Isolement des microorganismes du sol autochtones ayant un potentiel de Breaking Down biodégradables paillis de plastique films utilisés dans l'agriculture

L’objectif général de l’expérience suivante est d’isoler les champignons et les bactéries du sol qui colonisent et dégradent les pellicules de paillis biodégradables. Ceci est réalisé en incubant d’abord des films de paillis biodégradables dans des sacs en filet dans le sol suffisamment longtemps pour permettre une colonisation substantielle par les microbes indigènes du sol. Après l’incubation, les paillis sont extraits et mis en plaques de dilution, ce qui donne des colonies isolées uniques de chaque type cultivable de microbes intimement associés.

Ensuite, les microbes isolés sont patchés sur des paillis biodégradables et à surface fraîche, désinfestés, ainsi que sur des plaques de gélose avec ou sans source de carbone. Afin de comparer la croissance, les résultats sont ensuite confirmés en milieu liquide. Les résultats montrent une colonisation et/ou une dégradation par certains isolats basés sur la microscopie électronique à balayage et peuvent être vérifiés par chromatographie par perméation de gel.

N’oubliez pas que travailler avec des isolats fongiques et bactériens non identifiés peut être dangereux, et des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure, comme porter des gants, sceller les tubes et les boîtes de culture et travailler dans une enceinte de biosécurité. Après avoir incubé des morceaux de paillis dans le sol et préparé des milieux et des réactifs conformément au protocole de texte, coupez les nouveaux morceaux de paillis en carrés de 4,25 centimètres pour décontaminer les morceaux de paillis. Autoclavez-les si cela ne les altère pas ou ne les dégrade pas pour les morceaux de paillis non autoclavables tels que ceux en plastique.

Après avoir préparé une enceinte de biosécurité conformément au protocole de texte, placez les morceaux de paillis dans la hotte décontaminée en rangées et incubez les morceaux de paillis sous la lumière UV pendant deux heures, à l’aide d’une pince propre et stérilisée et en commençant par la première rangée et en allant vers l’arrière pour éviter de placer les mains et les bras sur les surfaces nouvellement décontaminées. Retournez les morceaux de paillis, en plaçant le côté infesté vers le bas sur une zone propre, exposée à la lumière UV, mais pas auparavant en contact avec le paillis. Après deux heures de traitement UV de chaque côté, encore une fois, en travaillant de l’avant vers l’arrière.

À l’aide d’une pince stérile, retirez les morceaux de paillis de l’enceinte de biosécurité et placez-les dans des contenants stériles et secs, comme des béchers recouverts de papier d’aluminium. Conservez-les à température ambiante dans l’obscurité sous une hotte de transfert stérile. À l’aide d’une technique aseptique, posez les morceaux de paillis infestés d’UV sur la surface de plaques de gélose en posant d’abord un coin et doucement, en laissant le reste du carré rouler en contact avec la gélose.

Pour les films non perméables à l’eau, placez quatre gouttes de 10 microlitres de milieu semi-solide et minimal fondu sur les coins des morceaux de paillis pour fournir une source d’eau et de nutriments pour la colonisation initiale des plastiques hydrophobes. Ne touchez pas la surface des morceaux de paillis. Avec la pointe de la pipette, les gouttes vont durcir en billes.

Incuber les assiettes couvertes à la verticale pendant la nuit à température ambiante pour qu’elles se solidifient. Rangez ensuite les plaques, côté agar vers le haut, dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Tous les matériaux nécessaires aux essais biologiques sont maintenant préparés et vous êtes prêt à commencer l’isolement des champignons dégradant potentiellement le paillis à partir des morceaux de paillis qui ont été enterrés dans le sol.

Déterrez les sacs en filet du sol et retirez les morceaux de paillis des sacs en filet. À l’aide d’une spatule stérile et d’une pince, retirez délicatement l’excès de terre des paillis sans déranger le sol qui s’accroche à la surface. Coupez le film BDM en morceaux d’un centimètre carré jusqu’à ce que 0,5 gramme de matériau soit récupéré.

Pour chaque transfert d’échantillon répété, 0,5 gramme de morceaux de paillis et de terre attachée dans 25 millilitres. Les tubes de culture contenant 9,5 millilitres de PBS ajoutent 0,5 gramme de sol au sol, uniquement aux tubes de contrôle ou aux échantillons où le paillis est complètement dégradé pour briser les biofilms et détacher les cellules des morceaux de paillis. Faites vortex les tubes pendant 30 secondes à grande vitesse, puis faites-les soniser dans un bain-marie pendant 10 minutes et vortexez-les à nouveau.

Cela devrait donner une suspension homogène de cellules microbiennes qui ont été associées aux morceaux de paillis. Pour une dilution en série d’échantillons. Préparez un tube de culture avec 4,5 millilitres de PBS stérile et remplissez trois puits d’une plaque à puits profond avec 450 microlitres de PBS par échantillon à partir des tubes de suspension d’origine.

Transférez 0,5 millilitre dans les 4,5 millilitres de PBS stérile pour obtenir une dilution de 5,0 fois 10 à la puissance négative après un vortex à grande vitesse pendant 30 secondes, ajoutez 50 microlitres à 450 microlitres de PBS dans le mélange de plaque à 96 puits en pipetant doucement de haut en bas 10 fois jusqu’à ce que les dilutions jusqu’à 5,0 fois 10 puissance moins six soient complètes. Utilisez des tiges de verre courbées stérilisées à la flamme pour répartir uniformément 100 microlitres de chacune des dilutions sur la surface de la gélose des plaques de PDA contenant du chloramphénicol pour inhiber la croissance bactérienne. Conservez les assiettes à la verticale pendant 30 minutes pour laisser le liquide s’imprégner.

Scellez ensuite les plaques avec du paraform pour éviter que les spores ne s’échappent des isolats non identifiés. Incuber des plaques inversées à 20 degrés Celsius dans l’obscurité pendant cinq jours pour permettre aux champignons à croissance rapide et lente de former des colonies dans une enceinte de biosécurité. Examinez les plaques de dilution pour les colonies isolées à l’aide d’un seul cure-dent stérile.

Touchez doucement une colonie, puis touchez la gélose du milieu minimal fongique, le milieu minimal fongique ainsi que les plaques de plastique et de glucose minimal afin d’inoculer des billes de gélose sur des films plastiques. Frottez doucement le cure-dent sur la surface du point de gélose, puis passez-le sur le film plastique. Répétez l’inoculation à partir de la même colonie source jusqu’à ce qu’il y en ait quatre.

Reproduisez les stries sur chaque assiette après avoir incubé les plaques à 20 degrés Celsius dans l’obscurité pendant cinq jours. Comparez les plaques pour identifier les isolats qui poussent mieux sur des morceaux de paillis que sur un milieu minimal ne contenant pas de carbone ajouté à part la gélose. Ce sont des dégradateurs de paillis potentiels.

La plaque GMM doit contenir le plus de croissance car il s’agit d’une plaque de contrôle positif dans laquelle le milieu contient du glucose. Les isolats de sol peuvent ne pas être entièrement purs à ce stade, alors utilisez un cure-dent stérile pour gratter l’inoculum du champignon, colonisant le paillis et étalez-le pour l’isolement sur de la gélose au dextrose de pomme de terre, puis scellez la plaque et incubez pendant cinq jours. Après l’incubation de cinq jours, des colonies isolées auront vu le jour.

Confirmer que ces nouvelles colonies purifiées présentent une colonisation du paillis dans l’essai biologique sur plaque similaire à celle observée avec les isolats originaux potentiellement impurs. Une fois que les dégradateurs potentiels du paillis ont été identifiés par l’essai biologique sur plaque, vérifiés à l’aide d’un essai biologique liquide dans cet essai de confirmation final, même la gélose est absente sous le paillis. Les morceaux sont vraiment la seule source de carbone pour la croissance microbienne dans ce milieu rigoureusement préparé pour commencer l’essai à une surface désinfestée, morceau de paillis à un milieu fongique dépourvu de tout autre carbone ajouté pour chaque répétition d’un isolat microbien.

Préparez trois tubes pour l’inoculation. L’un, un tube expérimental avec cinq millilitres de milieu minimal ici étiqueté FMM contenant un morceau de paillis de la taille prédéterminée. Deuxièmement, un contrôle négatif avec cinq millilitres de milieu minimal sans source de carbone.

Et troisièmement, un contrôle positif avec cinq millilitres de liquide contenant du glucose. Ici étiqueté GMM. De plus, préparez une réplique du tube de milieu minimal contenant chaque paillis à tester, mais ne l’inoculez pas.

Ce tube de contrôle révélera toute croissance microbienne résultant d’une contamination après la culture et la collecte de spores fraîches. Selon le protocole de texte, dans une hotte de transfert stérile, inoculez les tubes de culture préalablement préparés avec un million de spores ou de cellules de levure, fermez les bouchons et incubez dans l’obscurité sans secouer à 20 degrés Celsius. Observez la croissance des échantillons chaque semaine.

La croissance mycélienne des champignons sur les morceaux de paillis peut être visible dans la première semaine après l’inoculation, en particulier sur les bords des morceaux de paillis pour la levure planctonique surveiller la croissance par des lectures de densité optique à 600 nanomètres, car les champignons filamenteux sont susceptibles de se fixer directement sur les morceaux de paillis. Évaluer la croissance à l’œil nu et confirmer par microscopie optique et/ou microscopie électronique à balayage dans des contrôles minimaux seulement. Recherchez de minuscules flexibles blancs trop petits pour enregistrer un changement de densité optique.

Utilisation de méthodes spectrophotométriques. Utilisez une pipette à pâte pour aspirer le flex et observez-les à l’aide d’interférences différentielles. Microscopie de contraste après avoir isolé trois isolats potentiellement dégradant le paillis dans l’essai biologique sur plaque à partir d’un paillis cellulosique appelé weed guard plus qui était notre contrôle positif et d’un paillis plastique à base d’amidon appelé Biore.

Ils ont été incubés dans l’essai biologique liquide pendant 68 jours et récoltés avant d’être soumis à la microscopie électronique à balayage. Comme prévu. Des bactéries fongiques ont été observées sur tous les échantillons, à l’exception de XX et YY, où des cellules en forme de bâtonnets ont été observées pour les isolats sur notre paillis de contrôle de la cellulose.

Aucune croissance n’a été observée chez les témoins FMM, seuls les témoins inoculés pour le protège-mauvaises herbes et le paillis des éléments résiduels de trachée des fibres d’origine végétale n’étaient détectables que sous forme de légères marques de piqûre observées en rangées sur certaines des fibres, bien que des hyphes fongiques aient été observées dans les trois échantillons inoculés de notre paillis de contrôle de cellulose. Les éléments de trachée n’étaient clairement visibles que dans les échantillons de SS, ce qui suggère que la digestion de la matière cellulosique a révélé que les éléments de trachée lignifiés sous l’isolat de SS a été provisoirement identifié à l’aide de l’ADN de 18 s ribosomal, en tant que mye de soude dans l’ordre des sodas pour le paillis de plastique à base d’amidon. Isolats : aucune croissance significative n’a été observée dans le milieu minimal, seuls des témoins ont observé des taches blanches uniques visibles lors du tourbillonnement dans les tubes de culture des isolats, VV et ZZ à l’aide de la microscopie à contraste interférentiel différentiel pour l’isolat vv.

Il s’agissait d’une masse de spores, probablement résiduelle de l’inoculation initiale. Pour isolat zz. La masse était composée d’un maillage lâche d’hyphy, d’environ 0,2 millimètre de diamètre, ce qui suggère que l’inoculum de spores d’origine avait germé mais n’avait pas dépassé la masse illustrée ici.

Comme on le voit ici dans les contrôles inoculés de l’ONU pour le paillis de plastique à base d’amidon, une texture bosselée est observée. L’identité des traits blancs est inconnue, mais ils sont absents dans un film colonisé par l’isolat VV montré ici. Les particules blanches et les bosses ont disparu dans un film colonisé par l’isolat zz.

De plus, ce dernier échantillon a montré l’apparition uniforme de fissures sur les isolats de surface du BDM. VV et ZZ ont été provisoirement identifiés à l’aide de l’ADN ribosomique d’au moins comme Penicillium et ACE dans l’ordre de l’hypo respectivement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biodégradation des paillis de plastique pour l’industrie agricole, elle peut également être appliquée à tout autre plastique dont la biodégradation dans l’environnement est en question.

Par exemple, les plastiques qui pourraient se retrouver dans l’environnement marin. Sont-ils utilisés pour l’industrie alimentaire ? Je.