Name: Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de Arabidopsis thaliana Graines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Apprenez à isoler rapidement des embryons précoces d'Arabidopsis thaliana pour des analyses transcriptomiques et épigénomiques. Cette méthode permet d'extraire jusqu'à 40 embryons en 1 à 4 heures.

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Nous tenons à remercier Tal Nawy et Martin Bayer pour leurs conseils sur l&#39;isolement de l&#39;embryon. MTR, VG, UG et CB conçu le matériel d&#39;isolation de l&#39;embryon. MTR, VG et CB ont développé le protocole d&#39;isolement de l&#39;embryon. MTR, VG et CB établi le protocole, isolés les embryons, et l&#39;embryon ADNc généré, VG réalisé la PCR, le MTR de coloration GUS, JJ des expériences du poisson. MTR, VG, CG et UG écrit le manuscrit. Ce travail a été financé par l&#39;Université de Zürich, une bourse de la Fondation de recherche Roche (à MTR), et des subventions de la Fondation nationale suisse (à UG et CB).

La procédure est résumée dans l&#39;organigramme de la figure 1. Le microcapillaires et la configuration instrumentale sont présentés dans la figure 2 et la figure 3, et les étapes typiques de l&#39;isolement de l&#39;embryon sont présentés dans la figure 4. 1. Matière et mémoire tampon Préparation 1.1 Silicon revêtement de verre microcapillaires <ol><li> Placez le microcapillaires dans un tube Falcon de 15 ml avec environ 5 ml de Sigmacote (Sigma) et inverser plusieurs fois. </li><li> Retirez la solution, placer le tube Falcon contenant les capillaires dans une feuille d&#39;aluminium et cuire au four pendant 3 heures à 60 ° C. Stocker à température ambiante. </li></ol> 1.2 Obtenir ~ 50-100 um de diamètre conseils microcapillaires <ol><li> Tirez 1 mm de diamètre capillaires en verre soit manuellement sur un bec Bunsen ou en utilisant un extracteur commercial (extracteur filament vertical ou micropipette extracteur). </li><li> Utiliser un diamantStylo à pointe ou une lame pour couper le bout du capillaire tiré pour créer l&#39;ouverture souhaitée. Sélectionnez les capillaires meilleure forme sous un microscope stéréo. L&#39;ouverture devrait être 50-100 um (Figure 2). </li></ol> 1.3 Préparation de la lame <ol><li> Siliconize lames propres en couvrant tous les puits avec Sigmacote (~ 1 ml / slide) pendant 5 min, retirer. Cuire 3 heures dans du papier d&#39;aluminium. Stocker à température ambiante. </li><li> Laver les lames microscopiques verre multi-puits pendant 10 min dans 10% SDS, 2 x 2 min dans de l&#39;eau sans nucléase (autoclave DEPC-DDH 2 O), 2 min dans de l&#39;éthanol à 70%, 2 min dans de l&#39;éthanol à 100%, air- sécher. Toutes les étapes sont effectuées dans des bocaux Coplin autoclave. Les diapositives peuvent être réutilisés plusieurs fois fournir un nettoyage en profondeur entre chaque utilisation. </li><li> Juste avant l&#39;embryon propagation d&#39;isolement ~ 0,5 ul de 10 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) avec une pipette sur toute la surface de chaque puits et séché à l&#39;air. </li></ol> 1.4 Microscope et la configuration capillaire &lt;ol&gt; <li> Utiliser un microscope inversé avec un 10x et 20x objectif de grossissement. Optimiser le contraste de lumière (embryons sont tout à fait transparent). </li><li> Placez un micromanipulateur pour maintenir le capillaire en verre à côté du microscope. Le verre capillaire est connecté à un micro-injecteur (figure 3A) ou à une pipette régulière P-200 via un tube en caoutchouc (Figure 3B, voir discussion pour une description détaillée de cette installation). </li><li> Placer le capillaire au-dessus de la lame de microscope à un angle de ~ 70 ° (figure 3) et régler la position d&#39;avoir l&#39;ouverture dans le champ de vision. </li><li> Juste avant l&#39;isolement de l&#39;embryon prendre et relâcher ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) pour enrober le capillaire. </li></ol> 1,5 Tampons Le tableau 1 présente l&#39;isolement et la destination des tampons en fonction des applications en aval. <ol><li> Préparer ~ 1 tampon d&#39;isolement ml par échantillon fraîchement avant l&#39;utilisation et le garder sur la glace. </li><li> Préparer le tampon de destination dans un tube à faible liaison 0,5 ml Eppendorf sur la glace (applications moléculaires) ou sur une lame de microscope (applications cytologiques) dans une chambre humide. </li></ol> 2. Dissection de semences et d&#39;extraction de l&#39;embryon 2.1 Synchronisation de développement des semences <ol><li class="jove_content"> Émasculer fleurs et les garder 2 jours dans la chambre de croissance, tout en évitant le contact des pistils exposés avec d&#39;autres fleurs, alors les polliniser (par exemple 11). </li><li class="jove_content"> Testez le stade de développement sous vos conditions de croissance par étude microscopique des graines compensés. Grâce à nos conditions de croissance (16 heures de lumière à 21 ° C, 8 h obscurité à 18 ° C et 70% d&#39;humidité) de graines collectées 2,5 jours après la pollinisation (DAP) ont livré principalement 2-4 embryons cellulaires et les graines collectées 3,5 à 4 DAP a donné globulaire embryons. </li></ol> 2.2 Seed Dissection et Rupture <ol><li> Retirez le seeds 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) sous une loupe binoculaire avec des pinces et des aiguilles à insuline. </li><li> Plonger les graines dans 20 tampon d&#39;isolement ul dans un tube Eppendorf 2 ml à fond rond placé sur la glace. </li><li> Écraser délicatement les graines avec un pilon en plastique (préalablement nettoyé avec 10% de SDS, rincé avec DEPC-DDH 2 O et lavé avec de l&#39;éthanol à 70%) pour libérer les embryons jusqu&#39;à ce que l&#39;extrait de pépins est trouble. La force à appliquer doit être déterminé par chaque utilisateur lors de son procès. </li><li> Rincer le pilon avec 300 pi de tampon d&#39;isolement pour laver le pilon et diluer l&#39;échantillon. </li><li> Spin-bas l&#39;extrait à 5000 g pendant 5 sec. Resuspendre doucement l&#39;extrait granulés par aspiration-et-vient 2-3 fois. </li><li> Filtrer l&#39;extrait avec une maille de nylon de 30 um (monté sur les adaptateurs de tubes, par exemple de PartecCelltricks). Rincez le filet avec un tampon d&#39;isolement supplémentaire de 200 ul. </li></ol> 3. Isolation des embryons 3.1 Préparation de la lame <ol> &lt;li&gt; Placez une lame multi-puits propre, BSA-couché et siliconé sur la scène du microscope inversé, remettre en suspension l&#39;extrait de graines filtrée par un léger pipetage de haut en bas et d&#39;une pipette 2 gouttes de 40-50 ul extrait de graines dans 1 ou 2 puits . Dépistage seulement 1 ou 2 gouttes à la fois empêche l&#39;évaporation de l&#39;échantillon. </li><li> Placer 50 pi de tampon d&#39;isolement frais (1 goutte de lavage st) dans un puits d&#39;une autre diapositive préparée comme avant. Gardez cette diapositive dans une chambre humide couverte pour éviter l&#39;évaporation. </li></ol> 3.2 Ecran, nettoyer, collecter <ol><li> Écran les gouttelettes d&#39;extrait de pépins pour les embryons au stade souhaité avec l&#39;objectif de grossissement de 10x. Si nécessaire, confirmez la scène avec un grossissement de 20x. Les embryons coulent généralement vers le bas de la glissière. </li><li> Retirer manuellement les débris autour de l&#39;embryon d&#39;une aiguille de tungstène, d&#39;une aiguille d&#39;insuline ou d&#39;un équipement similaire. </li><li> Déplacez le capillaire en verre près de l&#39;embryon à l&#39;aide du micromanipulateur, take l&#39;embryon avec aussi peu de solution possible. </li><li> Rassemblez plusieurs embryons (par exemple tous une gouttelette) et les libérer dans la chute de lavage 1er (demande moléculaire) ou dans un tampon de destination (applications cytologiques). Chaque tour de collecte doit être conservé dans les 5-10 min et embryons doivent être collectés dans un volume minimal (le volume total de tous les tours de collecte doit être &lt;5 pi). </li><li> Répéter le dépistage et la collecte jusqu&#39;à la quantité désirée d&#39;embryons est rassemblée dans la chute de lavage 1er (au centre, si possible, afin de faciliter souvenir). </li><li> Rappelez tous les embryons à la fois de la baisse de lavage (si des débris sont reportés, retirez-les avec une aiguille avant de souvenir). </li><li> Relâchez les embryons dans une goutte de lavage 2 ème de 50 pi. Répétez 3.2.6. </li><li> Relâchez les embryons dans le tampon de destination. Le transfert devrait impliquer seulement un contact, et non l&#39;immersion, de la pointe capillaire. </li><li> Remplacez le microcapilLary pour l&#39;échantillon suivant. </li></ol>

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<li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li>
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<li>Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), In Press (1111).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons élaboré un protocole d&#39;isolement de l&#39;embryon qui est rapide, efficace, et peuvent être facilement transférées à d&#39;autres laboratoires. L&#39;équipement décrit ici se compose d&#39;un microscope inversé, un micromanipulateur, verre microcapillaires, un extracteur de filament vertical et un micro-injecteur (figure 3A). La configuration est similaire à celle décrite pour l&#39;isolement de cellules animales unique pour l&#39;analyse transcriptomique <sup...

L&#39;embryon de plantes à fleurs est entouré par l&#39;albumen, un tissu nutritif dérivé d&#39;un deuxième événement de la fécondation. Les deux embryon et de l&#39;endosperme sont entourés de plusieurs couches cellulaires de l&#39;enveloppe de la graine. Collectivement, ces tissus constituent une graine, qui se développent à l&#39;intérieur du fruit. Ainsi, les tissus et les analyses spécifiques des cellules d&#39;embryons d&#39;Arabidopsis sont fortement altérées en raison de leur inaccessibilité. Néanmoins, les embryons au stade tardif globulaires ou plus sont relativement bien prête à dissection manuelle en utilisant des aiguilles de tungstène fines au microscope stéréoscopique, ou en appliquant une légère pression sur la graine en utilisant une pince pour les extraire. Ces techniques ont été utilisées avec succès pour les analyses de profilage épigénome telles que l&#39;hybridation de puces à ADN, séquençage au bisulfite, ou de l&#39;ARN (par exemple 1-3) ou transcriptome. En revanche, les études d&#39;embryons au zygote jusqu&#39;au début du stade globulaire restent techniquement difficile. À ce jour, seules quelques études ont repLes analyses du transcriptome signalés auparavant sur ​​les jeunes embryons en utilisant soit microdissection laser-capture (LCM) de tissus embryonnaires de sections de semences fixe 4 ou extraction manuelle des embryons individuels de semences à l&#39;intérieur en utilisant des outils fines 5. Toutefois, l&#39;équipement LCM n&#39;est pas couramment disponibles et extraction de l&#39;embryon aux premiers stades manuel prend du temps et exige d&#39;excellentes compétences de dissection qui ne sont pas facilement transférables. En plus des analyses du génome entier, dans les analyses d&#39;expression génique in situ sont également difficiles à réaliser sur les jeunes, l&#39;ensemble du montage embryons d&#39;Arabidopsis. Dans une certaine mesure, les jeunes embryons peuvent être libérés sur des lames de microscope par une légère pression sur les graines et utilisés pour des essais de gène rapporteur ou la détection des protéines par coloration immunologique (voir par exemple 6,7). Cette technique, cependant, ne permet pas l&#39;isolement des embryons à haut débit, entravant ainsi les analyses quantitatives. Par conséquent, nous avons développé un protocole efficace et rapidepour l&#39;isolement précoce de l&#39;embryon à partir de graines d&#39;Arabidopsis qui est simple à mettre en place, facilement transférable et approprié pour une variété d&#39;applications en aval. Le principe de base est d&#39;écraser doucement graines - disséqué de jeunes siliques dans un tube Eppendorf à l&#39;aide d&#39;un pilon en plastique dans un tampon d&#39;isolement approprié. L&#39;extrait de graines est placée sous forme de gouttelettes sur un chariot multi-puits et est projeté pour la présence d&#39;embryons libérés au stade souhaité à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé. Les embryons sont recueillies à l&#39;aide d&#39;un verre MICROCAPILLAIRE attaché à un micro-injecteur ou une pipette de laboratoire standard. Pour les applications moléculaires, les embryons sont lavés deux fois par libération répétées dans des gouttes d&#39;un nouveau tampon d&#39;isolement avant de les transférer à la mémoire tampon de destination dans un volume minimal. Pour les applications cytologiques (dosages de rapporteur, immunomarquage, poisson), des étapes de lavage peuvent être omises. La méthode présente plusieurs avantages: (i) il donne 25-40 embryons ~ 45 min pour app cytologiquecations ou à 3-4 h pour les applications moléculaires (qui comprend les étapes de lavage), (ii) il permet l&#39;isolement des stades embryonnaires spécifiques, (iii) il est facilement transférable à d&#39;autres personnes et les laboratoires en raison de sa configuration simple, (iv) nécessite un équipement abordable pour la configuration de base qui se prête à la mise à niveau et (v) il a été utilisé avec succès pour diverses applications en aval telles que séquençage de l&#39;ARN 8, analyse méthylation de l&#39;ADN spécifique du gène 9, des dosages de rapporteur (10 et Raissig et al., en prép.) et le poisson (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédit, voir figure 5).

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (technologies de la vie)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Tampon premier brin</td><td>Invitrogen (technologies de la vie)</td><td>18064-022</td><td>contenu dans le package Superscript II</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (technologies de la vie)</td><td>18064-022</td><td>contenu dans l’emballage de Superscript II</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) 100x = 10 mg/ml </td><td>New England Biolabs Inc.</td><td></td><td>Différents fournisseurs travailleront également </td></tr><tr><td>Capillaires à paroi mince 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tube 0,5 ml</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&#916 ; 30 &#956 ; m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>Lames 5 puits de 10 mm de diamètre</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus lame</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&#228 ; ser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fluka</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>SDS granulés</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pestle</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Seringues à insuline microfines</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Forceps N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur Pico Chip</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon TMS (Japon),</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Leitz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Micomanipulator Sonde LH1 Post mount</td><td>Leica microsystems</td><td>39430101</td><td>Une marque différente fera également le travail</td></tr><tr><td>Extracteur de filament vertical</td><td>Instrument Sutter</td><td>modèle P-20</td><td>D’autres modèles conviennent également </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Invitrogen (technologies</td><td></td><td></td> de la vie</tr></tbody></table>

isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; graines

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Chez les plantes à fleurs, l&#39;embryon se développe au sein d&#39;un tissu nourricier - l&#39;endosperme - entouré par les téguments de la graine mère (ou tégument). En conséquence, l&#39;isolement des embryons de plantes à des stades précoces (1 cellule de stade globulaire) est techniquement difficile en raison de leur inaccessibilité relative. Dissection manuelle efficace à un stade précoce est fortement altérée par la petite taille des jeunes graines d&#39;Arabidopsis et l&#39;adhérence de l&#39;embryon aux tissus environnants. Nous décrivons ici une méthode qui permet l&#39;isolement efficace des jeunes embryons d&#39;Arabidopsis, produisant jusqu&#39;à 40 embryons en 1 h à 4 h, en fonction de l&#39;application en aval. Les embryons sont libérés dans le tampon d&#39;isolement d&#39;un peu écrasant 250-750 graines avec un pilon en plastique dans un tube Eppendorf. Un verre microcapillaire monté soit une pipette de laboratoire standard (par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube de caoutchouc) ou un micro-injecteur à commande hydraulique est utilisé pour recueillir des embryons d&#39;un endroit gouttelettesd sur un chariot multi-puits sur un microscope optique inversé. Les compétences techniques requises sont simples et facilement transférables, et la configuration de base ne nécessitent pas de matériel coûteux. Embryons collectés sont adaptés à une grande variété d&#39;applications en aval telles que la RT-PCR, séquençage de l&#39;ARN, des analyses de méthylation de l&#39;ADN, l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH), immunologique, et des dosages de gènes rapporteurs.

Notre procédure d&#39;isolement de l&#39;embryon (figure 1) permet d&#39;isoler jusqu&#39;à 40 embryons à 4 heures si les lavages sont effectués, par exemple pour les applications moléculaires, ou en moins d&#39;une heure si lavages sont omis, par exemple pour des applications cytologiques. Figure 2 affiche haut et bas Conseils microcapillaires qualité et la figure 3 montre la configuration de la machine d&#39;isolement de l&#39;embryon. Figure...

Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines. Embryons jusqu&#39;à 40 peuvent être isolés dans 1 h à 4 h, en fonction de l&#39;application en aval. Le procédé est approprié pour transcriptome, la méthylation de l&#39;ADN, l&#39;expression du gène rapporteur, et la fluorescence immunomarquage<em&gt; In situ</em&gt; Analyses d&#39;hybridation.

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les jeunes embryons de plantes. Ceci est accompli en disséquant d’abord les graines. La deuxième étape consiste à écraser doucement les graines dans un tampon d’isolement.Ensuite, les embryons sont dépistés puis collectés par micro-aspiration sous microscope inversé. La dernière étape consiste à rassembler tous les embryons dans un volume minimal après le lavage et à les transférer dans le tampon de destination. En fin de compte, les embryons peuvent être utilisés pour l’extraction d’ARN ou d’ADN afin d’analyser le transcriptome ou l’épigénome, ou utilisés pour des analyses cytologiques, telles que des tests de rapporteur de gènes ou l’hybridation in situ fluorescente.Le principal avantage de cette technique est de pouvoir isoler les embryons de plantes en vrac et à des stades de développement spécifiques. Généralement, les personnes novices dans cette méthode n’auront aucun problème à l’appliquer rapidement et efficacement. Pour commencer, sélectionnez au microscope les capillaires les mieux formés qui ont été préalablement siliconés, tirés et coupés.Comme décrit dans le protocole textuel, l’ouverture doit être lisse et d’environ 50 à 100 microns. Ensuite, lavez les lames de microscope en verre multi-puits siliconé dans des bocaux coplin pendant 10 minutes dans 10 % SDS après le lavage au détergent. Lavez les lames deux fois pendant deux minutes.Dans de l’eau sans nucléase pendant deux minutes dans de l’éthanol à 70 %, pendant deux minutes dans de l’éthanol à 100 %, puis sécher à l’air. Ensuite, étalez environ 0,5 microlitre de 10 milligrammes par millilitre, d’albumine sérique bovine ou BSA avec une pipette sur toute la surface de chaque puits et séchez à l’air. Ensuite, préparez le microscope d’isolement de l’embryon.Utilisez un microscope inversé avec un objectif de grossissement de 10 x et 20 x. Connectez le capillaire en verre à un micro-injecteur pour enrober le micro capillaire. Prenez environ six microlitres de BSA et libérez-le.Récoltez les lisses au stade de développement souhaité, soit après des croisements, soit des soles d’autofécondation. 2,5 jours après la pollinisation sont utilisés ici et contiennent deux à quatre embryons cellulaires. Retirez les graines de 10 à 15 LIC au microscope stéréoscopique avec une pince et de l’insuline. Aiguilles.Plongez les graines dans 20 microlitres de tampon d’isolement dans un tube à fond rond de deux millilitres placé sur de la glace. Écrasez doucement les graines avec un pilon en plastique pré-nettoyé comme décrit dans le protocole textuel pour libérer les embryons jusqu’à ce que l’extrait de graines soit trouble. La force à appliquer doit être déterminée par chaque utilisateur lors de l’essai.Rincez le pilon avec 300 microlitres de tampon d’isolement pour laver le pilon et diluer l’échantillon. Faites tourner l’extrait à 5 000 chi pendant cinq secondes après la centrifugation. Remettez doucement l’extrait granulé en suspension en le pipetant de haut en bas deux à trois fois.Filtrez l’extrait à l’aide d’une maille en nylon de 30 microns montée sur des adaptateurs de tube et faites pivoter le tube. Rincez la maille avec 200 microlitres supplémentaires d’isolation, de tampon et de balancement. Encore. Pour préparer les lames à l’isolement de l’embryon, placez une lame multi-puits propre recouverte de BSA et siliconée sur la platine du microscope inversé.Placez le capillaire au-dessus de la glissière et ajustez la position pour avoir l’ouverture dans le champ de vision. Après Resus, en suspendant l’extrait de graine filtré par pipetage doucement de haut en bas, pipetez deux gouttelettes de 40 à 50 microlitres d’extrait de graine dans un ou deux puits. Le criblage d’une ou deux gouttes à la fois empêche l’évaporation de l’échantillon, placez 50 microlitres de tampon d’isolement frais dans un puits d’une lame différente préparée comme précédemment.Pour servir de première goutte de lavage. Conservez cette diapositive dans une chambre humide couverte pour éviter l’évaporation. Criblez les gouttelettes d’extrait de graines pour les embryons au stade souhaité avec l’objectif de grossissement 10 x si nécessaire.Confirmez la platine avec le grossissement de 20 x. Les embryons coulent généralement au fond de la lame. L’aspect le plus important de cette procédure est de collecter des embryons avec un minimum de débris.Cela peut être réalisé en nettoyant avec une aiguille en tungstène, en contrôlant soigneusement la chute de lavage pour détecter les débris de transport potentiels et en répétant les lavages si nécessaire. Retirez manuellement les débris autour de l’embryon à l’aide d’une aiguille en tungstène, d’une aiguille à insuline ou d’un équipement similaire. Déplacez le capillaire en verre près de l’embryon à l’aide du micromanipulateur et prélevez l’embryon avec le moins de solution possible.Prélevez plusieurs embryons et libérez-les lors du premier lavage. Goutte. Pour les applications moléculaires pour les applications cytologiques, les embryons peuvent aller directement dans le tampon de destination. Chaque tour de collecte doit être conservé dans les cinq à 10 minutes et les embryons doivent être collectés dans un volume minimal.Répétez le dépistage et la collecte jusqu’à ce que la quantité souhaitée d’embryons soit recueillie dans la première goutte de lavage. Si des débris sont entraînés dans la goutte de lavage, retirez-les avec une aiguille avant de recueillir tous les embryons en même temps de la goutte. Libérez les embryons dans une deuxième goutte de lavage de 50 microlitres et répétez la collecte.Enfin, libérez les embryons dans le tampon de destination. Le transfert ne doit impliquer qu’un contact et non une immersion de l’extrémité capillaire indiquée. Voici plusieurs embryons dans la dernière goutte suite aux lavages.Les embryons végétaux isolés peuvent maintenant être utilisés pour diverses applications en aval afin de contrôler le CD NA embryonnaire. Bibliothèques avant le séquençage. Les transcrits spécifiques à l’embryon ont été amplifiés. Voici les résultats de l’amplification PCR sur CD NA. Des banques de deux à quatre embryons cellulaires lavés une seule fois, et sur l’ADN génomique, l’isolement des embryons s’est avéré très utile dans les essais de gènes rapporteurs à faible expression embryonnaire et où le tégument maternel brouille la détection.Enfin, l’hybridation fluorescente en C deux a été appliquée pour étudier l’architecture nucléaire dans des embryons isolés noyés dans des coussinets d’acrylamide sur des lames. Un exemple d’utilisation de sondes contre les répétitions du centromère et les régions d’organisation inférieures nucléaires est montré ici. Une fois maîtrisée, cette technique permet d’isoler 30 embryons en moins d’une heure pour les applications cytologiques, et en moins de trois heures pour les applications moléculaires, incluant toutes les étapes de lavage.En fait, cette technique permettra à la communauté de recherche végétale d’explorer les mécanismes génétiques et épigénétiques de l’embryogenèse.

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Cette vidéo montre une procédure permettant d'isoler des protoplastes intacts les tissus à partir de 14 jours d'âge des plants d'Arabidopsis. Étant donné que les protoplastes isolés restent intacts pendant au moins 96h et sont isolées de plants au lieu d'un mois, les plantes matures, cette procédure accélère les essais nécessitant protoplastes intacts.

Isolement de protoplastes à partir de tissus de 14 jours d&#39;âge des plantules Arabidopsis thaliana</em

L'imprinting est un phénomène dans l'usine et la reproduction des mammifères. Méthylation de l'ADN joue un rôle important dans les mécanismes de l'empreinte. Isoler l'endosperme et la détermination du statut de méthylation de gènes soumis à empreinte dans...

Détermination de méthylation de l&#39;ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme

Nous présentons la procédure pour assembler une literie de manteau essai de semences (ARA) de Arabidopsis thaliana graines. L'ARA s'est révélée être un outil puissant pour explorer génétiquement in vitro et la façon dont la germination des contrôles de l'endosperme de graines en dormance des graines et en réponse à des signaux lumineux. L'ARA est en principe applicable en vertu d'une situation où l'endosperme est soupçonné d'influencer la croissance embryonnaire.

Un tégument Literie dosage à explorer génétiquement<em&gt; In Vitro</em&gt; Comment la germination des contrôles endosperme des semences dans<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

L’objectif est d’illustrer que la légumineuse modèle Medicago truncatula peut être facilement utilisée pour étudier la régulation de l’embryogenèse précoce des plantes en complément du modèle Arabidopsis non légumineuse. La morphologie des gousses est liée aux stades de l’embryogenèse zygotique et un protocole de collecte d’embryons par culture tissulaire est également fourni.

Protocoles pour l&#39;obtention Zygotic et embryons somatiques pour l&#39;étude de la réglementation de développement précoce de l&#39;embryon dans la légumineuse modèle<em&gt; Medicago truncatula</em

Ce protocole décrit une méthode permettant d’observer l’embryogenèse chez Arabidopsis via clairance ovule, suivie par l’inspection de la formation embryonnaire sous un microscope.

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d'Arabidopsis utilisant un microscope d'épifluorescence.

Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Un protocole à haut débit pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) est fourni, optimisant les étapes de manipulation des liquides avec un simple dispositif d’aspiration construit avec une pompe à vide. Des centaines d’échantillons de semences peuvent être stérilisés en surface en une journée.

Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

Une méthode améliorée pour mesurer les profils d’hydratation du pollen chez Arabidopsis thaliana est décrite ici. La nouvelle méthode offre une résolution plus élevée, est non invasive et est hautement reproductible. Le protocole représente un nouvel outil pour une dissection plus fine des processus qui régulent les premiers stades de la pollinisation.

Un essai biologique in vivo à haute résolution sur l’hydratation du pollen à grain unique pour Arabidopsis thaliana

Ce protocole décrit la préparation d’échantillons intacts de la couche de cellules de l’endosperme dans les graines d’Arabidopsis thaliana . La méthode ne nécessite que l’équipement de laboratoire courant, tel qu’une aiguille d’injection et des pinces de précision, et permet l’imagerie fluorescente haute résolution de cellules vivantes de cellules endospermiennes dans les graines en développement et matures.

Préparation de tissu intact pour l’analyse microscopique de la couche de cellules de l’endosperme dans des graines d’Arabidopsis en développement et matures

Apprenez à isoler rapidement des embryons précoces d'Arabidopsis thaliana pour des analyses transcriptomiques et épigénomiques. Cette méthode permet d'extraire jusqu'à 40 embryons en 1 à 4 heures.

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de

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