Name: En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique in vivo des neurones chez C. elegans en utilisant des indicateurs fluorescents génétiquement encodés comme GCaMP et Chameleon. Cette méthode permet de mesurer l'activité neuronale et la physiologie calcique en réponse à des stimuli sensoriels et des lésions cellulaires.

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Plusieurs personnes ont contribué aux travaux décrits dans le présent document. CVG a construit le dispositif expérimental, et LS, SHC, et CVG a effectué les expériences. CVG et SHC a écrit le manuscrit. Tous les auteurs par la suite participé au processus de révision et approuvé la version finale du manuscrit. Nous remercions Paul Sternberg pour la souche GCaMP. Certaines souches de nématodes utilisées dans ce travail ont été fournies par le Centre de Caenorhabditis Genetics (CCG), qui est financé par le NIH Centre National de Ressources de recherche (NCRR). Le programme MATLAB analyse d&#39;image a été adaptée de celle utilisée dans 18 ans. Les auteurs ont été pris en charge par l&#39;Université de Boston et le Massachusetts Life Sciences Center.

1. Configuration optique <ol><li> Utiliser un microscope composé standard avec des capacités d&#39;imagerie à épifluorescence. Nous utilisons un Nikon Eclipse Ti-U microscope inversé avec un illuminateur Intensilight HG. </li><li> Pour une meilleure qualité d&#39;image et du signal utiliser un fort grossissement, objectif haute ouverture numérique. Nous utilisons généralement un Nikon X60 1.4 Objectif NA immersion dans l&#39;huile. Dans certains cas, il est possible d&#39;utiliser plus faible grossissement (X40, X20) en fonction du niveau d&#39;expression du fluorophore et la force du signal. </li><li> Utilisez une haute sensibilité refroidie caméra CCD, comme une caméra Andor Clara afin de maximiser la sensibilité des images et minimiser le bruit de fond. </li><li> Pour fluorophores d&#39;une seule couleur, utilisez le filtre de fluorescence microscope standard conçu pour régler la longueur d&#39;onde particulière du fluorophore. Pour GCaMP utiliser une norme GFP filtre optimisé pour la excitation à 488 nm et une émission à 525 nm. Aucune autre modification optiques sont nécessaires. </li><li&gt; Pour les fluorophores ratiométriques, comme cameleon, utilisez un système d&#39;imagerie à double tel que des images identiques peuvent être simultanément capturé à deux longueurs d&#39;onde distinctes. Ceci est obtenu en projetant les images doubles côte à côte sur la caméra. Une configuration simple à faire, en utilisant des composants optiques de base sur une planche à pain de qualité optique, est illustrée à la figure 1. Il se compose de: <ol class="ualpha"><li> Un filtre microscope réglé avec 440 ± 20 nm et filtre d&#39;excitation 455 nm de long passent miroir dichroïque. </li><li> Un masque d&#39;image placé dans le plan image initiale immédiatement à l&#39;extérieur du microscope d&#39;imagerie port (où le capteur de la caméra CCD qui siègent habituellement). Cela restreint le champ de vue de telle sorte qu&#39;il ne remplir que la moitié de capteur de la caméra. Plaçant ce masque les résultats premier plan d&#39;image dans l&#39;image des frontières nettes et sans chevauchement, lorsque les deux images sont projetées côte à côte. </li><li> L&#39;objectif premier relais définir une longueur focale loin de til plan de l&#39;image initiale telle qu&#39;elle collimate la lumière. </li><li> Un miroir dichroïque qui divise la lumière en deux longueurs d&#39;onde d&#39;imagerie ou canaux séparés reflétant une couleur (&gt; 515 nm, jaune) tout en transmettant l&#39;autre (&lt;515 nm, cyan). </li><li> Filtres d&#39;émission (filtres passe-bande) restreignant encore la lumière transmise aux longueurs d&#39;onde d&#39;imagerie spécifiques (cyan à 485 ± 40 nm et jaune à 535 ± 30 nm), </li><li> Les lentilles relais seconde (une par canal) placés dans les trajets des faisceaux de telle sorte qu&#39;il se recentre la lumière à un second plan image à la caméra CCD. </li><li> Une paire de miroirs et un second miroir dichroïque dirige les chemins de faisceaux de telle sorte que les deux images sont projetées recombinés et côte-à-côte sur le capteur de la caméra CCD. Figure 4A montre un exemple de l&#39;image résultante. </li></ol></li><li> Alignement optique initiale: Lancer l&#39;installation et l&#39;alignement de l&#39;optique avec une imagerie à haut contrastee l&#39;aide d&#39;une lentille de faible grossissement et éclairage en lumière transmise à grand champ (un Sharpie noir tiré sur une lame de microscope fonctionne bien). Amener l&#39;image à focaliser à travers les oculaires du microscope et ensuite commuté sur le port de microscope à être utilisé. Avec un éclairage de lumière élevée afficher l&#39;image sur une fiche au niveau du plan focal initial (quelques centimètres en dehors du port microscope). Placer la lentille premier relais (C) dans le trajet du faisceau de telle sorte qu&#39;il est une distance focale à partir du plan focal initial et collimate la lumière sans dévier la trajectoire du faisceau (par exemple est directement centré dans le trajet du faisceau). Placer le masque sur le premier plan focal, adapté pour restreindre moitié du champ de vision et produire une frontière dans l&#39;image nette. Positionner les miroirs et filtres (D, E, G) de telle sorte que le trajet du faisceau reste parallèle à la surface de la table et se déroule en deux voies parallèles côte-à-côte, comme représenté sur la figure 1B. Centre des lentilles relais secondes (F) dans leurs chemins de faisceaux respectifs etles déplacer d&#39;avant en arrière le long des chemins de mettre les images à mettre l&#39;accent sur une fiche placée étaient capteur de la caméra CCD sera. Si fait correctement les deux images doivent être parfocale avec les oculaires du microscope et caméra ports autres. Enfin placez l&#39;appareil en place et d&#39;affiner l&#39;alignement. </li><li> Alignement Fine Tuning optique: Utiliser la double image vue par la caméra CCD pour ajuster l&#39;alignement optique. Utiliser une image au contraste élevé et de commencer avec grossissement plus faible, le passage à un plus fort grossissement pour l&#39;alignement final. Positionner l&#39;image transmise (cyan canal dans la figure 1B) pour couvrir une moitié de champ de la caméra de vision de la caméra par déplacement de la position X et Y. l&#39;image réfléchie (canal jaune dans la figure 1B) pour couvrir l&#39;autre moitié de la zone de voir par ajustement des deux derniers miroirs (G) dans sa trajectoire de faisceau. Optimiser concentrer en déplaçant la lentille de relais seconde pour chaque canal d&#39;avant en arrière le long de la trajectoire du faisceau. Si elle n&#39;est pasinchangé le système optique doit être stable et ne nécessitent rare ajustement peaufiner. </li></ol> 2. Préparation des échantillons et d&#39;acquisition de données. <ol><li> Acquérir les animaux exprimant un fluorophore sensible au calcium dans le neurone d&#39;intérêt à partir du Centre de Caenorhabditis Genetics (CCG) ou d&#39;autres sources. Sinon animaux transgéniques peuvent être construits en utilisant la norme C. techniques elegans. Expression seule cellule n&#39;est pas nécessaire (et parfois pas souhaitable si plusieurs neurones sont à étudier, voir 12) aussi longtemps que les images et les mesures partir de plusieurs cellules peuvent être facilement séparées. Si le transgène fluorophore n&#39;est pas intégré dans le génome, variation significative de l&#39;expression peut se produire à partir de l&#39;animal à animal. Dans ce cas, la présélection des animaux avec des niveaux d&#39;expression plus élevés en utilisant un microscope à fluorescence dissection augmente le rapport signal sur bruit et améliore les mesures. Niveaux d&#39;expression fluorophores need soit suffisante pour être facilement imagée avec l&#39;appareil selon les paramètres d&#39;acquisition requis par l&#39;expérience. </li><li> Faire les coussinets d&#39;agarose nécessaires à la technique d&#39;immobilisation désiré (voir le point 2.3 ci-dessous) en appuyant sur une petite goutte d&#39;agarose fondu entre deux lames de verre espacées de deux morceaux de ruban de laboratoire. Si nécessaire, blocs d&#39;agarose peuvent être transférées à une lamelle de verre avant de monter les animaux. Voir la figure 2. </li><li> Immobiliser C. elegans pour l&#39;imagerie en utilisant une des techniques suivantes: <ol class="ualpha"><li> Paralysie pharmacologique: Ajouter lévamisole 0,05% à 2% d&#39;agarose (plots de le mélanger dans le agarose fondu avant de faire les plots de 2,2). Choisissez 5-10 animaux sur le tampon et couvrir avec une lamelle. Appliquer de petites quantités de mélange de cire de paraffine chaude (50% et 50% de vaseline) sur les coins de la lamelle couvre-objet pour le maintenir en position. Permettez 5-10 min pour le lévamisole à prendre effet et les animaux à become complètement immobile. </li><li> Stiff Immobilisation Agarose: C. elegans peut être physiquement immobilisé à l&#39;aide raides 10% coussinets d&#39;agarose et 0,05 um de diamètre des nanoparticules de polystyrène. 10% d&#39;agarose faire plots (10% d&#39;agarose dans du tampon NGM en poids) que dans 2,2. Ajouter ~ 3 pl de solution de talon (1:10 en polystyrène NGM microsphères en volumes) au début du tampon. Rapidement, choisissez 5-10 C. elegans dans la piscine de solution de billes sur le tapis et recouvrez doucement avec une lamelle. Utiliser la cire fondue appliquée sur les coins de la lamelle couvre-objet pour le maintenir en position. (Pour plus de détails sur cette technique voir 7 ainsi que d&#39;un article précédent JoVE 8) </li><li> Collage: C. elegans peut être collé en place à l&#39;aide de petites quantités d&#39;adhésif de qualité vétérinaire appliquée sur un côté de l&#39;animal. </li><li> Dispositifs microfluidiques: De nombreux dispositifs microfluidiques ont été conçus pour tenir physiquement C. elegans en place pour l&#39;imagerie. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Placer les lames préparées sur le microscope et de se concentrer sur le neurone désiré. Il est souvent plus facile de trouver le C. elegans en utilisant un éclairage en fond clair et un faible grossissement. Puis passer à fort grossissement et l&#39;imagerie de fluorescence de trouver et de se concentrer sur le neurone spécifique. </li><li> Stimulus: Si une réponse neuronale à un stimulus spécifique est souhaitée (lumière, champ électrique, les indices gustatifs et olfactifs, température, etc), le dispositif de relance doit être conçu dans la configuration du microscope, de sorte qu&#39;il peut être administré à des animaux dans le préparation de l&#39;échantillon tandis que l&#39;imagerie. </li><li> Acquérir des images à l&#39;aide de la caméra CCD microscope. Les temps d&#39;exposition et le niveau de lumière d&#39;excitation dépend du signal de référence et le niveau d&#39;expression du fluorophore, avec des signaux plus faibles nécessitant des temps d&#39;exposition plus longs avec une résolution temporelle de façon concordante moins. Nous utilisons généralement ~ 300 msec temps d&#39;exposition. </li><li> Acquérir les images individuellement ou en tant que timoi-lapse film. Parce C. neurones elegans généralement afficher une dynamique d&#39;activation lente (c&#39;est à dire qu&#39;ils manquent de potentiels d&#39;action à base de sodium), des cadences relativement lentes de ~ 1 sec sont souvent suffisantes pour mesurer la dynamique des neurones. Le taux d&#39;acquisition jusqu&#39;à ~ 90 images par seconde ont été utilisés, bien que ceux-ci peuvent être limités par le temps d&#39;intégration nécessaire pour la fluorescence est faible. Les films individuels d&#39;un seul neurone peut facilement s&#39;étendre pendant plusieurs minutes (min ~ 5-10) ou plus si la préparation immobilisation est stable et le taux de trame relativement lente. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Il ya un certain nombre de différents logiciels d&#39;imagerie fluorescentes disponibles avec des capacités d&#39;analyse dynamique et ratiométrique y compris ImageJ et NIS-Elements. Nous utilisons une simple coutume MATLAB programme qui mesure le signal fluorescent moyenne sur une zone d&#39;intérêt sélectionnée. </li><li> Pour les images individuelles (ou time-lapse films qui restentparfaitement immobile), sélectionnez une région d&#39;intérêt (ROI) dans le neurone imagé et une région séparée proximité pour la mesure de fond. Pour sélectionner des images ratiométriques ROI similaire et régions de fond pour chacune des images doubles. </li><li> Un léger mouvement du neurone imagé dans un film time-lapse nécessite une analyse complémentaire pour sélectionner automatiquement le retour sur investissement pour chaque image, ce qui peut être accompli en utilisant de nombreux systèmes de suivi d&#39;objets. Notre programme affiche une image compressée de toutes les images dans le film à partir de laquelle une frontière rugueuse (englobant l&#39;objet d&#39;intérêts dans tous les cadres) est sélectionné manuellement et une région de fond indépendant choisi. Pour la première trame, une ROI est sélectionné manuellement à partir de l&#39;intérieur de la zone limite. Pour chaque trame suivante, le programme sélectionne les pixels les plus clairs dans la zone de limite afin de générer un retour sur investissement de la bonne taille (c&#39;est à dire le même nombre de pixels que la première trame d&#39;emploi ROI). Pour les images, où l&#39;objectift d&#39;intérêts est suffisamment brillante alors le fond environnant dans la région frontière de ce protocole sélectionne un retour sur investissement raisonnable pour chaque trame. </li><li> Le signal fluorescent, F, pour chaque trame est calculée comme l&#39;intensité de pixel moyenne dans la région d&#39;intérêt moins l&#39;intensité moyenne dans la région de fond. Ratiométriques valeurs sont calculées comme le rapport des deux signaux (YFP-YFP fond) / (PCP PCP-fond) -0,65. Le facteur de 0,65 compense purge par le biais du canal PCP dans le canal YFP, qui sera fonction des fluorophores ainsi que l&#39;ensemble filtre particulier utilisé (cette valeur est généralement d&#39;environ 0,6 pour les configurations cameleon). </li><li> Le niveau de calcium par rapport à chaque trame est calculée comme étant la variation en pour cent intensité normalisée à une valeur de référence initiale mesurée à partir de la première image (ou d&#39;une série de trames): AF / F = (F (t)-F o) / F o, où F (t) est la fluorescence à l&#39;instant t et F oest la valeur de base initiale. </li><li> Un retour sur investissement sélectionnant le corps de la cellule génère les signaux les plus forts les plus robustes, mais il est également possible de sélectionner et mesurer des signaux à partir d&#39;un retour sur investissement sur les processus nerveux. </li></ol> 4. Résolution de problèmes <ol><li> Blanchiment: Exposition à la lumière d&#39;excitation peut causer un blanchiment du fluorophore et est marquée par une baisse constante du signal qui dépend des niveaux d&#39;exposition. Mesures ratiométrique aider à compenser cela. Cependant sélective de blanchiment d&#39;une longueur d&#39;onde peut encore se produire (en général des agents de blanchiment de la PCP rapide puis YFP). Si blanchiment se réduire le niveau d&#39;exposition de la lumière par la réduction des temps d&#39;exposition et / ou de l&#39;intensité d&#39;excitation (avec filtres de densité neutre dans la voie de l&#39;illumination). Si nécessaire, on peut compenser de blanchiment en cours d&#39;exécution par des essais simulés (avec la même exposition excitation mais aucun stimulus neuronale) et la quantification de la constante de temps de décroissance du signal. </li><li><strong&gt; Immobilisation: Pour l&#39;analyse d&#39;image simple décrite ici, il est essentiel que l&#39;animal reste relativement immobile pendant toute la période d&#39;enregistrement C.. elegans répondre à la lumière d&#39;exposition et les stimuli expérimentaux, ce qui les rend plus susceptibles de se déplacer au moment de l&#39;enregistrement. Un léger mouvement peut introduire un bruit important dans la mesure en particulier lors de la mesure des processus axone. Analyse radiométrique permet d&#39;atténuer ces effets dans une certaine mesure et les mesures du corps cellulaire sont plus robustes. Une exécution soignée et le raffinement des procédures d&#39;immobilisation se traduira par encore complètement les animaux. </li><li> Sélection Contexte: sélection soigneuse d&#39;une région de fond est nécessaire pour l&#39;analyse d&#39;image réussie. Régions d&#39;arrière-plan doit être raisonnablement uniforme et sombre alors le neurone imagé. Il doit être suffisamment éloigné pour éviter la lumière diffusée (et donc un signal de capteur) du neurone imagé. Nous trouvons une région uniforme 20-50 um du ROI fonctionne bien dans la plupart des cas. </li><li> Optique ratiométriques: Corriger l&#39;alignement de l&#39;optique d&#39;imagerie est essentielle pour produire une image claire double. Accessoires de microscope pour l&#39;imagerie ratiométrique commerciaux sont disponibles. Une autre technique consiste à utiliser l&#39;imagerie rapide séquentiel en utilisant une roue de filtre rapide pour passer rapidement entre les longueurs d&#39;onde d&#39;émission tout en enregistrant des images séparées pour chaque. </li><li> Analyse radiométrique: L&#39;analyse décrite ici est une technique relativement simple qui génère des signaux robustes en vertu de moyenne sur un retour sur investissement. Il nécessite un objet lumineux reconnue pour sélectionner le retour sur investissement. Plus sophistiqué d&#39;analyse ratiométrique est possible par la cartographie et aligner avec précision les images doubles telles que le rapport fluorescent peut être calculée pixel par pixel. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Indicateurs de calcium génétiquement codés ont été largement utilisés dans C. elegans neurobiologie. De nombreux groupes ont utilisé ces techniques pour étudier la réponse des neurones sensoriels primaires à des stimuli externes comme démontré ici avec la réponse ASJ à un champ électrique. Exemples les plus notables figurent sensation du toucher mécanique, des produits chimiques spécifiques, de la température et un champ électrique 12, 16-19. L&#39;activité des interneurones et les cellules musculair...

Nous présentons ici des méthodes pratiques pour l&#39;imagerie in vivo de calcium dans C. neurones elegans. Le développement de la codés génétiquement sensible au calcium avec une grande fluorophores signal sur bruit rend C. elegans un système relativement simple et rentable pour la mesure de la neurophysiologie et de l&#39;activité. Notre formation d&#39;image est effectuée avec un microscope standard à l&#39;aide d&#39;imagerie à grand champ de fluorescence des fluorophores couramment disponibles. Nous présentons plusieurs techniques employant différents fluorophores et la préparation des échantillons différents, de discuter les forces et les faiblesses de chacun. Les données sont ensuite présentées à partir de deux expériences exemple. Une excellente ressource supplémentaire sur les techniques décrites ici peuvent être trouvés dans WormBook, &quot;Imagerie l&#39;activité des neurones et les muscles&quot; de R. Kerr, ( <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Deux grandes classes d&#39;génétiquementment codées reporters fluorescents de calcium sont couramment utilisés dans C. elegans: GCaMP seul canal et FRET à base de cameleon. Nous allons décrire les méthodes et montrer des exemples de données générés par chacun. GCaMP est basé sur une modification de la protéine fluorescente verte (GFP) qui est sensible à la concentration de calcium environnante. Ceci est réalisé par fusion de la GFP et de la calmoduline de calcium de haute affinité protéine, de telle sorte que la fixation du calcium par la calmoduline de la molécule apporte une confirmation dans la GFP efficace fluorescent 2. Les récents progrès dans ces fluorophores générer taille exceptionnelle du signal avec une augmentation jusqu&#39;à 500% de l&#39;intensité de fluorescence dans une gamme physiologique de la calcémie et de la cinétique relativement rapide de ~ 95 ms de temps de montée et temps de descente ~ 650 msec 4. Sur des périodes de temps relativement courtes (minutes), ces signaux peuvent permettre grandes pour l&#39;imagerie basse résolution (faible grossissement) et, étant donné un sage init amesure de référence ial, nier la nécessité pour base continue ou mesures comparatives. Cameleon a l&#39;avantage d&#39;être un fluorophore FRET basée sur une mesure qui génère ratiométrique comparaison de deux canaux indépendants ou longueurs d&#39;onde 1. Il se compose de deux fluorophores séparés (cyan et jaune émettant des protéines fluorescentes, CFP et YFP) reliés par une protéine calmoduline. Le complexe est éclairé par la lumière bleue (440 nm) qui excite la PCP. Fixation du calcium apporte les fluorophores se rapprocher, ce qui augmente le transfert d&#39;énergie de fluorescence par résonance (FRET) à partir de la PCP (donneur) de la YFP (accepteur) et provoquer l&#39;émission de la PCP (480 nm) et pour diminuer l&#39;émission YFP (535 nm) pour augmenter . Le taux de calcium relatifs sont mesurés par le rapport de l&#39;intensité de la YFP / PCP. Cameleon cinétique est plus lente que celle de GCaMP, mesurée in vivo pour avoir un temps de montée d&#39;environ 1 s et un temps de décroissance de 3 ~ 5 sec. Cependant,le rapport des signaux en opposition mobiles augmente la taille du signal et pour compenser un certain nombre d&#39;objets possibles à cause de changements de concentration en fluorophore, de mouvement ou de la dérive et de mise au point de blanchiment. Génétiquement codés rapporteurs fluorescents annuler une grande partie de la préparation des échantillons avec des sondes exogènes administrées et C. elegans petit corps transparent permet l&#39;imagerie chez l&#39;animal intact en utilisant de simples fluorescence large champ. Le principal défi technique dans la préparation des échantillons est donc d&#39;immobiliser les animaux en toute sécurité. Il ya un certain nombre de différentes techniques couramment utilisées chacune avec des avantages et des inconvénients. L&#39;utilisation d&#39;un agent pharmacologique de paralyser les animaux est facile à mettre en œuvre et permet le montage de plusieurs animaux sur une préparation (lévamisole, un agoniste cholinergique qui provoque le tissu musculaire à saisir est généralement utilisé 6). C. elegans peut aussi être physiquement immobilisé par leur montagele raide 10% d&#39;agarose 7, 8. Cet impact réduit sur la physiologie des animaux, permet à long terme d&#39;imagerie (heures) et la récupération de plusieurs animaux, mais est techniquement plus difficile. Ces deux techniques limiter l&#39;accès physique aux animaux (qui sont sous une lamelle) et ne peut donc être utilisé avec certains stimuli expérimentaux (tels que la lumière, la température, champ électrique ou de dommage au laser). Pour les stimuli où l&#39;accès physique est nécessaire, comme le toucher ou l&#39;administration de produits chimiques, de nombreuses études ont réussi à coller C. elegans en place (en utilisant de la colle d&#39;vétérinaire) 9. Ce qui est techniquement plus difficile, est une préparation unique animal et ne permet pas la récupération des animaux. Enfin, de nombreux dispositifs microfluidiques ont été employées que physiquement contre C. elegans, la préservation de la physiologie animale, ce qui permet une exposition à la plupart des types de stimuli (en fonction de la conception du dispositif) et peut permettre l&#39;échange rapide et de récupération des animaux <sup&gt; 10, 11. Cependant microfluidique besoin d&#39;autres compétences techniques et des capacités dans la conception, la fabrication et la mise en œuvre. L&#39;activité animaux immobilisés et de relance de réponse peut généralement être mesurée en sensoriels et des interneurones. L&#39;activité des neurones moteurs nécessite des techniques plus sophistiquées d&#39;imagerie chez l&#39;animal en mouvement. Ici, nous allons présenter les méthodes détaillées utilisant les deux techniques les plus simples de la paralysie pharmacologique et immobilisation rigide agarose. Les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour mesurer l&#39;activité neuronale et la physiologie des cellules de C. elegans. Nous donnons un exemple de chaque: en utilisant GCaMP pour mesurer la réponse du neurone sensoriel ASJ à un champ électrique externe, et en utilisant cameleon pour mesurer la réponse physiologique au calcium endommagement laser d&#39;un neurone. Ces exemples montrent les avantages et les inconvénients des deux types de fluorophores et d&#39;illustrer ce qui est possible avec le système.

<table><tbody><tr><td>Microscope inversé Eclipse Ti-U </td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Source lumineuse fluorescente</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X Huile</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table optique ou 3'X3' < / > qualité Thor</td><td>Labs</td><td></td><td>Si une table optique n’est pas utilisée, une plaque d’essai de qualité optique sur une paillasse de laboratoire solide devrait suffire .</td></tr><tr><td>Clara Interline Camera</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>Caméra CCD haute sensibilité</td></tr><tr><td>wtGFP Longpass Emission</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>41015</td><td>Jeu de filtres GFP pour l’imagerie Filtre GCaMP</td></tr><tr><td>440 +/- 10 nm</td><td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>Filtre d’excitation pour cameleon</td></tr><tr><td>Miroir dichroïque > 455 nm Microscope passe-long</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>dichroïque pour l’imagerie caméléon </td></tr><tr><td>Miroir dichroïque > 515 nm longpass</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>Miroir dichroïque pour caméléon </td></tr><tr><td>imagerie Filtre 535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m Filtre</td><td>d’émission EM YFP</td></tr><tr><td>Filtre 480 +/- 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m Filtre</td><td>d’émission EM CFP</td></tr><tr><td>Lentille, 200 mm, Achromat</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>Lentille relais pour optique FRET (3)</td></tr><tr><td>Miroir large bande argenté</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>Optique FRET (2)</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> NGM<td></td></tr> Microsphères de polybilles <tr>de <td>lévamisole</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, volume de 2,5 % by , nanoparticules de polystyrène de 50 nm de diamètre</td><td>pour C. elegans immobilisation</td></tr><tr><td>Souche transgénique, Souche gpa-9 ::GCaMP3(en pha-1 ; him-5 bkg) </td><td>Sternberg Lab</td><td>Strain PS6388</td><td></td></tr><tr><td>Souche transgénique, mec- 4 ::YC3.60Gabel</td> <td>Lab</td><td>Strain CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

en imagerie calcique in vivo des neurones en c. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Le ver nématode C. elegans est un organisme modèle idéal pour relativement simple, l&#39;imagerie à faible coût neuronale in vivo. Son petit corps transparentes et simples, bien caractérisé le système nerveux permet l&#39;identification et l&#39;imagerie de fluorescence d&#39;un neurone à l&#39;intérieur de l&#39;animal intact. Techniques d&#39;immobilisation simples avec un impact minimal sur la physiologie de l&#39;animal permettent prolongée imagerie time-lapse. Le développement de fluorophores calcium génétiquement encodés sensibles tels que cameleon 1 et 2 GCaMP permettre l&#39;imagerie in vivo de calcium neuronal concernant la physiologie cellulaire et l&#39;activité neuronale. De nombreuses souches transgéniques exprimant ces fluorophores dans des neurones spécifiques sont facilement disponibles ou peuvent être construits en utilisant des techniques bien établies. Ici, nous décrivons des procédures détaillées pour la mesure dynamique du calcium dans un seul neurone in vivo en utilisant à la fois GCaMP et caméléon. Nous discutons des avantages et des disadvantles âges de deux, ainsi que diverses méthodes de préparation des échantillons (immobilisation des animaux) et l&#39;analyse d&#39;image. Enfin, nous présentons les résultats de deux expériences: 1) Utilisation GCaMP pour mesurer la réponse d&#39;un neurone sensoriel spécifique à un champ électrique externe et 2) Utilisation cameleon pour mesurer la réponse physiologique de calcium d&#39;un neurone à l&#39;endommagement laser traumatique. Techniques d&#39;imagerie calcique comme ceux-ci sont largement utilisés dans C. elegans et ont été étendues aux mesures chez les animaux se déplaçant librement, les neurones multiples simultanément et de comparaison entre fonds génétiques. C. elegans présente un système robuste et flexible pour l&#39;imagerie neuronale in vivo avec des avantages par rapport aux systèmes d&#39;autres modèles de simplicité et de coût.

Nous présentons ici les résultats de deux expériences distinctes. Le premier emploie GCaMP pour mesurer la réponse d&#39;un neurone sensoriel spécifique à un stimulus externe définie, ce qui donne un bon exemple de la façon dont les journalistes de calcium fluorescents peuvent être utilisés pour surveiller optiquement l&#39;activité neuronale dans intacts C. elegans. La seconde emploie cameleon pour mesurer le calcium intracellulaire transitoire déclenché dans le neurone en réponse aux dommages laser spécifique...

Avec son petit corps, transparent et documenté neuroanatomie et une foule de techniques génétiques qui se prêtent et réactifs,<em&gt; C. elegans</em&gt; Fait un organisme modèle idéal pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie neuronale utilisant relativement simples et peu coûteuses techniques. Nous décrivons ici l&#39;imagerie seul neurone dans les animaux adultes intacts génétiquement codés à l&#39;aide des indicateurs de calcium fluorescentes.

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser des fluoro-quatre génétiquement codés pour mesurer la dynamique calcique des neurones uniques dans le ver nématode. Voir l’élégance, ceci est réalisé en montant et en démobilisant d’abord des éléments d’élégance C intacts qui expriment un fluorophore sensible au calcium dans les neurones d’intérêt sur une lame de microscope standard. Ensuite, les neurones individuels sont imagés in vivo à l’aide de la microscopie vidéo et des techniques d’imagerie épifluorescente standard.Ensuite, la vidéo est analysée pour mesurer l’intensité de la fluorescence à des endroits spécifiques dans le neurone pour deux camps Fluor fours G couramment utilisés, qui donne un signal monocanal robuste de grande amplitude et un caméléon basé sur les frettes, qui génère un rapport à deux canaux. Les résultats de mesure métrique sont obtenus sur l’activité neuronale montrée en réponse à un stimuli sensoriel spécifique, ainsi que sur la physiologie cellulaire du calcium en réponse à des dommages cellulaires, qui sont tous deux basés sur la mesure optique des niveaux relatifs de calcium dans le neurone imagé. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes similaires dans les systèmes de vertébrés ou l’électrophysiologie conventionnelle est que CL elgan représente un système robuste, flexible et génétiquement traitable pour l’imagerie neuronale in vivo, techniquement simple et rentable.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans un large éventail de domaines de la biologie des neurones, en permettant de mesurer à la fois l’activité et le sinus avec des neurones individuels in vivo. Commencez par un microscope composé standard doté de capacités d’imagerie par épifluorescence pour une meilleure qualité d’image et de signal. Utilisez un objectif à fort grossissement, une ouverture numérique élevée et une caméra CCD refroidie à haute sensibilité afin de maximiser la résolution et la sensibilité de l’image tout en minimisant le bruit de fond pour les quatre flores monochromes.Utilisez le jeu de filtres de fluorescence de microscope standard conçu pour la longueur d’onde particulière du Fluor four pour le camp G. Utilisez un ensemble de filtres GFP standard optimisés pour l’excitation à 488 nanomètres et l’émission à 525 nanomètres, quatre flores métriques à quatre rapports tels que Chameleon, utilisez un système d’imagerie double de sorte que les images identiques peuvent être capturées simultanément à deux longueurs d’onde distinctes. Cela peut être accompli à l’aide d’un système disponible dans le commerce ou construit à la maison qui projette deux images côte à côte sur l’appareil photo de la manière suivante.Un ensemble de filtres de microscope avec un filtre d’excitation de plus ou moins 20 nanomètres de 440 ou moins 20 nanomètres et un miroir iic passe-long de 455 nanomètres, un masque d’image placé sur le plan d’image initial immédiatement à l’extérieur du port d’imagerie du microscope où le capteur CCD de la caméra se trouverait généralement le premier ensemble d’objectifs relais, à une distance focale du plan d’image initial, de sorte qu’il rassemble la lumière, Un miroir dichroïque qui divise la lumière en deux longueurs d’onde ou canaux d’imagerie distincts, reflétant une couleur tout en transmettant les autres filtres d’émission. Restreindre davantage la lumière transmise aux longueurs d’onde d’imagerie spécifiques. Le second relais fixe des lentilles, une pour chaque voie, placées dans les trajets du faisceau de manière à recentrer la lumière sur un second plan d’image au niveau de la caméra CCD.Une paire de miroirs et un deuxième miroir dichroïque dirigent les trajets du faisceau de sorte que les deux images se recombinent et sont projetées côte à côte sur la caméra. Capteur CCD. Voici un exemple de l’image résultante.Une fois configurées, les images peuvent être ajustées et affinées de la manière suivante, déplacez la position de la caméra de sorte que l’image transmise couvre la moitié du champ de vision de la caméra. Déplacez l’image réfléchie pour couvrir l’autre moitié du champ de vision en ajustant les deux derniers miroirs dans sa trajectoire de faisceau et optimisez la mise au point en déplaçant la deuxième lentille relais de chaque canal d’avant en arrière le long de la trajectoire du faisceau. Acquérir des animaux exprimant un fluorophore sensible au calcium dans le neurone d’intérêt à partir du centre génétique Citis ou d’autres sources.Vous pouvez également construire des animaux transgéniques en utilisant des techniques standard de chasse au phoque. Ensuite, utilisez l’une des techniques suivantes pour immobiliser l’élégance du joint pour la paralysie pharmacologique à 0,05 % à 2 % d’aros et fabriquer des coussinets d’aros pour l’imagerie en pressant une goutte d’aros fondu entre deux lames de verre qui ont deux morceaux de ruban de laboratoire comme espaceurs. Après avoir retiré la glissière supérieure, choisissez cinq à 10 animaux et transférez-les sur le coussin.Couvrez le tampon avec une lamelle et appliquez de petites quantités d’un mélange chaud de cire de paraffine et de vaseline sur les coins pour le maintenir en position. Attendez cinq à 10 minutes pour que le lemisol fasse effet et que les animaux deviennent complètement immobiles. Pour immobiliser les animaux à l’aide d’une méthode d’aros ferme, faites des coussinets à 10 % d’aros.Ajoutez environ trois microlitres d’une à 10 microsphères de polystyrène à la surface des coussinets et choisissez rapidement cinq à 10 clean sea elegance dans la piscine de solution de betterave. Couvrez délicatement avec une lamelle et appliquez de la cire fondue dans les coins. Les expériences typiques nécessitent l’administration d’un stimuli ou d’une condition spécifique à l’animal tout en enregistrant sur vidéo la réponse d’un seul neurone.Pour l’acquisition de vidéos. Nous imaginons souvent à environ une image par seconde avec des temps d’exposition d’environ 300 millisecondes. La vidéo doit être analysée pour mesurer l’intensité de fluorescence de chaque image dans la région d’intérêt ou le retour d’intérêt du neurone imagé par rapport à une région d’arrière-plan proche.Notre programme d’analyse affiche une image compressée de toutes les images du film, à partir de laquelle une limite approximative englobant l’objet d’intérêt dans toutes les images est sélectionnée manuellement et une région d’arrière-plan indépendante est sélectionnée. Pour le premier, un retour sur investissement est sélectionné manuellement à partir de la région limite. Pour chaque image suivante, le programme sélectionne les pixels les plus brillants à l’intérieur de la région limite pour générer une valeur d’intérêt de la taille correcte pour les images métriques de rapport générées avec caméléon, sélectionne une zone d’intérêt approximative et une région d’arrière-plan similaires pour chacune des images ou canaux doubles, puis la valeur d’intérêt d’une image sur la première image, le signal fluorescent F pour chaque image est calculé comme l’intensité moyenne des pixels dans le retour d’intérêt moins l’intensité moyenne dans la région d’arrière-plan.Le niveau relatif de calcium pour chaque image est calculé comme le pourcentage de variation de l’intensité normalisé par rapport à une valeur de référence initiale mesurée à partir de la première image ou série d’images. Les valeurs des métriques de ratio sont calculées comme le rapport des deux canaux. Un retour d’investissement sélectionné dans le corps cellulaire génère les signaux les plus forts et les plus robustes, mais il est également possible de sélectionner et de mesurer des signaux d’un retour sur investissement le long des processus nerveux.L’exposition à la lumière d’excitation peut provoquer le blanchissement de la flore quatre et est marquée par une diminution constante du signal qui dépend des niveaux d’exposition en cas de blanchiment. Réduisez les temps d’exposition et/ou l’intensité de l’excitation avec des filtres à densité neutre pour minimiser le bruit créé par le mouvement de l’élégance de la mer pendant l’enregistrement. En réponse à l’exposition à la lumière et aux stimuli expérimentaux, exécutez soigneusement les procédures d’immobilisation à l’aide de préparations propres.Pour une analyse d’image réussie, choisissez des régions d’arrière-plan raisonnablement uniformes, plus sombres que l’image pour les neurones et suffisamment éloignées pour éviter la lumière diffusée. On voit ici un seul C élégance, un neurone SJ exprimant G camp répondant à un champ électrique externe de trois volts par centimètre pendant trois essais distincts d’une durée de 10 secondes chacun. L’animal a été immobilisé à l’aide de lemisol, mais la vidéo montre de légers défauts de mouvement et de concentration.L’intensité de la fluorescence de dérive a été mesurée au niveau du corps cellulaire. Le signal est robuste malgré les défauts vidéo montrant une augmentation importante d’environ 250 % de la fluorescence en réponse au premier et au troisième stimuli. Le résultat du deuxième stimulus est considérablement réduit.La démonstration de la variabilité de la réponse neuronale est minime, comme en témoigne le retour à un niveau de référence constant. Les lésions cellulaires traumatiques déclenchent un important transitoire de calcium dans un neurone qui joue un rôle essentiel dans la réponse physiologique de la cellule. Cette vidéo montre la réponse induite par les dommages à l’ex-sodomie laser d’un seul neurone.Des optiques à double imagerie ont été utilisées pour enregistrer les signaux des canaux de fluorescence CFP et YFP du rapporteur caméléon. Cette figure montre le signal de frette résultant, mesuré au niveau du corps cellulaire au cours de l’expérience de chirurgie au laser. En réponse à des dommages causés par le laser et à une augmentation du calcium cytoplasmique à T équivaut à zéro seconde.Le CFP diminue rapidement et le YFP augmente, ce qui entraîne une augmentation immédiate d’environ 200 % du signal métrique de rapport, qui est maintenu pendant environ 90 secondes avant de retomber à des niveaux proches de la ligne de base. Le blanchiment est minime, comme en témoigne la ligne de base constante. Cette figure montre le signal de frette résultant tel que mesuré dans le segment axonal près du point de coupure ici.La quantité locale de fluoro quatre varie au cours de l’expérience. Pour compliquer le signal, la chirurgie au laser coupe l’axone et rompt brièvement la membrane, permettant à la flore quatre de s’échapper et réduisant temporairement sa concentration cytoplasmique locale. Cela est évident à partir d’une diminution initiale de la trace YFP à des moments ultérieurs.L’extrémité sectionnée gonfle dans le cadre de sa récupération continue, ce qui entraîne un fluoro quatre plus localisé et une augmentation de l’intensité. Cela est le plus évident dans la trace CFP qui augmente lentement, cependant, ces variations affectent les deux canaux de manière égale et le rapport de frette compense efficacement en donnant un signal robuste. La mesure résultante montre une réponse similaire à celle du corps cellulaire avec une augmentation immédiate d’environ 150 % du signal, une récupération spectaculaire près de la ligne de base à environ 90 secondes, puis une réponse secondaire supplémentaire plus petite à environ 150 secondes.Des accessoires de microscope commerciaux pour l’imagerie métrique par rapport sont disponibles, ainsi que des logiciels d’analyse d’image plus sophistiqués qui génèrent des mesures métriques de rapport pixel par pixel Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées avec une relative facilité et sans les techniques compliquées de préparation d’échantillons, de dissection tissulaire ou d’imagerie requises par d’autres systèmes ou méthodes de modèle. Des expériences entières peuvent être exécutées en l’espace d’une heure ou deux si elles sont effectuées correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’immobiliser l’élégance pour l’imagerie, d’effectuer une copie maximale de la vidéo sur des neurones individuels in vivo et d’analyser la vidéo résultante pour mesurer les niveaux de calcium relatifs en fonction du neurone.

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