Name: Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Apprenez l'isolation d'îlots pancréatiques chez la souris pour mesurer l'AMPc intracellulaire et évaluer la fonction des cellules β. Cette méthode permet d'étudier la physiologie pancréatique et le diabète.

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Nous tenons à remercier Renée L. Pasker et Harpreet K. Brar pour l&#39;assistance technique d&#39;experts sur les protocoles décrits dans ce travail. En outre, nous tenons à remercier le mentorat de Christopher B. Newgard à l&#39;Université Duke et Alan D. Attie à l&#39;Université de Wisconsin-Madison, avec le soutien des membres de leur laboratoire, qui nous ont permis le temps et le soutien nécessaires pour optimiser la protocoles décrits. En particulier, nous remercions Hans Hohmeier, Danhong Lu, et Helena Winfield dans le laboratoire Newgard et Marie Rabaglia dans le laboratoire Attie pour des discussions et des conseils productifs. Ce travail a été soutenu par le NIH DK080845 de subvention et le diabète juvénile 594 Fondation de la recherche subvention 17-2011-608 (MEK)

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<li>Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).</li>
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<li>Linetsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+islet+isolation+using+a+new+enzyme+blend%2C+liberase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase.</a> Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).</li>
<li>Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).</li>
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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Avec la prévalence du diabète devrait affecter 7,7% de la population mondiale, l&#39;exigence de nouvelles techniques de recherche est impératif à la fois comprendre et traiter le diabète 18. L&#39;isolement des îlots présente est un protocole bien établi utilisés pour l&#39;expérimentation in vitro et a été présenté précédemment, avec de légères modifications 11,14,16. Bien que la sécrétion d&#39;insuline est une application en aval commun pour des îlots isolés, en se concentrant sur les ...

Le maintien strict de euglycémie est impératif de prévenir les pathologies telles que la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie, qui sont toutes des caractéristiques de la pathologie de incontrôlée de type 1 et 2 de diabète 1. Fonction β-cellulaire réduite et la masse à la fois de type 1 et diabète de type 2 perturbent les concentrations de glucose dans le sang 2. Alors que le type auto-immune 1 diabète résulte d&#39;une perte dévastatrice de cellules β productrices d&#39;insuline, troubles de β-cellulaire sécrétion d&#39;insuline et périphérique signalisation de l&#39;insuline dans le diabète de type 2, ainsi que de promouvoir l&#39;hyperglycémie, la dyslipidémie, et augmentation de la production hépatique de glucose, ce qui entraîne par la suite dans à la fois la perte de masse β-cellulaire et de l&#39;insuline sécrétoire capacité de β-cellules individuelles 3. Comprendre les mécanismes sous-jacents β-cellules dans la progression de type 1 et diabète de type 2, nous l&#39;espérons donner lieu à de nouvelles thérapies pour prévenir et traiter ces maladies. Dans ti vitrodes modèles de culture uestion, tels que l&#39;INS-1 et MIN6 immortalisés lignes β-cellulaires, peuvent être des outils utiles pour la compréhension des fonctions spécifiques β-cellules. Cependant, les interactions entre les différents types de cellules au sein de l&#39;îlot peut se réguler la fonction β-cellulaire. Par exemple, l&#39;influence paracrine de glucagon (libérée à partir de cellules-α) et la somatostatine (libéré à partir des cellules-δ) en augmentant et en diminuant la sécrétion d&#39;insuline, respectivement, démontre l&#39;importance de la proximité de la cellule de la cellule dans la réponse endocrinienne 4. En outre, les jonctions communicantes entre les cellules-β potentialisent la libération d&#39;insuline 5. En outre, bien que des progrès ont été réalisés dans la génération de lignées insulinome que mieux reproduits la réponse physiologique des îlots isolés au glucose (par exemple, l&#39;INS-1 dérivé 832/13 et 832/3 lignées cellulaires), leur réactivité de glucose diffère encore de rat normal îlots 6,7. En outre, la réponse de ces lignées cellulaires d&#39;insulinome clonalesde peptide-1 (GLP-1) des agonistes du glucagon-like peuvent différer considérablement les uns des autres, ainsi que de six îlots normaux. Par conséquent, les lignées cellulaires immortalisées peuvent ne pas représenter le meilleur modèle pour les agents de dosage ayant un impact sur la production d&#39;AMPc. Par contraste avec les lignées cellulaires dérivées insulinome, l&#39;étude de la fonction β-cellulaire uniquement dans des modèles animaux entiers offre sa propre série de complications. Un des plus grands défis dans le travail avec le tissu endocrinien est de mesurer la concentration précise de l&#39;hormone libérée. Plus précisément, le foie joue un rôle majeur métaboliser l&#39;insuline, et le flux sanguin du pancréas va directement vers le foie. Ainsi, une mesure de l&#39;insuline dans le plasma peut ne pas représenter avec précision les quantités d&#39;insuline est sécrétée par le pancréas lui-même ou de l&#39;incidence des différents traitements sur le taux de sécrétion de l&#39;insuline 8. En outre, le métabolisme rénal de glucagon peut limiter la fiabilité de la production de glucagon par α-cellules d&#39;îlots 9. Par conséquent, l&#39;isolement d&#39;îlots de souris primaires pour l&#39;expérimentation in vitro fournit une compréhension plus précise de la façon dont l&#39;îlot est de répondre à des stimuli spécifiques pour compléter les mesures effectuées in vivo. Le présent protocole pour l&#39;isolement des îlots de souris est un protocole bien établi utilisé par un certain nombre de groupes (avec de légères modifications qui peuvent aider à accroître la réussite) 10,11. En outre, la détermination de la production d&#39;AMPc permet une lecture directe de la capacité de réponse des cellules incrétine-β. En conjonction avec la mesure de l&#39;AMPc, la teneur en protéines et la sécrétion d&#39;insuline peut également être quantifié à partir de la même préparation de l&#39;échantillon de l&#39;AMPc, aidant à déterminer si un défaut de la fonction β-cellule se trouve proximal ou distal par rapport à l&#39;AMPc 10. La teneur en AMPc finale et l&#39;insuline demande de sécrétion dans ce protocole peut être un outil très puissant pour comprendre l&#39;influence des constituants pharmaceutiques et alimentaires, entre autres,s, sur l&#39;AMPc et la sécrétion d&#39;insuline. En plus de la stimulation de glucose seul, d&#39;autres composés peuvent être utilisés pour mesurer les changements dans l&#39;AMPc et la sécrétion d&#39;insuline 10,11. Enfin, bien que l&#39;insuline est l&#39;hormone principale nous dosage à partir de d&#39;îlots isolés, d&#39;autres hormones, telles que le glucagon et la somatostatine, ainsi que des cytokines, des eicosanoïdes, et l&#39;adénosine monophosphate cyclique, peut également être mesuré, soit par un test de stimulation transitoire ou par quantification de leurs niveaux dans un milieu de culture 12. Enfin, bien que hors de la portée de ce manuscrit, l&#39;isolement d&#39;îlots avec le procédé d&#39;isolement de la collagénase décrit permet une préservation des îlots de sorte que de nombreuses autres applications en aval peuvent être poursuivis, tels que la greffe d&#39;îlots, l&#39;isolement de l&#39;ARN pour le temps réel de PCR quantitative ou microréseau analyses, protéine l&#39;isolement de transfert de Western, îlot plongement et l&#39;imagerie par immunofluorescence, et l&#39;incorporation de [3H]-thymidine en tant que mesure de repli des cellules des îlotscation, dont certains ont été décrits dans les articles de JoVE précédentes 13 à 16. Dans l&#39;ensemble, la suite de la procédure d&#39;isolement des îlots décrite dans le protocole peut fournir un chercheur de l&#39;information importante et utile pour le développement de thérapies et de promouvoir la découverte de médicaments visant à améliorer la fonction β-cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum convient pour l’isolement des îlots actifs</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (poudre)</td><td>Invitrogen (Crédit : Gibco)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 Fil de suture en soie</td><td>Outils de science fine</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince de 0,8 mm&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Outils de science fine</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux courbes</td><td>Outils de science fine</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml ; Bingen Ciseaux à ressort - Droit/Tranchant/8,5 cm/5 mm Tranchant</td><td>Outils de science fine</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Outils de science fine</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok Seringue</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringue BD</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 G Aiguille BD 1/2 » Longueur</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G Aiguille BD 1/2 » Longueur</td><td>Pierre</td> à aiguiser BD <td>305109</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Outils scientifiques fins</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-tribromoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-méthyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate monopotassique (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183 ; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183 ; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur (H.I. FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode pour la souris isolement îlots pancréatiques et ampc intracellulaire détermination

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Glycémie non contrôlée est une caractéristique du diabète sucré et favorise morbidités comme la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie. Avec la prévalence croissante du diabète, à la fois auto-immune de type 1 et lié à l&#39;obésité de type 2, des études visant à délimiter le diabète physiopathologie et les mécanismes thérapeutiques sont d&#39;une importance critique. Les β-cellules d&#39;îlots pancréatiques de Langerhans sont responsables de la sécrétion de l&#39;insuline de façon appropriée en réponse à des concentrations élevées de glucose dans le sang. En plus du glucose et d&#39;autres nutriments, les cellules β sont également stimulés par des hormones spécifiques, appelées incrétines, qui sont sécrétées par l&#39;intestin en réponse à un repas et d&#39;agir sur les récepteurs β-cellulaires qui augmentent la production d&#39;adénosine monophosphate cyclique intracellulaire ( cAMP). Diminution de la fonction β-cellulaire, la masse, et la réactivité de l&#39;incrétine sont bien comprises de contribuer à la physiopathologie du diabète de type 2, et sont de plus en plus liés wile diabète de type 1 e. L&#39;isolement actuel de l&#39;îlot de la souris et de l&#39;AMPc protocole de détermination peut être un outil pour aider à délimiter les mécanismes favorisant la progression de la maladie et des interventions thérapeutiques, en particulier ceux qui sont médiés par les récepteurs de l&#39;incrétine ou récepteurs qui agissent par modulation de la production d&#39;AMPc intracellulaire liée. Bien que seules des mesures d&#39;AMPc vont être décrits, le protocole d&#39;isolement des îlots de Langerhans décrit crée une préparation propre, qui permet également de nombreuses autres applications en aval, y compris le glucose stimulé la sécrétion d&#39;insuline, la [3 H]-thymidine, abondance des protéines, et l&#39;expression de l&#39;ARNm.

Pour assurer un rendement élevé au cours de l&#39;isolement des îlots, des techniques chirurgicales décrites dans le protocole devraient être suivis de près. Bien que les techniques présentées ici seront adaptés à chaque laboratoire, il ya quelques étapes essentielles qui conduiront à un isolement réussi. Afin de rendre le canal cholédoque facilement accessible, il est recommandé que les organes soient déplacés vers le côté droit de la souris (Figure 1). En outre, cela permettra le pancréas à se déploie...

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l&#39;étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des îlots sains afin de mesurer les différences de production de AMP cyclique en réponse à divers traitements expérimentaux. Cela est réalisé en premier lieu par l'insufflation, puis par l'ablation du pancréas lors de la deuxième étape. Les îlots sains sont isolés au moyen d'une série de centrifugations et de lavages.Ensuite, les anfractuosités viables sont transférées dans un milieu de culture d'îlots frais et incubées toute la nuit. Dans la dernière étape, les anfractuosités sont exposées aux traitements expérimentaux souhaités et un dosage de l'AMPc est réalisé. Enfin, un dosage immuno-enzymatique est utilisé pour mesurer les variations de la production d'AMPc en réponse aux différents traitements appliqués aux anfractuosités.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il faut beaucoup de pratique pour parvenir à une insufflation pancréatique complète. Préchargez d'abord une seringue et une canule avec cinq millilitres de solution de collagénase. Fixez une aiguille émoussée de calibre 30 sur la canule et placez la seringue munie de la canule sur de la glace.Après avoir déplacé l'intestin

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Le protocole suivant décrit le processus de dissection pancréatique pour imagerie en coupes virtuelles, et la quantification ultérieure de tous les GFP-taggés cellules bêta dans le pancréas entier.

Dans la quantification in situ des cellules bêta pancréatiques chez des souris de masse

Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d'une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.

Souris îlot de Langerhans isolement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules des îlots pancréatiques souris pour contrôler les inductions de ROS par les xénobiotiques afin d’identifier les potentiels chimiques xénobiotiques diabétogène.

Un îlots pancréatiques Murine Cell-based Screening for diabétogène Environmental Chemicals

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Ici, nous présentons un protocole pour la formation image et la quantification de la dynamique du calcium dans les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules des isfètes pancréatiques. Les reporters fluorescents sont livrés dans la couche périphérique des cellules dans l'înet, qui est alors immobilisé et image, et l'analyse par cellule de la dynamique de l'intensité de fluorescence est effectuée.

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Ce protocole décrit l’isolement de cellules endothéliales de souris à partir de pancréas entier.

Isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris

Cette étude utilise des marqueurs de mort cellulaire et d’apoptose basés sur la fluorescence multicoloration, combinés à la microscopie confocale pour évaluer l’apoptose induite par les cytokines et la mort spécifique des cellules β dans les îlots pancréatiques. Il révèle des changements spatiaux et temporels dans la mort cellulaire et l’apoptose en réponse à des stimuli extracellulaires.

Traitement isolé des îlots pancréatiques et mesure de l’apoptose

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Apprenez l'isolation d'îlots pancréatiques chez la souris pour mesurer l'AMPc intracellulaire et évaluer la fonction des cellules β. Cette méthode permet d'étudier la physiologie pancréatique et le diabète.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

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