Name: Établir entomopathogènes fongiques comme endophytes: Vers un contrôle biologique endophytique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Découvrez deux méthodes d'inoculation pour établir Beauveria bassiana comme endophyte chez Phaseolus vulgaris. Cette technique avance le contrôle biologique durable contre les ravageurs agricoles.

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La production et le travail expérimental présenté ici reflète l&#39;aide dévouée et enthousiaste de Reynaldo Pareja. Financé par le Département administratif de la Colombie de la Science, de la Technologie et de l&#39;Innovation (Colciencias) et par une subvention de la Fondation Bill &amp; Melinda Gates à travers l&#39;initiative du Grand Challenges Explorations.

1. Plantes <ol><li> Surface de stériliser les graines de soja (cv. Calima) en les plongeant pendant deux minutes dans de l&#39;hypochlorite de sodium à 0,5% et à deux minutes dans de l&#39;éthanol à 70%. Rincer trois fois les graines dans de l&#39;eau distillée stérile. </li><li> Évaluer le succès de votre stérilisation en étalant 100 ul de la dernière eau de rinçage sur les pommes de terre gélose dextroxe (PDA) des médias, et l&#39;incubation de la plaque pendant 10 jours à 25 ° C. Terminer et redémarrez l&#39;expérience si aucune croissance est visible sur la plaque. </li><li> Plantez les graines dans des groupes de trois dans des pots contenant un mélange stérile de terre et de sable à un ratio de 2:1. Transférer les pots à une chambre de croissance à 25 ° C, env. 50% HR et photopériode de 12 heures. Une semaine après la germination, éliminer les au moins deux jeunes plants vigoureux. Eau tous les 2-3 jours avec de l&#39;eau distillée stérile et fertiliser 10 et 20 jours après la plantation avec une solution d&#39;eau 6 g / L d&#39;engrais NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Fongus <ol><li> Procurez-vous un comformulation financière de souche GHA de Beauveria bassiana (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombie). </li><li> Pour générer une culture unique stock de spores, de suspendre ca. une inoculation de conidies boucle complète dans 1 ml d&#39;une solution aqueuse à 0,1% de Triton X-100 et vortex pendant 10 sec. Ensuite, la plaque 100 ul de la suspension sur de la gélose Noble 2,5% et incuber pendant 24 heures à 25 ° C. Transférer une seule conidie germant dans un PDA 100 mm et plaque contenant croître jusqu&#39;à ce qu&#39;elle couvre la totalité de la plaque (environ 3-4 semaines). </li><li> Dans des conditions stériles, gratter la croissance fongique à partir de la surface du support et le suspendre dans 10 ml stérile 0,1% de Triton X-100. Vortex pendant une minute. Ensuite, filtrer la suspension à travers une étamine stérile pour éliminer les hyphes et obtenir la suspension stock. </li><li> Utilisez un hémocytomètre pour estimer la concentration de la suspension de conidies stock. Pour faciliter comptes de conidies, préparer une dilution de série 10000 fois du stock, à chaque fois que le transfert de 100 pi of suspension de conidies dans 900 ul de 0,1% de Triton X-100, et vortex pendant 10 secondes avant la dilution suivante. </li><li> Pour générer l&#39;inoculum, ajuster la suspension-mère à une concentration finale de 10 8 conidies / ml, en utilisant la formule: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="équation 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Pour évaluer la viabilité des conidies, la plaque 100 ul de la dilution de 10.000 fois sur gélose Noble 2,5% et incuber pendant 24 heures à 25 ° C. Ensuite, inspecter trois groupes aléatoires de 100 conidies pour estimer la germination pour cent. Examiner une conidie germé quand un tube germinatif visible de plus de la moitié du diamètre des projets de ce conidie. N&#39;utilisez que la suspension lorsque la germination pour cent en moyenne dépasse les 90%. </li></ol> 3. Inoculation <ol><li> Inoculer les plantes quand elles atteignent leur stade première feuille vraie (environ 14 jours après la plantation). Les plantes aquatiques à la capacité du sol à distiller stérilel&#39;eau ed 24 heures avant inoculation. </li><li> Pour la méthode de pulvérisation foliaire, utiliser un pulvérisateur manuel d&#39;appliquer la suspension de conidies (traitement), soit 0,1% de Triton X-100 (contrôle) à l&#39;adaxial (supérieure) de surface de feuilles jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la saturation. Couvrez le dessus du pot avec du papier aluminium pour éviter le ruissellement des conidies au sol. Après la pulvérisation, couvrir les plantes avec un sac en plastique pendant 24 heures afin de maintenir un niveau élevé d&#39;humidité faciliter l&#39;invasion fongique. </li><li> Pour la méthode de trempage du sol, utiliser un cylindre gradué d&#39;appliquer 10 ml de suspension de conidies (traitement), soit 0,1% de Triton X-100 (contrôle) à la surface du sol à la base de la plante. </li><li> Après inoculation, le retour des plantes dans les chambres de croissance en les disposant en blocs aléatoires complets. Pas moins de quatre blocs expérimentaux supplémentaires devraient être installés pour permettre des évaluations de la croissance des plantes, en plus des évaluations de la colonisation endophyte, dans la même expérience. </li></ol> 4. Evaluations <ol><li> Évaluer l&#39;expérience d&#39;un bloc à la fois, en sélectionnant les blocs dans un ordre aléatoire. Ceci est particulièrement important pour les grandes expériences qui ne peuvent pas être évalués sur une seule journée. </li><li> Avant de traiter une plante, mesurer et enregistrer la hauteur de la base vers le méristème apical. Puis, déraciner soigneusement et lavez soigneusement à l&#39;eau courante. </li><li> De chaque plante, l&#39;échantillon deux feuillets, deux morceaux de racine et deux morceaux de tige. Sélectionner des échantillons au hasard dans la brochure première vraie feuille de la plante. Ensuite, obtenir deux échantillons de tiges, 3 cm de long chacune, à partir du milieu de la plante et de près de la surface du sol. Enfin, obtenir deux échantillons pivotante, aussi 3 cm de long chacune, à partir du milieu du pied et de 1 cm de l&#39;extrémité de la racine. Placer les échantillons sur trois sacs en papier et d&#39;étiquettes séparées de manière appropriée. </li><li> Après lavage et d&#39;échantillonnage toutes les plantes dans un bloc, commencer par traiter les feuilles, puis les racines, et enfin les tiges. </li><li> Surface stériliser tquestions dans une hotte à flux laminaire stérile comme en 1.1, ci-dessus. Rincer chaque échantillon trois fois par immersion dans de l&#39;eau distillée stérile et laissez-le sécher dans une serviette en papier stérile. Puis, disséquer et jeter ses bords extérieurs, où les endophytes aurait pu être éliminé en raison du contact avec des désinfectants. </li><li> Couper l&#39;échantillon coupé en six sections, avec une moyenne 6x6 mm pour les feuilles et 6 mm de long pour les tiges et les racines. Plaque des six sections sur une plaque de 60 mm de Pétri avec les médias PDA complétées par la tétracycline antibiotiques, la streptomycine et la pénicilline à 2 mg / L chacun. Sceller la plaque avec du parafilm et incuber à l&#39;obscurité à 25 ° C. Chaque plante donne six assiettes, deux pièces par plante. </li><li> Changez l&#39;eau de rinçage après le traitement de chaque bloc d&#39;une partie de la plante donnée. Avant de jeter l&#39;eau de rinçage utilisée, une plaque échantillon de 100 ul sur un support PDA et les incuber pendant 10 jours à 25 ° C pour évaluer le succès de stérilisation. Si la croissance des champignons en découle, ne considérez pas les échantillons correspondants pour les analyses. </li><li> Inspectez les plaques tous les 2-3 jours pendant 20 jours pour observer et enregistrer une croissance fongique. Parties de l&#39;installation d&#39;accise et de transfert présentant présence de champignons endophytes des plaques contenant PDA fraîche. Ceci permettra d&#39;éviter la contamination des parties de l&#39;installation voisins dans la plaque d&#39;origine. </li><li> Enregistrer B. croissance bassiana de parties de l&#39;installation. Beauveria bassiana peuvent être identifiés par caractéristique mycélium blanc dense devient crème à jaune pâle au bord. En cas de doute, monter le spécimen dans une goutte d&#39;eau et inspecter sous un microscope, à la recherche d&#39;globuleux conidies et des conidiophores en forme de zigzag, caractéristique de l&#39;espèce. </li><li> Utilisez d&#39;autres blocs expérimentaux pour évaluer l&#39;impact des traitements sur la biomasse végétale. Tout d&#39;abord, mesurer leur hauteur à partir de la base vers le sommet du méristème apical. Ensuite, bien se laver et déraciner les plantes dans l&#39;eau du robinet et laissez-les sécher à 45 ° C pendant trois jours afin de déterminer leur poids sec. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

De nombreux facteurs peuvent influencer le résultat d&#39;une expérience spécifique d&#39;établir un entomopathogène fongique comme endophyte. Nos résultats démontrent la méthode d&#39;inoculation est l&#39;un d&#39;entre eux. Les facteurs biologiques à expérimenter avec notamment la récolte des espèces ou cultivars sélectionnés et la souche de champignon entomopathogène espèces ou d&#39;isoler utilisé. Autres facteurs à considérer comprennent la manipulation de la concentration de l&#39;inoculum, l&#39;âge de la plante lors de vaccinations, et les conditions de croissance de la plante. Il serait idéal pour une méthode d&#39;inoculation d&#39;aboutir à la colonisation des plantes systémique par un champignon entomopathogène 14,17,18,21. Au lieu de cela, il apparaît que les méthodes d&#39;inoculation ont tendance à privilégier un modèle spécifique de la colonisation locale. Dans le café, par exemple, des pulvérisations foliaires favoriser la colonisation feuilles alors que bassinage du sol favorisent la colonisation des racines 17. Nous avons constaté la même tendance dans le haricot commun. En fin de compte, le choix de la méthode d&#39;inoculation doit êtreguidé par l&#39;emplacement prévu pour l&#39;endophyte dans une usine, probablement correspondant à la niche de la cible ou herbivore phytopathogène. Bien que couramment utilisé, la détection et la quantification endophyte basé sur les cultures des médias peut être coûteux, difficile et source d&#39;erreurs. Par exemple, un total de 10.800 parties de l&#39;installation (étalées sur des boîtes de Pétri 1800) ont été évalués dans une expérience pour optimiser B. inoculations bassiana sur la banane 16. Parmi ceux-ci, 4.496 articles ont été colonisés par une putative B. bassiana, identifiés principalement par la morphologie des colonies. De toute évidence, une vérification microscopique des espèces pour chaque colonie aurait été souhaitable, mais pas inabordable. D&#39;autre part, 1.176 articles ont été colonisées par des champignons et d&#39;autres ont été rejetées et considérées comme des données manquantes 16. La probabilité existe, cependant, que B. bassiana est un mauvais compétiteur ou plus lent à se développer, et aurait finalement émergé de ces articles, si unllowed suffisamment de temps. Par conséquent, les méthodes de détection endophytes basés sur les cultures des médias sont soumis à des faux positifs et des faux négatifs. En conséquence, le développement de la détection et de quantification plus fiable des méthodes, par exemple ceux basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) 20,21,24, est bien justifiée. Le but ultime des expériences d&#39;inoculation doit être de développer un traitement efficace qui offre une résistance durable contre les herbivores systémique et / ou de la maladie. Une plausible, mais encore non testés, l&#39;hypothèse est que l&#39;ampleur de la colonisation endophyte doit être en corrélation positive avec le degré de résistance médiée par endophyte. Une prochaine étape naturelle après l&#39;affinement des méthodes d&#39;inoculation, par conséquent, pourrait être d&#39;examiner cette corrélation. Plusieurs protocoles vidéo peut aider les chercheurs à concevoir un test de résistance appropriée pour un organisme cible pathogène ou 29-31. En fin de compte, c&#39;est ce test qui va déterminer le succès de l&#39;inoculumtion méthode, et le potentiel associé pour la lutte biologique endophyte.

Entomopathogènes fongiques sont des régulateurs importants de populations d&#39;insectes avec un potentiel considérable en tant mycopesticides 1. Ce n&#39;est que récemment, cependant, ont entomopathogènes fongiques été observé que les endophytes, à la fois naturellement et en réponse à diverses méthodes d&#39;inoculation 2. La fonction écologique des endophytes fongiques entomopathogènes reste en grande partie inconnue, mais certaines études ont mis en cause dans les 3,4 la croissance des plantes, 5-8 résistance herbivore, et 9,10 résistance aux maladies. L&#39;objectif global des méthodes présentées ici est d&#39;introduire un entomopathogène fongique comme endophyte, en préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) est le mieux étudié entomopathogène fongique 5-9,11-19 endophyte, et il est disponible en tant que mycopesticide commerciale. Méthodes d&#39;inoculation testés pour établir <em&gt; B. bassiana comme endophyte comprennent bassinage du sol, 14,17 enrobages de semences 18 et 14, immersions pansements radicule 13,15 racines, des rhizomes et des immersions 11,16,18, tige injections 17, 14,17,20 pulvérisations foliaires et gerbes de fleurs 19. Grâce à ces méthodes, les chercheurs ont introduit B. bassiana dans la banane 11, haricot 7, cacao 13, café 17, le maïs 7, le coton 7, le palmier dattier 12, jute 21, 20 du pavot à opium, la citrouille 7, pin radiata 18, le sorgho 14, 7 et tomate blé 7. Des données récentes suggèrent que endophyte B. bassiana a le potentiel pour protéger les plantes non seulement des arthropodes nuisibles 5-7,22-27, mais aussi de quelque 9 agents pathogènes des plantes. Le haricot commun (Phaseolus vulgaris) se classe parmi les cultures les plus vulnérables aux ravageurset les maladies. Il peut être affecté par plus de 400 organismes nuisibles et de 200 agents pathogènes, dont l&#39;attaque est considérée comme le facteur le plus limitant la production de haricots dans les régions 28. En conséquence, le haricot commun peut être une culture excellent modèle pour étudier le spectre de la lutte biologique endophyte par B. bassiana. Dans une première étape dans cette direction, cet article décrit les pulvérisations foliaires et du sol potions que les méthodes d&#39;inoculation d&#39;introduire B.bassiana l&#39;état endophyte dans le haricot commun.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Nom du réactif/du matériau Numéro de catalogue</td><td></td><td></td>de <td></td> l’entreprise</tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Gélose noble</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G sel de sodium</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Gélose au dextrose de pomme de terre</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel ordinaire (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sulfate de streptomycine</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triple coing (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Armoire de sécurité biologique</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Leica DM LB</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

Établir entomopathogènes fongiques comme endophytes: vers un contrôle biologique endophytique

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Beauveria bassiana est un champignon entomopathogène avec la capacité de coloniser les plantes endophyte. Comme un endophyte, B. bassiana peuvent jouer un rôle dans la protection des plantes contre les herbivores et les maladies. Ce protocole illustre deux méthodes d&#39;inoculation pour établir B. bassiana endophyte dans le haricot commun (Phaseolus vulgaris), en préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte. Les plantes sont cultivées à partir de graines stérilisées en surface pendant deux semaines avant de recevoir un B. traitement bassiana de 10 8 conidies / ml (ou l&#39;eau) soit appliqué en pulvérisation foliaire ou par bassinage du sol. Deux semaines plus tard, les plantes sont récoltées et de leurs feuilles, les tiges et les racines sont échantillonnés pour évaluer endophyte colonisation fongique. Pour cela, les échantillons sont individuellement stérilisés en surface, coupé en plusieurs sections, et incubées dans un milieu Potato Dextrose Agar pour 20 jours. Les médias sont inspectés tous les 2-3 jours pour observer la croissance fongiquesociated avec des parties d&#39;installation et d&#39;enregistrer la présence de B. bassiana d&#39;estimer l&#39;ampleur de la colonisation endophyte. L&#39;analyse des succès inoculation comparer la présence de B. bassiana dans une partie de la plante donnée (c.-à-feuilles, tiges ou racines) dans tous les traitements et les contrôles. En plus de la méthode d&#39;inoculation, le résultat spécifique de l&#39;expérience peut dépendre de l&#39;espèce cultivée cibles ou de variétés, les espèces de champignons entomopathogènes souche ou isolat utilisé, et les conditions de croissance de la plante.

B. bassiana a réussi à coloniser endophyte-p vulgaris en réponse aux traitements d&#39;inoculation ont démontré (figure 1). Les deux pulvérisations foliaires et du sol par arrosage abouti à la colonisation endophyte par B. bassiana dans plus de 80% des plantes traitées (figure 2). Cependant, l&#39;ampleur de la colonisation dépend de la partie de la plante évaluée et la méthode d&#39;inoculation utilisée. Les feuilles ont le mieux répondu aux inoculations de pulvérisation. Racines, d&#39;autre part, a répondu uniquement à des inoculations bassinage. Enfin, les tiges réagi de la même pour les deux méthodes d&#39;inoculation. B. bassiana a été détecté dans aucun des parties de l&#39;installation de contrôle. Indépendamment des traitements, autres que les endophytes B. bassiana est passé de 15% des sections de l&#39;usine évalués, mais ils ont été disséqués à partir de plaques médias avant qu&#39;ils ne puissent envahir sections voisines et influencer les résultats. Les usines de traitement et de contrôle étaient visiblement impossibles à distinguer deux semaines après inoculation. Aucune différence n&#39;a été détectée dans leur poids sec et dans leur hauteur. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Les résultats représentatifs de traitements d&#39;inoculation sur la colonisation endophyte des plants de haricot (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Par Beauveria bassiana En haut à gauche:. Contrôle des plaques sans croissance. En haut à droite: endophyte fongique à partir d&#39;une section de l&#39;usine contaminer toute la plaque. En bas à gauche: B. bassiana de plus en plus de deux parties de l&#39;installation. En bas à droite: B. endophytique bassiana conidies et les conidiophores comme on le voit sous un microscope. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figure 2. Effet des traitements d&#39;inoculation sur la colonisation endophyte de bean plantes (Phaseolus vulgaris cv. Calima) par Beauveria bassiana, deux semaines après inoculation avec la souche GHA. colonisation pourcentage correspond au nombre de sections de plantes colonisées divisé par le nombre de sections de culture.

Ce protocole illustre deux méthodes d&#39;inoculation d&#39;introduire le champignon entomopathogène<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; L&#39;état endophyte dans le haricot commun (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), En préparation pour les évaluations ultérieures de lutte biologique endophyte.

Établir entomopathogènes fongiques comme endophytes: Vers un contrôle biologique endophytique

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

Bonjour. Je m'appelle Ush Parsa et je suis entomologiste à SEA, au Centre international pour l'agriculture tropicale. Je suis ViiV Artiz, également du Centre international pour l'agriculture tropicale, et voici Fernando Vega, du Département de l'agriculture des États-Unis. L'objectif général de cette vidéo est de montrer comment faciliter et vérifier l'établissement d'un champignon comme agent pathogène.En tant qu'endophyte, il est courant dans la nature d'observer un insecte ou un acarien infecté par un champignon pathogène, et l'on connaît depuis longtemps l'utilisation de ces champignons entomopathogènes comme pesticides biologiques. Plus récemment, des champignons entomopathogènes ont parfois été découverts en train d'infester des plantes, sans provoquer de symptômes apparents de leur présence. Cette découverte indique leur potentiel en tant qu'endophytes protecteurs contre les ravageurs agricoles.Pour explorer ce potentiel, il est d'abord essentiel de développer une méthode d'inoculation permettant d'établir de façon fiable un agent pathogène fongique comme endophyte dans une culture cible. B. bassiana est l'un des agents pathogènes fongiques les plus étudiés, et il est facilement disponible à l'état commercial sous forme de pesticide. Ce champignon a été détecté comme endophyte chez de nombreuses espèces végétales, notamment les bananiers, le caféier et le muscadier.Des preuves récentes suggèrent que le B bassiana possède la capacité de protéger les plantes non seulement contre les ravageurs arthropodes, mais également contre certains agents pathogènes végétaux. Les mécanismes expliquant cette protection à large spectre sont mal compris. Reste que dans le domaine de la vanne tic, pourrait présenter un intérêt pour les cultures dépourvues de résistance génétique à un ravageur ou à un agent pathogène, mais pour les cultures généralement sujettes à des attaques simultanées de plusieurs ennemis, le fas vulgaris constitue un exemple privilégié.Il peut être affecté par plus de 400 ravageurs et 200 agents pathogènes, dont l'attaque est considérée comme le facteur limitant le plus important pour la production de haricots dans diverses régions. Pour cette raison, nous pensons que le haricot commun pourrait constituer une culture appropriée pour examiner le potentiel protecteur d'Endo bbar. Dans un premier temps, Arvid démontre l'efficacité des pulvérisations foliaires et des arrosages au sol comme méthodes d'inoculation afin d'établir Bana en tant qu'endophyte.Les graines de haricot commun provenant du haricot appelé TOMA sont stérilisées en surface par une immersion de deux minutes dans de l'hypochlorite de sodium à 0,5 %, suivie d'une immersion de deux minutes dans de l'éthanol à 70 % et de trois rinçages dans de l'eau distillée stérile afin de garantir la réussite de la stérilisation. Un échantillon de cent microlitres d'eau de rinçage est ensemencé sur une boîte de Petri de 100 millimètres contenant un milieu PDA et incubé à l'obscurité pendant 10 jours à 25 degrés Celsius. L'expérience doit être interrompue et recommencée si une croissance est observée dans ces témoins.Les graines sont semées par groupes de trois dans des pots de 11,5 centimètres de large, contenant un mélange de terreau et de sable stérilisé à la vapeur dans un rapport de deux pour un. Les plantes sont cultivées dans des conditions contrôlées à 25 °C, 50 % d'humidité relative et un photopériode de 12 heures avec une intensité lumineuse de 9 200 lux par semaine après la germination. Les plants sont éclaircis à un par pot afin d'assurer leur vigueur et d'éliminer toute compétition.Ils sont irrigués selon les besoins tous les deux à trois jours et fertilisés aux 10 et 20 jours suivant la plantation avec une solution aqueuse d'engrais NPK à six grammes par litre. Pour assurer l'uniformité génétique de nos champignons, les isolats doivent être obtenus à partir de cultures uniques canadiennes. Si la source du champignon est un insecte atteint de mycose, on apporte l'échantillon en hotte à flux laminaire et on utilise une anse d'ensemencement pour transférer un petit échantillon de champignon sporulant DYS sur un milieu PDA.Des transferts ultérieurs vers de nouvelles plaques de milieu peuvent être nécessaires pour éliminer les contaminants une fois qu'un champignon cible se développe et sporule dans une culture propre. Un petit échantillon de kedia, mis en suspension dans un millilitre d'une solution aqueuse à 0,1 % de Triton X-100 et vortexé, utilise ce tensioactif qui réduit la tension superficielle de l'eau et permet aux kedia de se disperser. Un aliquot de 100 microlitres de cette suspension est étalé sur une plaque de Petri de 100 millimètres contenant une fine couche de 2,5 % d'agar noble, ce qui permettra la visualisation des kedia au stéréoscope.La plaque est incubée à température ambiante pendant 24 heures à l'abri de la lumière, après quoi un seul milieu de germination de stylo est transféré dans la plaque de milieu contenant du PDA et laissé croître pendant trois à quatre semaines, jusqu'à ce qu'il recouvre entièrement la plaque de milieu et les spates. Cette méthode permet d'obtenir une culture pure du champignon pour les expériences ultérieures. Pour cette démonstration, nous utilisons une culture pure de Bavaria bassiana, une souche GH HA, provenant du produit commercial Microt.L'inoculum est préparé dans des conditions stériles. Dans une hotte à flux laminaire, nous utilisons une spatule stérile pour prélever environ un gramme de croissance fongique à partir de la surface du milieu, puis nous le suspendons dans 10 millilitres de Triton X 0,1 % stérile. La suspension est homogénéisée par vortex pendant une minute et filtrée à travers un torchon stérile en mousseline afin de séparer les canadia des Hy-Vee. Cette étape produit une suspension épaisse qui doit être ajustée à une concentration finale de 10⁸ kedia par millilitre pour les inoculations.Tout d'abord, la concentration de la solution mère est estimée par une dilution sérielle facilitant le comptage des kedia. Dans une cellule de Malassez, 100 microlitres de la solution mère sont dilués dans 900 microlitres de Triton X à 0,1 % et vortexés, ce qui donne une dilution au 1/10. La procédure est répétée sériellement trois fois supplémentaires afin d'obtenir une dilution au 1/10 000.Les kédias seront présentes en nombres extrêmement élevés dans la première dilution et en faibles quantités, facilement dénombrables, dans la dernière dilution. Chacune des deux chambres du cytomètre Hema est chargée avec 10 microlitres de la dilution au 1/10 000, puis placée sous microscope pour compter les kédias. La zone graduée du cytomètre Hema se compose de neuf grands carrés, chacun contenant 100 nanolitres ou 0,0001 millilitre respectivement.Pour estimer la concentration d'ED dans l'échantillon, on compte et on fait la moyenne des ED présents dans les quatre grands carrés d'angle de chaque chambre, puis on divise cette moyenne par 0,0001. En multipliant cette concentration par notre facteur de dilution de 10 000, on obtient la concentration de la solution mère afin de calculer le volume final auquel celle-ci doit être ajustée. Pour obtenir l'inoculum de 10³⁸ ED par millilitre, on applique la formule.Le volume final est égal au volume de la solution mère multiplié par la concentration de la solution mère divisé par la concentration finale. Dans notre démonstration, la solution mère doit être ajustée à un volume final de 195,5 millilitres afin d'obtenir la concentration souhaitée. Avant d'utiliser l'inoculum, il est important de réaliser un test de germination évaluant la viabilité du canal.Pour ce test, nous déposons 100 microlitres de la dilution au 1/10 000 sur une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 2,5 % d'œuf noble ou de milieu de culture. L'échantillon est étalé à l'aide d'une tige en verre stérile sur la surface du milieu et incubé à l'obscurité à 25 degrés Celsius pendant 24 heures. La viabilité est évaluée au microscope en estimant le pourcentage de kedia présentant un tube germinatif en croissance.Pour trois échantillons aléatoires de 100 graines canadiennes, la suspension canadienne ne peut être utilisée pour les inoculations que si le taux de germination moyen est supérieur à 90 %. Dans cette démonstration, nous obtenons un taux de germination moyen de 97 %. Nous allons démontrer deux méthodes d'inoculation : les pulvérisations foliaires et les arrosages au sol, toutes deux appliquées lorsque les plantes atteignent le stade de première feuille vraie. Environ 14 jours après le semis, la méthode de pulvérisation foliaire est réalisée à l’aide d’un atomiseur manuel en dirigeant la suspension conidiale vers l’abaxial ou la face supérieure des feuilles jusqu’à saturation. Le haut de chaque pot est recouvert de papier d’aluminium afin d’éviter l’écoulement des conidies vers le sol. Après pulvérisation, chaque plante est recouverte d’un sac en plastique pendant 24 heures afin de maintenir un taux d’humidité élevé, facilitant ainsi l’intrusion fongique.La méthode d'infestation par arrosage du sol est réalisée à capacité hydrique du sol. Environ 24 heures après avoir arrosé les plantes jusqu'à saturation du sol, 10 millilitres d'une suspension cial sont appliqués à la surface du sol. À la base de la plante, le témoin reçoit un traitement de Tritton X stérile à 0,1 %, appliqué de la même manière que pour les traitements correspondants.Les plantes sont replacées dans les chambres de croissance et disposées selon un plan en blocs complets randomisés avec trois répétitions par traitement. Nous avons évalué l'établissement deux semaines après les inoculations, un bloc à la fois. Les plantes sont soigneusement récoltées et lavées individuellement à l'eau courante du robinet pour chaque plante.Nous prélevons deux folioles, deux fragments de racine et deux fragments de tige. Les folioles sont choisies aléatoirement parmi la première feuille vraie de la plante et découpées en carrés. Des échantillons d'environ trois centimètres de longueur sont prélevés au milieu de la tige et près de la surface du sol. Des échantillons de racine pivot de longueur similaire sont obtenus au milieu de la racine et à un centimètre en arrière du bout de la racine.Chaque échantillon est stérilisé individuellement en surface dans une hotte stérile au moyen d'une solution à 0,5 % d'hypochlorite de sodium pendant deux minutes, puis rincé avec de l'éthanol à 70 % pendant deux minutes et lavé trois fois avec de l'eau distillée stérile avant d'être laissé à sécher. Sur du papier essuie-tout stérile, l'échantillon stérilisé est ensuite soigneusement disséqué afin d'éliminer son bord externe, où les endophytes auraient pu être détruits en raison du contact avec les désinfectants. L'échantillon paré est ensuite découpé en sections plus petites, mesurant en moyenne six millimètres sur six millimètres pour les feuilles, et six millimètres de longueur pour les tiges et les racines.Les sections sont ensemencées sur des boîtes de Pétri de 60 millimètres contenant de la PDA supplémentée avec les antibiotiques tétracycline, streptomycine et pénicilline à deux milligrammes par litre chacun. Enfin, les boîtes sont scellées avec du paraffine et incubées à l’obscurité à 25 degrés Celsius. L’eau de rinçage est changée après le traitement de chaque bloc, mais avant qu’un échantillon de 100 microlitres soit ensemencé sur une boîte de Pétri de 100 millimètres, sur milieu PDA, et incubé pendant 10 jours à 25 degrés Celsius afin de déterminer si la sérialisation a été couronnée de succès.Si une croissance quelconque est observée dans ce témoin, le bloc est écarté et n'est pas pris en compte pour l'analyse. Les boîtes sont examinées tous les deux à trois jours pendant 20 jours afin d'observer et de noter la croissance fongique. Les sections végétales colonisées sont excisées et transférées individuellement sur de nouvelles boîtes de milieu pour éviter de contaminer les sections voisines.La croissance de B. bassiana est enregistrée en fonction des mycèles blancs denses caractéristiques, devenant crème à jaune pâle au niveau des bords. En cas de doute, l'échantillon est monté dans une goutte d'eau sur une lame de microscope et examiné en lumière incidente pour détecter la présence de conidies en forme de fuseau et de chaînettes en zigzag, caractéristiques de l'espèce, le même jour où est évaluée la colonisation. Nous évaluons également l'impact de nos traitements sur la croissance des plantes.Nous mesurons d'abord la hauteur de la plante depuis la base de la plante jusqu'au sommet du point de croissance. Ensuite, nous extrayons soigneusement les plantes et les lavons à l'eau du robinet, puis les laissons sécher à 45 degrés Celsius pendant trois jours afin de mesurer leur poids sec. Pour cette démonstration, nous avons réalisé l'expérience complète deux fois afin d'obtenir des résultats représentatifs.Les deux méthodes d'inoculation ont entraîné la physicalisation par Bana chez plus de 80 % des plantes traitées. Toutefois, l'importance de la colonisation dépendait de la partie de la plante évaluée et de la méthode d'inoculation utilisée. Les tiges ont répondu le mieux.Les inoculations par pulvérisation des racines, en revanche, n'ont répondu qu'aux inoculations par arrosage. Enfin, les tiges ont réagi de manière similaire aux deux méthodes d'inoculation. Bana n'a pas été détecté dans aucune des sections végétales contrôlées, indépendamment du traitement, sauf pour les endophytes autres que Bana regroupés à partir de 15 % des sections végétales évaluées, mais ils ont été découpés à partir des boîtes de milieu avant qu'ils ne puissent envahir les sections voisines et influencer nos résultats.Deux semaines après l'inoculation, les plantes traitées et témoins étaient indistinguables à l'œil nu, et aucune différence significative n'a été détectée concernant leur poids sec ni leur hauteur. De nombreux facteurs peuvent influencer un résultat expérimental spécifique visant à établir un agent pathogène endophyte comme effet final. Comme le montre cette vidéo, la méthode d'inoculation est l'un de ces facteurs biologiques ; d'autres facteurs expérimentaux incluent l'espèce ou le cultivar de la culture sélectionné, ainsi que le choix de l'espèce ou de l'isolat du pathogène OMA. Parmi les autres paramètres à envisager de manipuler figurent la concentration de l'inoculum, l'âge de la plante au moment de l'inoculation et les conditions de croissance de la plante.L'objectif ultime de ces expériences doit être de développer un traitement efficace offrant une résistance systémique durable contre l'INE ou la maladie. Lorsque vous serez prêt à tester la résistance induite par les endophytes, nous vous recommandons de visionner une vidéo caractérisant les mécanismes de résistance herbacée, également publiée dans le Journal of Visualized Experiments. Veuillez noter que les endophytes sont très courants chez les plantes et qu'ils risquent d'influencer votre capacité à établir de façon durable et à détecter un champignon pathogène cible en tant qu'endophyte.Nous espérons que vous trouverez cette démonstration utile. Bonne chance dans vos expériences.

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Identification guidée par bioessai de produits naturels pour le biocontrôle par chromatographie sur couche mince-bioautographie directe

Un protocole d’essai biologique sur feuilles détachées a été établi pour l’élevage en masse des thrips du piment à l’aide d’une méthode modifiée à feuilles détachées dans des contenants en verre contenant de la gélose, assurant une survie élevée et un développement synchronisé. Ce système permet un dépistage efficace de la virulence des champignons entomopathogènes contre les larvesdu 2e stade et fournit un approvisionnement fiable en thrips pour les évaluations en laboratoire, en serre et sur...

Mise en place d’un système d’élevage de thrips de piment (Scirtothrips dorsalis Hood) pour le dépistage de la virulence des champignons entomopathogènes

Découvrez deux méthodes d'inoculation pour établir Beauveria bassiana comme endophyte chez Phaseolus vulgaris. Cette technique avance le contrôle biologique durable contre les ravageurs agricoles.

Établir entomopathogènes fongiques comme endophytes: Vers un contrôle biologique endophytique

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