À haut débit, l'extraction automatisée de l'ADN et de l'ARN dans des échantillons cliniques utilisant la technologie TruTip sur des robots de manipulation de liquide commune

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler l'ADN génomique humain à partir de sang total, en utilisant la technologie d'extraction par true tip et la station de manipulation de liquides Hamilton Star. Pour y parvenir, les cellules sont lysées dans une solution composée de tampon de lyse d'échantillon sanguin, de protéinase K et d'éthanol, qui est ensuite aspirée et dispensée à plusieurs reprises à travers les true tips, permettant ainsi la liaison de l'ADN à la matrice des true tips. Ensuite, deux tampons de lavage distincts sont passés à travers les true tips afin d'éliminer les protéines résiduelles, le tampon de lyse et d'autres contaminants des acides nucléiques liés.

Dans la troisième étape, la matrice de liaison de la pointe vraie est séchée en aspirant et en dispensant de l'air plusieurs fois afin d'évaporer tout tampon de lavage résiduel ; lors de la dernière étape, le tampon illusion est fait circuler en va-et-vient à travers la matrice de liaison pour libérer l'ADN de cette matrice. Grâce à la technologie de la pointe vraie, de l'ADN génomique de haut poids moléculaire, exempt de contaminants, est ainsi extrait et peut être confirmé par absorbance UV-visible, électrophorèse sur gel, PCR quantitative ou séquençage. Les avantages de la pointe vraie par rapport à d'autres méthodes de préparation d'échantillons basées sur des colonnes de centrifugation ou des particules magnétiques résident dans le fait que la pointe vraie est facile à automatiser.

Il ne nécessite pas de systèmes coûteux équipés de centrifugeuses et de tiges magnétiques, et le flux de travail simple permet d'économiser un espace précieux sur la paillasse. Bien que nous nous concentrions aujourd'hui sur le sang total, Tru Tip peut être appliqué à d'autres applications d'échantillons d'ADN génomique ainsi qu'à l'extraction d'ARN viral à partir d'échantillons de prélèvements cliniques ou à l'isolement d'ADN circulant libre de cellules à partir de plasma, pour ne citer que quelques exemples. La procédure sera démontrée par Dane Brady, ingénieur en automatisation dans notre laboratoire, qui a joué un rôle essentiel dans le développement de la procédure d'extraction Tru Tip sur la station de manipulation de liquides Hamilton.

Dans ce protocole, un robot de manipulation de liquides Hamilton Star extrait simultanément de l'ADN à partir de 96 puits de sang total. Le Hamilton Star est équipé d'une unité de chauffage et d'agitation en option sur le plateau, ce qui est essentiel pour la digestion enzymatique de certaines matrices cliniques telles que le sang total. Étant donné que le système peut être équipé d'une tête de pipette à 96 canaux, une plaque de 96 puits est dédiée à chacune des étapes avec les pointes et les réactifs réels.

D'abord, allumez l'équipement associé au robot Hamilton Star et l'ordinateur. Ouvrez le logiciel Hamilton Run Control. Ouvrez le fichier d'exécution fourni par ACON pour 96 échantillons.

Configurez maintenant la disposition du plateau Star en suivant le schéma. Placez des pointes filtrées de un millilitre dans toutes les positions marquées un ; en position deux, placez des pointes non filtrées de un millilitre ; en position trois, placez des pointes Conni Hamilton de un millilitre LPT de deux millimètres. Continuez à vous référer au tableau pour remplir les positions restantes, de cinq à douze, avec les équipements LabWare requis, mais ne chargez pas encore les échantillons.

Prélève maintenant les réactifs : 75 millilitres de tampon de lyse et de liaison. F doit être chargé dans la position cinq du réservoir. En alternative, des plaques préremplies avec des tampons peuvent également être utilisées afin d'optimiser le montage et de simplifier l'agencement du plateau.

Continuez à charger le robot en conséquence. Enfin, retirez les bouchons des tubes de sang et placez-les dans les supports d'échantillons ou à la position quatre de la platine. Placez l'échantillon un à l'arrière du support le plus à gauche et progressez séquentiellement vers le bas de chaque support, en terminant avec l'échantillon 96 à la position avant droite.

Une fois tous les échantillons chargés, laissez-les équilibrer à température ambiante. Étant donné que le protocole est entièrement automatisé, les erreurs d'opérateur sont peu probables. Les échantillons doivent être placés dans le bon ordre sur la platine, mais un codage par codes à barres peut être mis en œuvre pour garantir un suivi adéquat des échantillons.

Pour démarrer un script automatisé, sélectionnez le bouton de lecture dans le coin supérieur gauche de la fenêtre du fichier d'exécution et saisissez le nombre d'échantillons à traiter. La première étape exécutée par le script consiste à transférer 80 microlitres de protéinase K dans la plaque d'incubation située à la position 14 du module chauffant agitateur. Ensuite, le script distribue 200 microlitres d'échantillon dans chaque puits de la plaque d'incubation à l'aide du bras à huit canaux.

On procède ensuite au dispensage de 600 microlitres de tampon de lyse F dans chaque puits de la plaque d'incubation à l'aide du bras à 96 canaux. Le script mélange ensuite la solution pendant 10 cycles et incube les échantillons pendant 20 minutes à 70 degrés Celsius et 500 tr/min dans la plaque à puits profonds, la température étant uniquement de 60 degrés Celsius, ce qui se situe dans la plage d'activité de la protéinase K. Pendant l'incubation des échantillons, le système de manipulation des liquides continue de fonctionner en dispensant les réactifs d'extraction et d'élution depuis les réservoirs de réactifs bulk vers leurs plaques de 96 puits correspondantes ; 100 microlitres de tampon Elucian A sont ajoutés dans chaque puits de la plaque à puits profonds.

À la position 13, 800 microlitres d'éthanol sont déposés dans chaque puits de la plaque à puits profonds. À la position 10, 1,6 millilitre de tampon de lavage K est ajouté à chaque puits de la plaque à puits profonds située à la position 12, et 1,6 millilitre de tampon de lavage J est ajouté à chaque puits de la plaque à puits profonds située à la position 11. Après une incubation de 20 minutes, le mélange d'échantillon est transféré de la plaque d'incubation vers la plaque à puits profonds contenant de l'éthanol à la position 10, où il est mélangé par 12 cycles de pipetage.

Pendant tout le processus, les embouts de réactifs sont rejetés dans la poubelle selon les besoins. Le programme passe de l'étape de lyse à l'extraction de l'ADN en chargeant d'abord 96 embouts True à partir de la position trois de la platine. L'étape suivante consiste à aspirer et distribuer les échantillons en position 10 sur 10 cycles, permettant ainsi la fixation des acides nucléiques sur le monolithe de l'embout True.

Ensuite, les pointes True se déplacent vers la position 11, où le tampon de lavage J est circulé à travers le monolithe cinq fois afin d'éliminer les résidus de lyse, de tampon et de matrice d'échantillon. Puis, les pointes True passent à la position 12, où le tampon de lavage K est circulé à travers elles cinq fois pour éliminer les protéines et autres contaminants des acides nucléiques liés. Ensuite, les pointes True s'assèchent à l'air en effectuant 80 cycles à grande vitesse au-dessus de la plaque de lavage.

Maintenant, les pointes True se déplacent vers la position 13 où le tampon elucian A effectue deux cycles à travers elles cinq fois, libérant ainsi l'ADN dans la plaque à puits profonds. Les pointes True sont maintenant éjectées dans le bac de déchets. Le programme est désormais terminé.

Retirez la plaque d'élution de l'appareil et transférez les échantillons extraits vers les tubes appropriés pour le stockage ou les applications en aval. Le programme peut également être personnalisé pour transférer automatiquement les échantillons finaux vers le tube ou la plaque de choix en seulement une heure. Le système automatisé a extrait l'ADN génomique de 96 échantillons de sang à l'aide du robot.

Les profils d'absorbance de 45 échantillons sanguins positifs ont été traités simultanément avec 45 témoins de réactif. Le rapport moyen entre 260 et 280 était de 1,96, et le rapport moyen entre 260 et 230 était de 1,93, ce qui suggère des échantillons purs sur un gel d'agarose à 1 %. Des échantillons aléatoires présentaient un poids moléculaire élevé avec un cisaillement minimal.

Le rendement moyen était d'environ cinq microgrammes d'ADN par 200 microlitres de sang total. Lors de l'optimisation du protocole automatisé avec pointe vraie, une attention particulière est portée afin de s'assurer qu'il n'y a aucune contamination croisée entre les puits. La PCR en temps réel montre une séparation nette entre les positifs et les négatifs, comme illustré ici.

Pour les extractions d'ARN, l'extraction complète de 96 échantillons peut être réalisée en moins d'une heure avec un temps d'intervention manuelle minimal. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler l'ADN génomique humain à partir de sang total en utilisant la technologie automatisée TRU sur la station de manipulation de liquides Hamilton Star.