En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser des fluoro-quatre génétiquement codés pour mesurer la dynamique calcique des neurones uniques dans le ver nématode. Voir l’élégance, ceci est réalisé en montant et en démobilisant d’abord des éléments d’élégance C intacts qui expriment un fluorophore sensible au calcium dans les neurones d’intérêt sur une lame de microscope standard. Ensuite, les neurones individuels sont imagés in vivo à l’aide de la microscopie vidéo et des techniques d’imagerie épifluorescente standard.

Ensuite, la vidéo est analysée pour mesurer l’intensité de la fluorescence à des endroits spécifiques dans le neurone pour deux camps Fluor fours G couramment utilisés, qui donne un signal monocanal robuste de grande amplitude et un caméléon basé sur les frettes, qui génère un rapport à deux canaux. Les résultats de mesure métrique sont obtenus sur l’activité neuronale montrée en réponse à un stimuli sensoriel spécifique, ainsi que sur la physiologie cellulaire du calcium en réponse à des dommages cellulaires, qui sont tous deux basés sur la mesure optique des niveaux relatifs de calcium dans le neurone imagé. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes similaires dans les systèmes de vertébrés ou l’électrophysiologie conventionnelle est que CL elgan représente un système robuste, flexible et génétiquement traitable pour l’imagerie neuronale in vivo, techniquement simple et rentable.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans un large éventail de domaines de la biologie des neurones, en permettant de mesurer à la fois l’activité et le sinus avec des neurones individuels in vivo. Commencez par un microscope composé standard doté de capacités d’imagerie par épifluorescence pour une meilleure qualité d’image et de signal. Utilisez un objectif à fort grossissement, une ouverture numérique élevée et une caméra CCD refroidie à haute sensibilité afin de maximiser la résolution et la sensibilité de l’image tout en minimisant le bruit de fond pour les quatre flores monochromes.

Utilisez le jeu de filtres de fluorescence de microscope standard conçu pour la longueur d’onde particulière du Fluor four pour le camp G. Utilisez un ensemble de filtres GFP standard optimisés pour l’excitation à 488 nanomètres et l’émission à 525 nanomètres, quatre flores métriques à quatre rapports tels que Chameleon, utilisez un système d’imagerie double de sorte que les images identiques peuvent être capturées simultanément à deux longueurs d’onde distinctes. Cela peut être accompli à l’aide d’un système disponible dans le commerce ou construit à la maison qui projette deux images côte à côte sur l’appareil photo de la manière suivante.

Un ensemble de filtres de microscope avec un filtre d’excitation de plus ou moins 20 nanomètres de 440 ou moins 20 nanomètres et un miroir iic passe-long de 455 nanomètres, un masque d’image placé sur le plan d’image initial immédiatement à l’extérieur du port d’imagerie du microscope où le capteur CCD de la caméra se trouverait généralement le premier ensemble d’objectifs relais, à une distance focale du plan d’image initial, de sorte qu’il rassemble la lumière, Un miroir dichroïque qui divise la lumière en deux longueurs d’onde ou canaux d’imagerie distincts, reflétant une couleur tout en transmettant les autres filtres d’émission. Restreindre davantage la lumière transmise aux longueurs d’onde d’imagerie spécifiques. Le second relais fixe des lentilles, une pour chaque voie, placées dans les trajets du faisceau de manière à recentrer la lumière sur un second plan d’image au niveau de la caméra CCD.

Une paire de miroirs et un deuxième miroir dichroïque dirigent les trajets du faisceau de sorte que les deux images se recombinent et sont projetées côte à côte sur la caméra. Capteur CCD. Voici un exemple de l’image résultante.

Une fois configurées, les images peuvent être ajustées et affinées de la manière suivante, déplacez la position de la caméra de sorte que l’image transmise couvre la moitié du champ de vision de la caméra. Déplacez l’image réfléchie pour couvrir l’autre moitié du champ de vision en ajustant les deux derniers miroirs dans sa trajectoire de faisceau et optimisez la mise au point en déplaçant la deuxième lentille relais de chaque canal d’avant en arrière le long de la trajectoire du faisceau. Acquérir des animaux exprimant un fluorophore sensible au calcium dans le neurone d’intérêt à partir du centre génétique Citis ou d’autres sources.

Vous pouvez également construire des animaux transgéniques en utilisant des techniques standard de chasse au phoque. Ensuite, utilisez l’une des techniques suivantes pour immobiliser l’élégance du joint pour la paralysie pharmacologique à 0,05 % à 2 % d’aros et fabriquer des coussinets d’aros pour l’imagerie en pressant une goutte d’aros fondu entre deux lames de verre qui ont deux morceaux de ruban de laboratoire comme espaceurs. Après avoir retiré la glissière supérieure, choisissez cinq à 10 animaux et transférez-les sur le coussin.

Couvrez le tampon avec une lamelle et appliquez de petites quantités d’un mélange chaud de cire de paraffine et de vaseline sur les coins pour le maintenir en position. Attendez cinq à 10 minutes pour que le lemisol fasse effet et que les animaux deviennent complètement immobiles. Pour immobiliser les animaux à l’aide d’une méthode d’aros ferme, faites des coussinets à 10 % d’aros.

Ajoutez environ trois microlitres d’une à 10 microsphères de polystyrène à la surface des coussinets et choisissez rapidement cinq à 10 clean sea elegance dans la piscine de solution de betterave. Couvrez délicatement avec une lamelle et appliquez de la cire fondue dans les coins. Les expériences typiques nécessitent l’administration d’un stimuli ou d’une condition spécifique à l’animal tout en enregistrant sur vidéo la réponse d’un seul neurone.

Pour l’acquisition de vidéos. Nous imaginons souvent à environ une image par seconde avec des temps d’exposition d’environ 300 millisecondes. La vidéo doit être analysée pour mesurer l’intensité de fluorescence de chaque image dans la région d’intérêt ou le retour d’intérêt du neurone imagé par rapport à une région d’arrière-plan proche.

Notre programme d’analyse affiche une image compressée de toutes les images du film, à partir de laquelle une limite approximative englobant l’objet d’intérêt dans toutes les images est sélectionnée manuellement et une région d’arrière-plan indépendante est sélectionnée. Pour le premier, un retour sur investissement est sélectionné manuellement à partir de la région limite. Pour chaque image suivante, le programme sélectionne les pixels les plus brillants à l’intérieur de la région limite pour générer une valeur d’intérêt de la taille correcte pour les images métriques de rapport générées avec caméléon, sélectionne une zone d’intérêt approximative et une région d’arrière-plan similaires pour chacune des images ou canaux doubles, puis la valeur d’intérêt d’une image sur la première image, le signal fluorescent F pour chaque image est calculé comme l’intensité moyenne des pixels dans le retour d’intérêt moins l’intensité moyenne dans la région d’arrière-plan.

Le niveau relatif de calcium pour chaque image est calculé comme le pourcentage de variation de l’intensité normalisé par rapport à une valeur de référence initiale mesurée à partir de la première image ou série d’images. Les valeurs des métriques de ratio sont calculées comme le rapport des deux canaux. Un retour d’investissement sélectionné dans le corps cellulaire génère les signaux les plus forts et les plus robustes, mais il est également possible de sélectionner et de mesurer des signaux d’un retour sur investissement le long des processus nerveux.

L’exposition à la lumière d’excitation peut provoquer le blanchissement de la flore quatre et est marquée par une diminution constante du signal qui dépend des niveaux d’exposition en cas de blanchiment. Réduisez les temps d’exposition et/ou l’intensité de l’excitation avec des filtres à densité neutre pour minimiser le bruit créé par le mouvement de l’élégance de la mer pendant l’enregistrement. En réponse à l’exposition à la lumière et aux stimuli expérimentaux, exécutez soigneusement les procédures d’immobilisation à l’aide de préparations propres.

Pour une analyse d’image réussie, choisissez des régions d’arrière-plan raisonnablement uniformes, plus sombres que l’image pour les neurones et suffisamment éloignées pour éviter la lumière diffusée. On voit ici un seul C élégance, un neurone SJ exprimant G camp répondant à un champ électrique externe de trois volts par centimètre pendant trois essais distincts d’une durée de 10 secondes chacun. L’animal a été immobilisé à l’aide de lemisol, mais la vidéo montre de légers défauts de mouvement et de concentration.

L’intensité de la fluorescence de dérive a été mesurée au niveau du corps cellulaire. Le signal est robuste malgré les défauts vidéo montrant une augmentation importante d’environ 250 % de la fluorescence en réponse au premier et au troisième stimuli. Le résultat du deuxième stimulus est considérablement réduit.

La démonstration de la variabilité de la réponse neuronale est minime, comme en témoigne le retour à un niveau de référence constant. Les lésions cellulaires traumatiques déclenchent un important transitoire de calcium dans un neurone qui joue un rôle essentiel dans la réponse physiologique de la cellule. Cette vidéo montre la réponse induite par les dommages à l’ex-sodomie laser d’un seul neurone.

Des optiques à double imagerie ont été utilisées pour enregistrer les signaux des canaux de fluorescence CFP et YFP du rapporteur caméléon. Cette figure montre le signal de frette résultant, mesuré au niveau du corps cellulaire au cours de l’expérience de chirurgie au laser. En réponse à des dommages causés par le laser et à une augmentation du calcium cytoplasmique à T équivaut à zéro seconde.

Le CFP diminue rapidement et le YFP augmente, ce qui entraîne une augmentation immédiate d’environ 200 % du signal métrique de rapport, qui est maintenu pendant environ 90 secondes avant de retomber à des niveaux proches de la ligne de base. Le blanchiment est minime, comme en témoigne la ligne de base constante. Cette figure montre le signal de frette résultant tel que mesuré dans le segment axonal près du point de coupure ici.

La quantité locale de fluoro quatre varie au cours de l’expérience. Pour compliquer le signal, la chirurgie au laser coupe l’axone et rompt brièvement la membrane, permettant à la flore quatre de s’échapper et réduisant temporairement sa concentration cytoplasmique locale. Cela est évident à partir d’une diminution initiale de la trace YFP à des moments ultérieurs.

L’extrémité sectionnée gonfle dans le cadre de sa récupération continue, ce qui entraîne un fluoro quatre plus localisé et une augmentation de l’intensité. Cela est le plus évident dans la trace CFP qui augmente lentement, cependant, ces variations affectent les deux canaux de manière égale et le rapport de frette compense efficacement en donnant un signal robuste. La mesure résultante montre une réponse similaire à celle du corps cellulaire avec une augmentation immédiate d’environ 150 % du signal, une récupération spectaculaire près de la ligne de base à environ 90 secondes, puis une réponse secondaire supplémentaire plus petite à environ 150 secondes.

Des accessoires de microscope commerciaux pour l’imagerie métrique par rapport sont disponibles, ainsi que des logiciels d’analyse d’image plus sophistiqués qui génèrent des mesures métriques de rapport pixel par pixel Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées avec une relative facilité et sans les techniques compliquées de préparation d’échantillons, de dissection tissulaire ou d’imagerie requises par d’autres systèmes ou méthodes de modèle. Des expériences entières peuvent être exécutées en l’espace d’une heure ou deux si elles sont effectuées correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’immobiliser l’élégance pour l’imagerie, d’effectuer une copie maximale de la vidéo sur des neurones individuels in vivo et d’analyser la vidéo résultante pour mesurer les niveaux de calcium relatifs en fonction du neurone.