d'ADN génomique à partir de sang total utilisant la technologie TruTip sur le robot Hamilton Star. Cette méthode haut débit élimine les centrifugeuses et offre une pureté optimale pour les applications cliniques.

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Certaines parties de ce travail ont été soutenus par le National Institutes of Health (NIH) en vertu de subvention R 44 AI072784. Nous remercions le Dr Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson et Amy Dean du Laboratoire des maladies virales, Wadsworth Center, État de New York ministère de la Santé pour virions grippaux quantifiés et l&#39;accès aux validé cliniquement la grippe en temps réel PCR.

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Les auteurs sont des employés de Akonni Biosystems, Inc. qui produisent des matériaux utilisés dans cet article. Accès libre et la production de cet article est parrainé par Akonni Biosystems, Inc.

La simplicité du concept de TruTip et de workflow (Figure 1) rendre facilement adapté, automatisé et efficace pour un certain nombre de matrices d&#39;échantillons cliniques, les volumes d&#39;échantillon d&#39;entrée et les systèmes de manipulation de liquides. Il faut reconnaître, cependant, que chaque échantillon clinique est unique et varie d&#39;un à l&#39;autre de la viscosité, les particules, le mucus, les contaminants de surface, de microbes et / ou fonds génétiques humaines. Compte tenu des variations attendues dans la composition de l&#39;échantillon clinique et des usages prévus d&#39;un protocole de préparation des échantillons de TruTip automatisé, il peut donc être nécessaire de modifier certaines étapes d&#39;une procédure de TruTip afin d&#39;atteindre les résultats souhaités pour un type d&#39;échantillon spécifique. Quel que soit le type d&#39;échantillon, cependant, les paramètres TruTip qui ont généralement le plus d&#39;impact sur la pureté de l&#39;acide nucléique et / ou de récupération sont les suivants: <ol><li> Exemple de mélange et d&#39;homogénéisation avec un tampon de lyse (et l&#39;alcool). Bien TruTips ont un relativement grande taille des pores, l&#39;homogénéisation et la liquéfaction est très important pour la lyse cellulaire efficace, et des mesures contraignantes ultérieurs à la TruTip monolithe. Avec un lysat homogène et bien liquéfié, les échantillons peuvent se déplacer à travers le TruTip avec des débits plus élevés, ce qui réduit le temps global de traitement des échantillons. Le protocole plasma grand Volume démontre le potentiel pour les utilisateurs d&#39;homogénéiser et de fluidifier les échantillons difficiles (en ligne ou hors ligne), malgré le grand volume d&#39;échantillon d&#39;entrée. </li><li> débits. des débits plus lents lors de la fixation de l&#39;acide nucléique ou élution entraînent généralement des rendements plus élevés d&#39;acides nucléiques, même si c&#39;est au détriment du temps de traitement total. Des débits plus lents peuvent également réduire l&#39;ampleur de cisaillement de l&#39;ADN. </li><li> nombre de cycles. Le nombre optimal d&#39;aspiration et de distribuer des cycles dépend du type d&#39;échantillon, le volume total de l&#39;échantillon et des débits. Étape 1 sur la figure 1 est typiquement le point auquel numbe de cyclers (et débits) peut nécessiter une optimisation empirique, avec des échantillons comme aspiration du nasopharynx (figure 5) représente l&#39;une des lysats plus difficiles à optimiser en raison de la gamme des viscosités NPA de différents patients. </li><li> Séchage. Séchage complet du TruTip monolithe est impératif d&#39;éviter les solvants organiques résiduelles de co-élution avec l&#39;échantillon purifié d&#39;acide nucléique et des procédés en aval inhiber ou de tests. Parce TruTip n&#39;est pas séché par centrifugation ou filtration sous vide, il est important d&#39;optimiser à la fois le débit et le nombre de cycles au cours de l&#39;étape de séchage. Parfois, il ya une goutte résiduelle de solution de lavage sur le terminus du TruTip après les cycles de séchage sont terminées. Le Hamilton robot a la capacité d&#39;accomplir une &quot;pointe contact&quot; sur le côté du puits pour libérer la goutte, assurant ainsi une élution sans solvant. Le système de epMotion n&#39;a pas cette fonctionnalité, mais un pré-rinçage du terminus de TruTip en eltampon ution peut être programmé pour obtenir le même effet. </li></ol> En raison de la géométrie, la matière de la pointe de pipette, et un procédé de fixation sur les bras robotiques de canal sont propres à chaque constructeur de l&#39;appareil, une construction d&#39;TruTip différente est nécessaire pour chaque système de manipulation de liquides. Les dimensions du monolithe TruTip (diamètre, l&#39;épaisseur et la taille des pores) ne sont en corrélation avec la capacité de liaison des acides nucléiques (et l&#39;efficacité d&#39;élution), comme il est prévu pour une technique d&#39;extraction en phase solide. Alors épaisses (&gt; 4 mm) matrices peuvent être intégrées dans un TruTip 1 ml d&#39;augmenter la capacité de liaison de l&#39;acide nucléique pour les échantillons de grand volume et / ou égaliser la capacité de liaison à travers des formats de TruTip spécifiques, il existe un compromis entre l&#39;épaisseur de TruTip et des débits au cours de l&#39;étape de liaison initial (en présence de lysats bruts). Ainsi, il est parfois avantageux d&#39;incorporer des monolithes de plus grand diamètre en grand volume des embouts de pipette pour les étapes initiales d&#39;un protocole automatisé (par exemple &lt;/ Em&gt; les 5 ml Hamilton / Akonni TruTips pour les extractions de grand volume). Étant donné les configurations de TruTip spécifiques dictées par les fabricants de robots de manipulation des liquides, cependant, nous ne nous attendons pas nécessairement le rendement des acides nucléiques TruTip soient identiques sur toutes les plateformes de manipulation de liquides de différents fabricants, ou à travers différentes tailles de TruTip. Les échantillons cliniques (par définition) contiennent des quantités importantes d&#39;ADN génomique humain, sauf s&#39;ils sont acquis à partir de sites normalement stériles (par exemple liquide céphalo-rachidien). Parfois, l&#39;ADN génomique humain est souhaitée (voir Figure 6), tandis que dans d&#39;autres applications de l&#39;ADN humain représente un fond de génomique indésirable (comme pour la figure 5). La présence de l&#39;ADN de fond est en général pas un problème dans la mesure où la quantité totale d&#39;acide nucléique dans l&#39;échantillon ne dépasse pas la capacité de liaison du monolithe, et l&#39;ADN de fond, peut servir de support si l&#39;acide nucléique cible souhaitéel&#39;acide est présent à l&#39;état de traces. L&#39;objectif du protocole d&#39;extraction de plasma à haut volume (figure 7) est d&#39;isoler (fragmenté) ADN foetal en présence d&#39;un excès d&#39;un facteur 10 à 20 de l&#39;ADN de la mère, qui est similaire à l&#39;objectif de préparation d&#39;échantillons de tests de maladies infectieuses, sauf que les séquences sont très congruent et ne se distinguent que par des tests moléculaires très spécifiques et / ou discrimination de taille. Dans ce cas, l&#39;ADN circulant total est isolé à l&#39;aide d&#39;un ml TruTip 5, et l&#39;ADN fœtal ultérieure poids moléculaire élevé et de faible poids moléculaire sont séparés par la suite liaison et d&#39;élution à un ml TruTip 1 en modifiant les conditions de tampon de liaison. Séparation granulométrique sélective et l&#39;enrichissement des acides nucléiques cibles en fonction de leur liaison et les propriétés d&#39;élution à un monolithe de silice est un mode d&#39;action différent de manière significative que celui obtenu par des membranes ou des colonnes de spin d&#39;exclusion de taille. séparation des tailles et l&#39;enrichissement de l&#39;ADN microbien à partir d&#39;ADN génomique humain peut être unccomplished dans de futures applications via la personnalisation de liaison TruTip et tampons d&#39;élution. Les protocoles automatisés démontré ici l&#39;accent sur l&#39;utilité de la TruTip monolithe lui-même pour le traitement des échantillons cliniques différents, et comment il peut être adapté pour les gros volumes et les robots de manipulation de liquides spécifiques. Les méthodes simplifiées entraînent généralement des protocoles d&#39;extraction plus rapide par rapport à d&#39;autres systèmes automatisés. La simplicité de la technologie de TruTip, cependant, offre aussi certains avantages de coûts pour ceux qui s&#39;intéressent à l&#39;achat d&#39;un nouveau système de purification des acides nucléiques automatisé, parce que le matériel primaire nécessaire pour l&#39;automatisation des procédures TruTip est le bras pipette de canal lui-même plutôt que de barres magnétiques, systèmes de vide ou centrifugeuses à bord. Utilisant plaques de réactifs pré-remplies peuvent également réduire l&#39;espace et consommables nécessaires, et de doubler le débit par course. Minimiser l&#39;espace de pont avec les protocoles TruTip permet également aux utilisateurs avancés d&#39;intégrer en amont ou en dprocessus automatisés ownstream avec le TruTip. Par exemple la solution de easyBlood de Hamilton à fractionner le sang total peut être incorporé à la méthode d&#39;extraction de TruTip automatisé, ce qui permettrait de rationaliser considérablement les processus bio-banque. Processus post-extraction telles que la quantification des acides nucléiques, la normalisation, la PCR set-up, ou séquençage de l&#39;ADN sont également facilement intégrés avec TruTip sur les plates-formes de manutention de liquides importants.

Purification des acides nucléiques est nécessaire pour le diagnostic moléculaire plus, la recherche uniquement et les applications des sciences de la vie. Diverses approches ont émergé depuis l&#39;époque des extractions au phénol / chloroforme, dont beaucoup sont basés sur le principe fondamental de l&#39;acide nucléique se liant à la silice en présence de sels chaotropiques 1. Le processus d&#39;extraction a été rationalisé et automatisé par l&#39;utilisation de différents formats et perles à base de membranes, de filtres à spin, perles magnétiques et d&#39;approches connexes qui dominent le secteur des sciences de la vie (voir les exemples dans 2-13). Bien qu&#39;ils soient efficaces, les particules et les membranes ont connu des limitations lorsqu&#39;ils sont confrontés à des matrices cliniques difficiles. Par exemple, des membranes et des colonnes à base de billes sont conformes, avoir de petites tailles de pores (ainsi, les hautes pressions du dos), et d&#39;exiger un certain type de support afin d&#39;être traitées par un système de centrifugeuse ou un aspirateur. Les caractéristiques physiques des membranes et des perles colonnes résultat enrésistance fluidique significative, ce qui limite le type d&#39;échantillons qui peut être traitée de façon efficace sans colmatage du consommable, et / ou le total (entrée) du volume d&#39;échantillon qui peut être unidirectionnelle traitées à travers le trajet d&#39;écoulement. Inversement, les particules magnétiques doivent être réparties tout au long de l&#39;échantillon par agitation. La nécessité de répartir de façon homogène des particules magnétiques dans une solution limite le volume de l&#39;échantillon d&#39;entrée totale qui peut être traitée avec des consommables de perles les plus magnétiques. Attributs de l&#39;échantillon clinique (telles que la viscosité ou la complexité) peuvent conduire à la concentration des particules magnétiques inefficace sur le côté d&#39;un tube ou d&#39;une tige. En outre, la silice particules fines peuvent se détacher des perles pendant le processus d&#39;extraction, de perdre leur aimantation et de contaminer l&#39;échantillon final. La technologie TruTip a été développé pour surmonter certaines de ces contraintes d&#39;acides nucléiques de l&#39;échantillon de traitement et les limites 14. En incorporant un monolithe poreux d&#39;unpointe de la pipette, fluidique contre-pression est abaissée, ce qui permet le contrôle de flux par le vide (ie pipette aspiration). Cette fonction permet au processus d&#39;extraction et de l&#39;instrumentation nécessaire pour purifier les acides nucléiques à partir de types d&#39;échantillons difficiles à être grandement simplifiée (Figure 1). La géométrie et de la porosité du monolithe est adaptée pour minimiser le colmatage, tandis que l&#39;épaisseur du monolithe présente une capacité de liaison d&#39;acide nucléique suffisante pour des volumes d&#39;échantillon allant de 1,0 à 5,0 ml. Écoulement bidirectionnel pendant l&#39;aspiration de l&#39;échantillon et de distribution permet des temps de séjour prolongés entre l&#39;extrait d&#39;échantillon et le monolithe de liaison pour la récupération efficace de l&#39;acide nucléique et d&#39;élution, et permet relativement grands volumes d&#39;échantillons à traiter qui dépasse la capacité du volume de la pointe de pipette elle-même. Nous avons déjà signalé l&#39;élaboration et l&#39;application d&#39;une procédure de TruTip manuel pour purifier l&#39;ARN de la grippe à partir d&#39;échantillons naso-pharyngés en utilisant un seul ou multi-canal Rainin pipette 15. Rendements d&#39;extraction équivalents ont été obtenus entre automatisé QIAcube et les méthodes de TruTip manuelle 6 à 10 copies du gène de la grippe A ml aspiration du nasopharynx par. L&#39;objectif de cette étude était de démontrer les procédures à moyen et à haut débit, automatisés TruTip Purification des acides nucléiques pour aspiration du nasopharynx (NPA) et d&#39;autres types d&#39;échantillons cliniques pertinentes, l&#39;utilisation de robots de manipulation de liquides communément trouvées dans les laboratoires cliniques de référence.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Réactif/Matériel &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit d'extraction de l'influenza TruTip (EPM TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-11120</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 95 %</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Acétone à 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-4L</td><td></td></tr><tr><td>Eau traitée au DEPC</td><td>Life Technologies</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de réactif, 30 ml</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à puits profonds 96/2 000 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>30502302</td><td></td></tr><tr><td>Pointes filtrantes epT.I.P.S., 1 000 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Équipement&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Système epMotion 5070</td><td>Eppendorf</td><td>5070 000.000</td><td></td></tr><tr><td>Outil de distribution TM1000-8</td><td>960001061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Support pour réservoir</td><td>960002148</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau 1. &lt;/strong&gt; Réactifs et équipements pour l'extraction automatisée d'ARN à partir de prélèvements nasopharyngés.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Réactif/Matériel &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit d'extraction d'ADN génomique TruTip pour sang (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-20341</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 95 %</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Support de pointes CO-RE 96 filtrées de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235905</td><td></td></tr><tr><td>Support de pointes CO-RE 96 non filtrées de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235904</td><td></td></tr><tr><td>Bac réactif de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à puits profonds de 2 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 DWP-2 ml</td><td>Thermofisher</td><td>27874</td><td></td></tr><tr><td>Bac réactif</td><td>Fisher</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Équipement&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Système Hamilton STAR</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173027</td><td></td></tr><tr><td>Canaux de pipette indépendants de 1 ml / Bras modulaire</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173050</td><td></td></tr><tr><td>Tête 96 canaux de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199090</td><td></td></tr><tr><td>Supports de pointes</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Supports/inserts d'échantillons</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400/182238</td><td></td></tr><tr><td>Supports de plaques</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Support multiflex</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Unité agitateur-chauffeur HHS2</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199033</td><td></td></tr><tr><td>Support de rack</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau 2. &lt;/strong&gt; Réactifs et équipements pour l'extraction d'ADN génomique en 96 puits à partir de sang total.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Réactif/Matériel &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit d'extraction d'ADN circulant TruTip R+D (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>Call to inquire</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 100 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Pointes filtrées de 4 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184022</td><td></td></tr><tr><td>Pointes non filtrées de 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à puits profonds 96</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 ml</td><td>Corning/ThermoFisher Scientific</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>Bacs réactifs de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Bacs réactifs de 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182703</td><td></td></tr><tr><td>Bacs réactifs à grand volume, 96 positions</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Équipement&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Station de base STARplus Autoload / Module de plateau</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173025/190012</td><td></td></tr><tr><td>Canaux de pipette indépendants de 1 ml / Bras</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173052</td><td></td></tr><tr><td>Canal indépendant de 5 ml / Bras modulaire</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184090/173050</td><td></td></tr><tr><td>Supports de plaques</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Support multiflex</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Support de rack pour bacs réactifs de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td>Support pour bac réactif de 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>185290</td><td></td></tr><tr><td>Supports de pointes</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Supports de tubes de 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182245</td><td></td></tr><tr><td>Supports d'échantillons à 24 positions</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400</td><td></td></tr><tr><td>Support d'échantillons à 32 positions</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau 3. &lt;/strong&gt; Réactifs et équipements pour l'extraction d'ADN à grand volume à partir de plasma.</td></tr></tbody></table>

À haut débit, l&#39;extraction automatisée de l&#39;adn et de l&#39;arn dans des échantillons cliniques utilisant la technologie trutip sur des robots de manipulation de liquide commune

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip est une technologie d&#39;extraction de l&#39;acide nucléique simple au moyen duquel une matrice de liaison poreuse monolithique est insérée dans un embout de pipette. La géométrie du monolithe peut être adapté pour des embouts de pipette spécifiques variant en volume de 1,0 à 5,0 ml. La grande porosité du monolithe permet échantillons visqueux ou complexe pour passer facilement à travers elle avec un minimum de contre-pression fluidique. Flux bidirectionnel maximise le temps de séjour entre le monolithe et l&#39;échantillon et permet de grands volumes d&#39;échantillons à traiter dans un seul TruTip. Les étapes fondamentales, quel que soit le volume de l&#39;échantillon ou de la géométrie de TruTip, notamment la lyse cellulaire, un acide nucléique se liant aux pores intérieurs de l&#39;TruTip monolithe, élimination par lavage de composants de l&#39;échantillon non liés et des tampons de lyse, et à éluer les acides nucléiques purifiés et concentrés dans un tampon approprié. Les attributs et l&#39;adaptabilité de TruTip sont démontrées dans trois protocoles de traitement des échantillons cliniques automatisés utilisant un epMotion Eppendorf 5070, Hamilton STAR et StarPlus robots de manipulation de liquides, y compris l&#39;isolement d&#39;ARN à partir aspiration du nasopharynx, l&#39;isolement de l&#39;ADN génomique à partir de sang total, et l&#39;extraction de l&#39;ADN fœtal et à l&#39;enrichissement de grands volumes de plasma maternel (respectivement).

Données de la PCR en temps réel pour la grippe extraction d&#39;ARN à partir de NPA sont présentés dans la figure 5A. Estimation de l&#39;efficacité d&#39;extraction d&#39;acide nucléique est comparable aux résultats obtenus avec la version manuelle du protocole 15. Une réponse linéaire en moyenne les valeurs de C T est observé entre 10 4 et 10 6 gène copies ml -1 modifié la grippe (R 2 = 0,99 et 0,98 pour la grippe A et B, respectivement), avec des écarts types de la moyenne C t valeurs inférieures à 1 cycle. L&#39;absence de contamination croisée avec le système epMotion est démontré dans la figure 5B, où 12 échantillons positifs NPA contenant 10 6 gène copies ml -1 NPA étaient entrecoupées de 12 espaces de mémoire tampon. La moyenne C t pour les contrôles positifs était 30,16 ± 0,14, et tous les espaces tampons étaient négatifs. La durée totale du traitement de l&#39;échantillon est de 16, 28 et 40 min pour 8, 16 et 24 échantillons, respectivement.Parce que une aspiration du nasopharynx clinique typique ou un tampon contiendra 10 7 gène copies ml -1 (en supposant que 1000 virions par DICT 50 16 et&gt; 10 4 DICT 50 ml -1 grippe 17), est prévu au protocole de epMotion automatisé pour être efficace sur la majorité des spécimens NPA cliniques. Compte tenu de la gamme de tests moléculaires effectuées sur l&#39;ADN génomique humain, l&#39;objectif principal de l&#39;extraction des acides nucléiques à partir de sang total est de produire de l&#39;ADN génomique contaminant sans poids moléculaire élevé. Le protocole automatisé de 96 échantillons est terminée en 1 heure, ce qui est une amélioration par rapport à d&#39;autres systèmes automatisés (par exemple Promega MagneSil = 90 min et Qiagen QIAamp DNA sang BioRobot système MDx = 2,5 h). Figure 6A montre les profils d&#39;absorbance UV / VIS 45 échantillons sanguins positifs traités simultanément avec 45 blancs de réactifs sur le protocole Hamilton STAR, avec une moyenne A <sub&gt; 260/280 ratio de 1,96 et moyenne un ratio 260/230 de 1,93. Un A 260/280 rapport entre 1,7-2,0 et un ratio 260/230&gt; 1.7 indiquent en général des ADN très pur, exempt de sels résiduels, des protéines ou des solvants, et acceptable pour les applications moléculaires plus en aval. Le gel à 1% d&#39;agarose dans la figure 6B montre que le résultant d&#39;ADNg est de poids moléculaire élevé (&gt; 24 kb), avec un minimum de cisaillement. Le rendement de l&#39;acide nucléique moyenne de l&#39;ensemble des 45 échantillons positifs est de 5,26 ± 0,46 pg d&#39;ADN humain par 200 pi de sang total, basé sur les technologies Quantifiler Kit de quantification de l&#39;ADN Human Life. Études de contamination croisée similaires à ceux de la figure 5B ont été réalisées avec contrôle négatif blancs tampons entrecoupées avec les échantillons positifs et extrait en parallèle, tous les blancs étaient de nouveau négatif par PCR (non représenté). La purifié gDNA convient également pour de nombreuses autres analyses basées sur la PCR (non représenté). Résultats en temps réel de huit réplicats d&#39;un échantillon de plasma maternel commun traitées avec la procédure de TruTip grand volume sont présentés dans la figure 7. Le protocole complet (y compris hors ligne protéinase K incubation) est terminée en environ 2,5 heures, semblable au manuel Qiagen circulation Kit d&#39;acides nucléiques (pas de kits d&#39;extraction automatisés comparables sont encore disponibles). Les valeurs moyennes C t sur ​​toutes les répétitions sont 34,58 ± 0,66 et 29,76 ± 0,50 pour les hommes fœtale (CHY) et l&#39;ADN total (CH1), respectivement, ce qui démontre une excellente reproductibilité de la méthode d&#39;extraction automatique. La concentration de l&#39;ADN fœtal dans le pool total de l&#39;ADN (en équivalents génomiques), est calculée sur la base ajustement comparaison de l&#39;analyse des points aux normes, à la moyenne% d&#39;ADN fœtal résultant dans tous les échantillons de 2,8%. L&#39;ADN fœtal réelle% de cet échantillon est inconnu parce que les échantillons ont été regroupés avant d&#39;effectuer l&#39;extraction. Composition de l&#39;ADN fœtaléchantillons de plasma en non-regroupées extraites en utilisant la méthode de TruTip sont généralement 1,5 fois plus élevé par rapport aux résultats obtenus avec un kit d&#39;acides nucléiques circulant Qiagen (non représenté). <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Figure 1. Le procédé d&#39;extraction de TruTip et le flux de travail, indépendamment du système de manipulation de liquide. Autre préparation de l&#39;échantillon ou des étapes de manipulation de liquides peuvent être incorporés dans des routines automatiques en fonction des capacités de l&#39;instrument spécifique de traitement des liquides et des logiciels. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Figure 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 échantillon disposition de la plaque. (B) Arrangement de réactifs / Consumables sur la table de travail. la plaque d&#39;échantillons peuvent être configurés pour un maximum de 24 échantillons (colonnes 1, 5 et 9, respectivement), bien que le epMotion ne traitera un maximum de 8 échantillons simultanément. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Figure 3. Plan de pont Hamilton STAR pour la purification d&#39;ADN génomique à partir de sang total (pas à l&#39;échelle) Pont Position 1 = Hamilton 1 ml des conseils filtré;. 2 = Hamilton 1 ml conseils non-filtré; 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 TruTips mm; 4 = Entrée porte-échantillons de sang (tubes de prélèvement de sang ou des microtubes); 5-9 = 290 ml creux de réactifs pour Lysis Buffer F, l&#39;éthanol, le tampon de lavage J, tampon de lavage K et Elution Buffer A2, respectivement, 10 = 96 dEEP plaque bien reliure; 11 = 96 puits profond Laver J; 12 = 96 puits profond Laver K; 13 = 96 plaque d&#39;élution puits profond; 14 = Hamilton HHS2 chauffage / shaker avec Nunc 96 plaque d&#39;incubation puits profond; 15 = 50 ml de réactif creux contenant de la protéinase K. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> Figure 4. Hamilton plan de pont StarPlus pour purifier l&#39;ADN de grands échantillons de plasma de volume (pas à l&#39;échelle). Le système est équipé de 8 x 5 canaux ml et 8 canaux x 1 ml (non représenté sur le plan de pont). Pont Position 1 = Hamilton 4 ml des conseils filtré; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips, 3 = échantillons de plasma de source; 4 = 50 ml tubes coniques; 5 = 120 creux de réactifs ml contenant CN-W1, NC-W2 et CN-W4 reagents; 6 = creux de réactifs à faible volume contenant de la protéinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB et CN-W3 réactifs; 7 = 290 ml creux de réactif contenant réactif CN-L1; 8 = 290 ml de réactif bac contenant CN -B1 réactif; 9 = 96 plaques à puits profonds pour l&#39;étape 1, 10 = 96 assiettes creuses et pour l&#39;étape 2, 11 = transporteurs de l&#39;échantillon pour purifié, produit final; 12 = Hamilton 1 ml conseils non filtrés, 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Figure 5. (A). Résultats de la PCR en temps réel provenant de l&#39;extraction de TruTip automatisé des virus de la grippe ajoutés dans aspiration du nasopharynx (NPA). Le volume NPA entrée = 100 pi, le volume d&#39;élution = 50 pi. Résultats sont la moyenne de 3 e répétitionxtractions de 5 milieux NPA distincts (n = 15) par niveau de dilution et la cible de la grippe. qPCR a été effectuée sur le système LightCycler 480 avec des conditions d&#39;essai décrites précédemment 15. (B) Pas de contamination croisée est détectée lorsque 12 échantillons NPA positifs sont entrecoupées de contrôles sans matrice et soumis à la procédure d&#39;extraction automatisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> Figure 6. Résultats de l&#39;extraction de l&#39;ADN génomique humain à partir de sang total a.) Traces UV-visible à partir de 1000 NanoDrop (ThermoFisher) de 10 choisis au hasard répétitions. B) gel à 1% d&#39;agarose de TruTip purifié gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Les pistes 1 - 4 = ~ 100 ng purifié gDNA de quatre choisis au hasard répétitions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Figure 7. Résultats de la PCR en temps réel de huit extractions TruTip répétition de circuler librement ADN du plasma. Échantillons indiqués par des astérisques (* ou **) ont été extraits à des jours différents. CHY quantifie l&#39;ADN fœtal masculin et CH1 quantifie l&#39;ADN total actuel (maternelle et fœtale). qPCR a été effectuée sur un système LightCycler 480 (Roche) avec des essais publiés précédemment ciblant CHY et CH1 18.

TruTip est une technologie d&#39;extraction de l&#39;acide nucléique simple au moyen duquel une matrice de liaison poreuse monolithique est insérée dans un embout de pipette. Par conséquent, le format de la préparation de l&#39;échantillon est compatible avec les instruments de manipulation les plus liquides, et peut être utilisé pour de nombreuses applications cliniques à moyen et à haut débit et types d&#39;échantillons.

À haut débit, l&#39;extraction automatisée de l&#39;ADN et de l&#39;ARN dans des échantillons cliniques utilisant la technologie TruTip sur des robots de manipulation de liquide commune

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler l'ADN génomique humain à partir de sang total, en utilisant la technologie d'extraction par true tip et la station de manipulation de liquides Hamilton Star. Pour y parvenir, les cellules sont lysées dans une solution composée de tampon de lyse d'échantillon sanguin, de protéinase K et d'éthanol, qui est ensuite aspirée et dispensée à plusieurs reprises à travers les true tips, permettant ainsi la liaison de l'ADN à la matrice des true tips. Ensuite, deux tampons de lavage distincts sont passés à travers les true tips afin d'éliminer les protéines résiduelles, le tampon de lyse et d'autres contaminants des acides nucléiques liés.Dans la troisième étape, la matrice de liaison de la pointe vraie est séchée en aspirant et en dispensant de l'air plusieurs fois afin d'évaporer tout tampon de lavage résiduel ; lors de la dernière étape, le tampon illusion est fait circuler en va-et-vient à travers la matrice de liaison pour libérer l'ADN de cette matrice. Grâce à la technologie de la pointe vraie, de l'ADN génomique de haut poids moléculaire, exempt de contaminants, est ainsi extrait et peut être confirmé par absorbance UV-visible, électrophorèse sur gel, PCR quantitative ou séquençage. Les avantages de la pointe vraie par rapport à d'autres méthodes de préparation d'échantillons basées sur des colonnes de centrifugation ou des particules magnétiques résident dans le fait que la pointe vraie est facile à automatiser.Il ne nécessite pas de systèmes coûteux équipés de centrifugeuses et de tiges magnétiques, et le flux de travail simple permet d'économiser un espace précieux sur la paillasse. Bien que nous nous concentrions aujourd'hui sur le sang total, Tru Tip peut être appliqué à d'autres applications d'échantillons d'ADN génomique ainsi qu'à l'extraction d'ARN viral à partir d'échantillons de prélèvements cliniques ou à l'isolement d'ADN circulant libre de cellules à partir de plasma, pour ne citer que quelques exemples. La procédure sera démontrée par Dane Brady, ingénieur en automatisation dans notre laboratoire, qui a joué un rôle essentiel dans le développement de la procédure d'extraction Tru Tip sur la station de manipulation de liquides Hamilton.Dans ce protocole, un robot de manipulation de liquides Hamilton Star extrait simultanément de l'ADN à partir de 96 puits de sang total. Le Hamilton Star est équipé d'une unité de chauffage et d'agitation en option sur le plateau, ce qui est essentiel pour la digestion enzymatique de certaines matrices cliniques telles que le sang total. Étant donné que le système peut être équipé d'une tête de pipette à 96 canaux, une plaque de 96 puits est dédiée à chacune des étapes avec les pointes et les réactifs réels.D'abord, allumez l'équipement associé au robot Hamilton Star et l'ordinateur. Ouvrez le logiciel Hamilton Run Control. Ouvrez le fichier d'exécution fourni par ACON pour 96 échantillons.Configurez maintenant la disposition du plateau Star en suivant le schéma. Placez des pointes filtrées de un millilitre dans toutes les positions marquées un ; en position deux, placez des pointes non filtrées de un millilitre ; en position trois, placez des pointes Conni Hamilton de un millilitre LPT de deux millimètres. Continuez à vous référer au tableau pour remplir les positions restantes, de cinq à douze, avec les équipements LabWare requis, mais ne chargez pas encore les échantillons.Prélève maintenant les réactifs : 75 millilitres de tampon de lyse et de liaison. F doit être chargé dans la position cinq du réservoir. En alternative, des plaques préremplies avec des tampons peuvent également être utilisées afin d'optimiser le montage et de simplifier l'agencement du plateau.Continuez à charger le robot en conséquence. Enfin, retirez les bouchons des tubes de sang et placez-les dans les supports d'échantillons ou à la position quatre de la platine. Placez l'échantillon un à l'arrière du support le plus à gauche et progressez séquentiellement vers le bas de chaque support, en terminant avec l'échantillon 96 à la position avant droite.Une fois tous les échantillons chargés, laissez-les équilibrer à température ambiante. Étant donné que le protocole est entièrement automatisé, les erreurs d'opérateur sont peu probables. Les échantillons doivent être placés dans le bon ordre sur la platine, mais un codage par codes à barres peut être mis en œuvre pour garantir un suivi adéquat des échantillons.Pour démarrer un script automatisé, sélectionnez le bouton de lecture dans le coin supérieur gauche de la fenêtre du fichier d'exécution et saisissez le nombre d'échantillons à traiter. La première étape exécutée par le script consiste à transférer 80 microlitres de protéinase K dans la plaque d'incubation située à la position 14 du module chauffant agitateur. Ensuite, le script distribue 200 microlitres d'échantillon dans chaque puits de la plaque d'incubation à l'aide du bras à huit canaux.On procède ensuite au dispensage de 600 microlitres de tampon de lyse F dans chaque puits de la plaque d'incubation à l'aide du bras à 96 canaux. Le script mélange ensuite la solution pendant 10 cycles et incube les échantillons pendant 20 minutes à 70 degrés Celsius et 500 tr/min dans la plaque à puits profonds, la température étant uniquement de 60 degrés Celsius, ce qui se situe dans la plage d'activité de la protéinase K. Pendant l'incubation des échantillons, le système de manipulation des liquides continue de fonctionner en dispensant les réactifs d'extraction et d'élution depuis les réservoirs de réactifs bulk vers leurs plaques de 96 puits correspondantes ; 100 microlitres de tampon Elucian A sont ajoutés dans chaque puits de la plaque à puits profonds.À la position 13, 800 microlitres d'éthanol sont déposés dans chaque puits de la plaque à puits profonds. À la position 10, 1,6 millilitre de tampon de lavage K est ajouté à chaque puits de la plaque à puits profonds située à la position 12, et 1,6 millilitre de tampon de lavage J est ajouté à chaque puits de la plaque à puits profonds située à la position 11. Après une incubation de 20 minutes, le mélange d'échantillon est transféré de la plaque d'incubation vers la plaque à puits profonds contenant de l'éthanol à la position 10, où il est mélangé par 12 cycles de pipetage.Pendant tout le processus, les embouts de réactifs sont rejetés dans la poubelle selon les besoins. Le programme passe de l'étape de lyse à l'extraction de l'ADN en chargeant d'abord 96 embouts True à partir de la position trois de la platine. L'étape suivante consiste à aspirer et distribuer les échantillons en position 10 sur 10 cycles, permettant ainsi la fixation des acides nucléiques sur le monolithe de l'embout True.Ensuite, les pointes True se déplacent vers la position 11, où le tampon de lavage J est circulé à travers le monolithe cinq fois afin d'éliminer les résidus de lyse, de tampon et de matrice d'échantillon. Puis, les pointes True passent à la position 12, où le tampon de lavage K est circulé à travers elles cinq fois pour éliminer les protéines et autres contaminants des acides nucléiques liés. Ensuite, les pointes True s'assèchent à l'air en effectuant 80 cycles à grande vitesse au-dessus de la plaque de lavage.Maintenant, les pointes True se déplacent vers la position 13 où le tampon elucian A effectue deux cycles à travers elles cinq fois, libérant ainsi l'ADN dans la plaque à puits profonds. Les pointes True sont maintenant éjectées dans le bac de déchets. Le programme est désormais terminé.Retirez la plaque d'élution de l'appareil et transférez les échantillons extraits vers les tubes appropriés pour le stockage ou les applications en aval. Le programme peut également être personnalisé pour transférer automatiquement les échantillons finaux vers le tube ou la plaque de choix en seulement une heure. Le système automatisé a extrait l'ADN génomique de 96 échantillons de sang à l'aide du robot.Les profils d'absorbance de 45 échantillons sanguins positifs ont été traités simultanément avec 45 témoins de réactif. Le rapport moyen entre 260 et 280 était de 1,96, et le rapport moyen entre 260 et 230 était de 1,93, ce qui suggère des échantillons purs sur un gel d'agarose à 1 %. Des échantillons aléatoires présentaient un poids moléculaire élevé avec un cisaillement minimal.Le rendement moyen était d'environ cinq microgrammes d'ADN par 200 microlitres de sang total. Lors de l'optimisation du protocole automatisé avec pointe vraie, une attention particulière est portée afin de s'assurer qu'il n'y a aucune contamination croisée entre les puits. La PCR en temps réel montre une séparation nette entre les positifs et les négatifs, comme illustré ici.Pour les extractions d'ARN, l'extraction complète de 96 échantillons peut être réalisée en moins d'une heure avec un temps d'intervention manuelle minimal. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler l'ADN génomique humain à partir de sang total en utilisant la technologie automatisée TRU sur la station de manipulation de liquides Hamilton Star.

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Nous décrivons ici les modalités de l'extraction et de purification de l'ARNm et de métabolites...

Purification des relevés de notes et de métabolites<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes

Ce manuscrit décrit les protocoles cliniques de deux panels de séquençage de nouvelle génération. Un panel interroge les tumeurs malignes hématologiques tandis que l’autre panel cible les gènes couramment mutés dans les tumeurs solides. La classification moléculaire des mutations motrices dans les tumeurs malignes humaines offre des informations pronostiques et prédictives précieuses.

Le séquençage de prochaine génération pour la détection des Actionable mutations dans les tumeurs solides et liquides

La purification par affinité des ribosomes (TRAP) est capable de capturer la traduction spécifique du type cellulaire de l’ARNm. Nous rapportons ici le premier protocole TRAP dédié à l’isolement de l’ARNm dans des populations cellulaires rares d’embryons de drosophile.

TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Un système intégré pour le séquençage ciblé de nouvelle génération d’échantillons d’oncologie est décrit. Ce système multiplateforme est optimisé pour les biopsies tumorales de faible qualité et de faible quantité, s’adapte à de faibles entrées d’ADN, comprend des contrôles multivariants bien caractérisés et dispose d’un nouvel appelant de variant qui est informé par des mesures quantitatives de contrôle de la qualité pré-analytiques.

Intégration de Wet and Processes Banc sec Optimise ciblés Séquençage de nouvelle génération de faible qualité et à faible quantité biopsies de tumeurs

Est présenté ici, un workflow automatisé pour effectuer le montage de « dispositif » ADN modulaire en utilisant une méthode d’assemblage des ADN clonage modulaire sur les robots de manutention liquide. Le protocole utilise un outil logiciel intuitif pour générer des listes déroulantes gestionnaire liquide pour combinatoire génération de bibliothèque dispositif ADN, qui nous montrent l’utilisation de deux plates-formes de manipulation de liquides.

Automatisé de robotique Liquid Handling assemblage de dispositifs modulaires ADN

Obtention de l’ADN génomique de haute qualité provenant de tissus de la tumeur est une première étape essentielle pour l’analyse des altérations génétiques à l’aide de séquençage de la génération suivant. Dans cet article, nous présentons une méthode simple et rapide pour enrichir les cellules tumorales et obtenir des ADN intact de toucher les échantillons de cytologie mentions légales.

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

Nous présentons une approche pour purifier l'ARNm ribosome-lié des cellules endothéliales vasculaires (ECs) directement dans le cerveau de souris, poumon et tissus cardiaques par l'intermédiaire de l'étiquette génétique EC-spécifique de la protéine verte améliorée de fluorescence (EGFP) dans des ribosomes en combination avec la purification d'ARN .

Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Un protocole détaillé et trois scripts Python sont fournis pour l’exploitation d’un système de manipulation robotique de liquides open source permettant d’effectuer une préparation semi-automatisée d’échantillons de protéines pour des expériences de spectrométrie de masse, couvrant l’élimination des détergents, la digestion des protéines et les étapes de dessalement des peptides.

Traitement des échantillons protéomiques Shotgun automatisé par un robot de laboratoire open source

Ce protocole vise à isoler les ARNm ribosomales de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP.

Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Le protocole décrit une méthode de diagnostic du SRAS-CoV-2 qui utilise l’automatisation open source pour effectuer des tests moléculaires RT-qPCR sur des échantillons de salive. Cette approche évolutive peut être appliquée à la surveillance clinique de la santé publique ainsi qu’à l’augmentation de la capacité des petits laboratoires universitaires.

Stratégie de diagnostic de la salive par PCR à transcriptase inverse quantitative efficace du SRAS-CoV-2 utilisant des robots de pipetage open source

Ce protocole décrit une méthode rentable pour accélérer l’extraction d’ADN plasmidique. En utilisant des racks personnalisés imprimés en 3D compatibles avec des rotors à plaques à godets pivotants standards, les chercheurs peuvent traiter jusqu’à 48 colonnes de rotation avec des capuchons ou jusqu’à 116 colonnes de rotation sans capuchons simultanément, réduisant significativement le temps de manipulation par rapport aux méthodes manuelles de microcentrifugeuse.

Extraction d’ADN de colonne à débit moyen utilisant des racks à 24 puits

Découvrez l'extraction automatisée d'ADN génomique à partir de sang total utilisant la technologie TruTip sur le robot Hamilton Star. Cette méthode haut débit élimine les centrifugeuses et offre une pureté optimale pour les applications cliniques.

À haut débit, lextraction automatisée de lADN et de lARN dans des échantillons cliniques utilisant la technologie TruTip sur des robots de manipulation de liquide commune (Vidéo) | JoVE Journal

À haut débit, l'extraction automatisée de l'ADN et de l'ARN dans des échantillons cliniques utilisant la technologie TruTip sur des robots de manipulation de liquide commune

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