Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des îlots sains afin de mesurer les différences de production de AMP cyclique en réponse à divers traitements expérimentaux. Cela est réalisé en premier lieu par l'insufflation, puis par l'ablation du pancréas lors de la deuxième étape. Les îlots sains sont isolés au moyen d'une série de centrifugations et de lavages.

Ensuite, les anfractuosités viables sont transférées dans un milieu de culture d'îlots frais et incubées toute la nuit. Dans la dernière étape, les anfractuosités sont exposées aux traitements expérimentaux souhaités et un dosage de l'AMPc est réalisé. Enfin, un dosage immuno-enzymatique est utilisé pour mesurer les variations de la production d'AMPc en réponse aux différents traitements appliqués aux anfractuosités.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il faut beaucoup de pratique pour parvenir à une insufflation pancréatique complète. Préchargez d'abord une seringue et une canule avec cinq millilitres de solution de collagénase. Fixez une aiguille émoussée de calibre 30 sur la canule et placez la seringue munie de la canule sur de la glace.

Après avoir déplacé l'intestin grêle vers le côté droit de la souris, repérez le sphincter d'Od, situé à l'extrémité du canal cholédoque et s'évasant sur l'intestin grêle, formant un triangle blanc. Une fois le sphincter localisé, prenez une paire de pinces Dumont n°5 et glissez-en la pointe sous le canal cholédoque aussi près que possible de l'intestin grêle, en prenant soin de ne pas percer le canal.

Après avoir percé l'intestin grêle et les tissus conjonctifs, utilisez la pointe de la pince Dumont pour saisir le fil de suture et le tirer sous le canal cholédoque. Ligaturez le canal cholédoque aussi près que possible du sphincter d'Oddi, en veillant à ce que le nœud soit bien serré afin d'éviter toute fuite. Ensuite, saisissez les deux extrémités du fil de suture et tirez-les vers la queue pour exercer une certaine tension sur le canal cholédoque.

Ensuite, à l’aide d’une main libre, effectuez une petite incision avec une paire de ciseaux microchirurgicaux dans le canal cholédoque juste au-dessus de la dernière bifurcation vers le foie, en maintenant les deux extrémités du fil de sorte que le canal cholédoque soit tendu. Retirez la seringue et la canule du seau à glace. Posez la seringue et insérez l’aiguille obturée préparée de calibre 30 dans l’incision.

Canal cholédoque. Veiller à ne pas percer la paroi du canal. Obtenir un gonflage complet du pancréas est la partie la plus délicate.

Nous utilisons une aiguille qui assure un bon scellement. Si la première aiguille ne fournit pas un bon scellement, utilisez-en une plus grande, comme une aiguille de calibre 27. Appuyez maintenant lentement sur le piston de la seringue en relâchant la pression de manière pulsatile jusqu'à ce que la première partie du pancréas se gonfle.

Suivez cette étape en maintenant une pression douce et constante jusqu'à ce que le pancréas cesse de gonfler. Un gonflage réussi se traduira par une répartition uniforme du tissu exocrine, et la partie du pancréas située au-dessus de l'estomac sera gonflée. Pour retirer le pancréas, utilisez une paire de forceps dans une main pour saisir l'intestin grêle au niveau du sphincter d'od.

Avec l'autre main, insérez l'extrémité fermée d'une paire de ciseaux courbés pour détacher une partie du pancréas de l'intestin grêle. Déplacez la pointe le long de l'intestin grêle jusqu'au tissu conjonctif rose. Saisissez ensuite l'intestin grêle près de son point d'attache à l'estomac et sectionnez le pancréas du reste de l'intestin grêle.

Saisir autant que possible du pancréas et le soulever délicatement. À l’aide des ciseaux courbes, sectionner les connexions restantes entre le pancréas et la cavité thoracique.

Pour retirer complètement le pancréas, placer chaque pancréas prélevé dans environ 2,5 millilitres de solution de collagénase. Utiliser un tube conique individuel de 50 millilitres sur de la glace pour laver les pancréas. Transférer d'abord chaque pancréas dans un nouveau tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de collagénase.

Ensuite, placer le pancréas dans des tubes coniques de 50 millilitres, en position verticale, dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius, capable d'osciller entre 220 et 250 tr/min, avec l'agitation désactivée. Gazéifiez maintenant chaque tube conique de 50 millilitres avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes.

Avec une pipette Pasteur, refermer hermétiquement chaque tube et les placer horizontalement dans le bain d'agitation sous la surface de l'eau. À partir de la sixième minute, agiter les tubes à 220 à 250 tr/min pendant 20 secondes toutes les deux minutes, jusqu'à 16 minutes. Après l'agitation, faire tourner les tubes à 400 à 500 G à température ambiante, puis éteindre immédiatement la centrifugeuse dès qu'elle a atteint sa vitesse maximale.

Ensuite, sans perturber le culot, utilisez un piège sous vide pour aspirer environ 22,5 millilitres de la solution de collagénase de chaque tube. Resuspendez ensuite les culots dans 12,5 millilitres de HBSS et vortexez doucement les tubes pour disperser les culots. Après avoir lavé les cellules et vortexé avec du HBSS supplémentaire, versez chaque suspension cellulaire à travers un tamis de 1000 microns dans des tubes coniques individuels neufs de 50 millilitres.

Ensuite, après avoir à nouveau centrifugé les suspensions cellulaires, utilisez un piège à vide pour aspirer soigneusement tout le HBSS sans perturber le culot. Une fois tout le HBSS éliminé, ajoutez 4,8 millilitres de solution de 25 %F par tube. Après avoir vortexé pour disperser le culot, distribuez soigneusement 2,4 millilitres de solution de 23 %20,5 % et de 11 %fial le long de la paroi du tube en faisant pivoter le tube conique de 50 millilitres.

Pour garantir un dépôt uniforme après la centrifugation de la solution d'appel FI, versez toute la solution d'appel FI dans un nouveau tube conique de 50 millilitres, en prenant soin de laisser le culot de tissu exocrine dans l'ancien tube. Ajoutez du HBSS glacé dans le nouveau tube jusqu'au trait de 50 millilitres. Ensuite, fermez le tube et retournez-le quatre à six fois.

Pour mélanger l'appel FI et le HBSS ensemble. Utiliser le piège à vide pour aspirer soigneusement la majeure partie du mélange de flacon de HBSS sans perturber le culot lâche. Puis transférer le culot dans un nouveau tube.

Utilisez une pipette Pasteur pour transférer les œillets dans une boîte de Pétri contenant le milieu de culture d'œillets, en prenant soin d'éviter le transfert de débris de tissu végétal ASIN. Placez la boîte de Pétri sur un microscope stéréoscopique équipé d'un éclairage rétroéclairé.

Les œillets sains auront une forme sphérique et un centre allant du brun doré au brun foncé. Tous les œillets reliés à l'ASIN ou à un tissu, qui apparaîtront ternes et grisâtres, ne doivent pas être utilisés et doivent être jetés. En outre, les œillets plus gros qui développent un centre nécrotique sombre après une incubation nocturne doivent être écartés, car ils ne fonctionnent pas correctement.

Si la préparation des œillets contient une grande quantité de débris, sélectionnez manuellement les œillets deux fois dans du milieu frais et ajoutez de l'ADN au tampon de digestion pour aider à limiter l'agglomération des œillets. Commencez cette étape en faisant tourbillonner les œillets vers le centre de la boîte de Pétri. À l’aide d’une pipette P20, transférez les œillets vers une nouvelle boîte de Pétri en polystyrène de 15 millimètres par 60 millimètres contenant cinq millilitres de la solution de pré-incubation afin de rincer le milieu de culture contenant du glucose des œillets.

Ensuite, utilisez la pipette P 20 pour transférer au moins 13 anneaux dans des tubes microfuge individuels contenant un millilitre de solution tampon de Krebs-Ringer bicarbonate fraîchement saturée en gaz, en veillant à maintenir une taille uniforme des anneaux entre les tubes. Après une incubation des échantillons à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant 45 minutes, vortexez rapidement puis centrifugez les tubes dans une centrifugeuse de table à température ambiante, à une vitesse allant jusqu’à 7 000 à 7 500 G. Si l’insuline ou un autre métabolite est destiné à une application en aval, utilisez une pipette P 1000 pour prélever un aliquot de milieu dans un tube microfuge. Si le milieu de stimulation n’est pas récupéré, il peut être jeté.

Utilisez une pipette P 1000 pour retirer la majeure partie du Krebs de chaque tube microfuge, en laissant environ 10 à 15 microlitres de Krebs sur le culot de l’embout. Ensuite, utilisez une pipette P 20 pour prélever la portion la plus proche du culot. Enfin, lorsque moins de 10 à 15 microlitres de Krebs restent sur l’embout, congélez rapidement les pastilles d’embout dans l’azote liquide.

Ensuite, conserver les pastilles congelées rapidement à moins 80 degrés Celsius jusqu'à la mesure de l'AMP cyclique. Généralement, l'effet d'un agent sur la production d'AMP cyclique est directement corrélé à son effet sur la sécrétion d'insuline. Dans cette expérience, des ilots isolés provenant de souris de type sauvage ou de souris avec invalidation génique ont été stimulés par du glucose à 11,1 millimolaire et par l'AMP cyclique intracellulaire.

La production de AMPc a été mesurée et normalisée par rapport à la protéine cellulaire totale. L'insuline sécrétée a été mesurée à l'aide d'un test ELISA standard pour l'insuline, puis également normalisée par rapport à la protéine cellulaire totale. Comme prévu, la variation de la production d'AMPc était directement corrélée à l'augmentation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'isoler, de cultiver et de mesurer les niveaux de a et de p cycliques dans des yeux de souris saines.