Introduction au spectrophotomètre
Le spectrophotomètre est un instrument utilisé systématiquement en recherche scientifique. La spectrophotométrie est la mesure quantitative de lumière…
Le spectrophotomètre est un instrument utilisé de façon ubiquitaire dans la recherche biologique, chimique, clinique et environnementale.
La spectrophotométrie est la mesure de la quantite de lumière qu’une substance chimique peut absorber, en faisant passer un faisceau de lumière à travers un échantillon dans un spectrophotomètre.
En mesurant l’intensité de lumière détectée, cette méthode peut être utilisée pour déterminer la concentration de soluté dans l’échantillon.
Le faisceau de lumière qui est envoyé vers l’échantillon est fait d’un faisceau de photons.
Lorsque les photons rencontrent les molécules dans l’échantillon, les molécules peuvent absorber certains d’entre eux, réduisant le nombre de photons dans le faisceau de lumière et diminuant l’intensité du signal détecté.
La transmission est la portion de lumière qui passe à travers l’échantillon. Elle est définie comme l’intensité de lumière passant à travers l’échantillon sur l’intensité de lumière incidente.
L’absorbance est l’opposé du logarithme de la transmission et correspond à la quantité que le spectrophotomètre va mesurer.
A partir de l’absorbance, la concentration dans l’échantillon de solution peut être déterminée à partir de la loi de Beer-Lambert, qui stipule qu’il y a une relation linéaire entre l’absorbance et la concentration de l’échantillon. Selon la loi de Beer-Lambert, l’absorbance est le produit du coefficient d’absorption, une mesure de la quantité de lumière absorbée par un soluté à une longueur d’onde donnée, avec la distance que la lumière parcourt à travers l’échantillon, ou distance parcourue, et la concentration du soluté. Souvent, l’objectif en mesurant l’absorbance est de mesurer la concentration de l’échantillon.
Chaque spectrophotomètre contient une source de lumière, un collimateur (une lentille ou un dispositif de focalisation qui transmet un faisceau de lumière intense et droit), un monochromateur pour séparer le faisceau de lumière en ses différentes longueurs d’ondes, et un sélecteur de longueur d’onde, ou fente, pour la sélection de la longueur d’onde désirée. Les longueurs d’ondes de lumière utilisées dans les spectrophotomètres presentés dans cette vidéo sont dans la gamme de l’ultraviolet et du visible. Le spectrophotomètre contient aussi un porte-échantillon, un détecteur photoélectrique et un écran pour afficher le résultat du détecteur.
Les spectrophotomètres récents sont directement couplés à un ordinateur, où les paramètres d’expérimentation peuvent être contrôlés et les résultats sont affichés.
Lors de la réalisation d’une spectrophotométrie, assurez-vous de prendre les précautions appropriées, comme le port de gants, selon le type de solutions biologique ou chimique avec lesquelles vous travaillez.
Avant de mesurer le spectre UV-visible de l’échantillon, allumez l’appareil et laissez les lampes et composants électroniques chauffer.
Préparez un échantillon vierge de la même solution, ayant le même pH et une force ionique similaire, mais sans le composant analysé; l’analyse de cet échantillon est une étape nécessaire vu que la cuvette et le solvant peuvent disperser la lumière.
Les porte-échantillons de spectrophotomètre traditionnel sont conçus pour accueillir des cuvettes en plastique et en quartz. Pipetez la solution vierge dans la cuvette.
Après avoir essuyé toute empreinte de doigts et éclaboussures sur l’extérieur de la cuvette, insérez correctement la cuvette dans le porte-échantillon et fermez la porte du compartiment à cuvettes.
N’oubliez jamais de fermer la porte, car la radiation UV émise depuis un spectrophotomètre ouvert peut endommager les yeux et la peau.
Programmez la longueur d’onde désirée ou la gamme de longueurs d’onde qui sera transmise à l’échantillon. Celle-ci va dépendre de la longueur d’onde optimale que le composant analysé peut absorber. Ensuite, mettez la machine à zéro en prenant une mesure de l’échantillon vierge, ce qui permettra de soustraire l’absorbance de fond due au tampon de l’échantillon.
En fonction du type d’expérience spectrophotométrique que vous réalisez, il peut être nécessaire de générer une courbe standard avant la mesure des échantillons, à partir de laquelle la concentration du composé analysé dans vos échantillons pourra finalement être déterminée.
Laissez l’échantillon atteindre la température appropriée et mélangez le doucement, de manière à ne pas introduire de bulles. L’échantillon peut alors être ajouté directement à la cuvette, à l’intérieur de la machine, et une lecture peut etre réalisée.
Après la réalisation de la mesure d’absorbance sur l’échantillon, procédez au calcul approprié pour votre expérience ; par exemple la détermination de la concentration ou du taux d’activité enzymatique.
Le spectrophotomètre est utilisé quotidiennement dans beaucoup de laboratoires de recherche biologique.
Une des utilisations habituelles du spectrophotomètre est la mesure de la densité de cellules. La mesure de densité de cellules est utile pour générer des courbes de croissance logarithmique pour les bactéries, à partir desquelles le temps optimal pour l’intégration de protéines recombinantes peut être déterminé.
Le spectrophotomètre peut aussi être utilisé pour mesurer les taux de réaction chimique. Dans cet exemple, l’absorbance est utilisée pour surveiller une réaction enzymatique, par la disparition d’une réaction intermédiaire à 452 nm au cours du temps. Le taux de cette étape enzymatique peut être calculé en assortissant les données à l’équation appropriée.
Récemment, l’introduction de spectrophotomètres pour micro-volume a éliminé le besoin de porte-échantillons. Ces spectrophotomètres utilisent la tension de surface pour tenir l’échantillon.
Les spectrophotomètres pour micro-volume sont optimaux pour mesurer la qualité et la concentration de couteux échantillons de petit volume, tels que les biomolécules, incluant les protéines et acides nucléiques.
L’absorbance d’une protéine à 280 nm dépend du contenu en chaînes latérales aromatiques trouvées dans le tryptophane, la tyrosine, et la phénylalanine, ainsi que l’existence de ponts disulfure entre deux cystéines.
La concentration d’une protéine peut être déterminée à partir de son absorbance à 280 nm et de son coefficient d’absorption, qui est basé sur la composition de l’acide aminé.
L’ADN et l’ARN ont une absorbance maximale à 260 nm, à partir de laquelle leur concentration peut être déterminée. La pureté de l’acide nucléique peut aussi être évaluée à partir du ratio des lectures d’absorbance à des longueurs d’onde spécifiques.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE au spectrophotomètre. Dans cette vidéo nous avons vu quelques principes de base, incluant les concepts de la spectrophotométrie et les composants d’un spectrophotomètre. Nous avons aussi montré le fonctionnement étape par étape du spectrophotomètre, et discuté de ses utilisations en recherche biologique.
Merci de nous avoir regardé!
Le spectrophotomètre est un instrument utilisé de façon ubiquitaire dans la recherche biologique, chimique, clinique et environnementale.
La spectrophotométrie est la mesure de la quantite de lumière qu’une substance chimique peut absorber, en faisant passer un faisceau de lumière à travers un échantillon dans un spectrophotomètre.
En mesurant l’intensité de lumière détectée, cette méthode peut être utilisée pour déterminer la concentration de soluté dans l’échantillon.
Le faisceau de lumière qui est envoyé vers l’échantillon est fait d’un faisceau de photons.
Lorsque les photons rencontrent les molécules dans l’échantillon, les molécules peuvent absorber certains d’entre eux, réduisant le nombre de photons dans le faisceau de lumière et diminuant l’intensité du signal détecté.
La transmission est la portion de lumière qui passe à travers l’échantillon. Elle est définie comme l’intensité de lumière passant à travers l’échantillon sur l’intensité de lumière incidente.
L’absorbance est l’opposé du logarithme de la transmission et correspond à la quantité que le spectrophotomètre va mesurer.
A partir de l’absorbance, la concentration dans l’échantillon de solution peut être déterminée à partir de la loi de Beer-Lambert, qui stipule qu’il y a une relation linéaire entre l’absorbance et la concentration de l’échantillon. Selon la loi de Beer-Lambert, l’absorbance est le produit du coefficient d’absorption, une mesure de la quantité de lumière absorbée par un soluté à une longueur d’onde donnée, avec la distance que la lumière parcourt à travers l’échantillon, ou distance parcourue, et la concentration du soluté. Souvent, l’objectif en mesurant l’absorbance est de mesurer la concentration de l’échantillon.
Chaque spectrophotomètre contient une source de lumière, un collimateur (une lentille ou un dispositif de focalisation qui transmet un faisceau de lumière intense et droit), un monochromateur pour séparer le faisceau de lumière en ses différentes longueurs d’ondes, et un sélecteur de longueur d’onde, ou fente, pour la sélection de la longueur d’onde désirée. Les longueurs d’ondes de lumière utilisées dans les spectrophotomètres presentés dans cette vidéo sont dans la gamme de l’ultraviolet et du visible. Le spectrophotomètre contient aussi un porte-échantillon, un détecteur photoélectrique et un écran pour afficher le résultat du détecteur.
Les spectrophotomètres récents sont directement couplés à un ordinateur, où les paramètres d’expérimentation peuvent être contrôlés et les résultats sont affichés.
Lors de la réalisation d’une spectrophotométrie, assurez-vous de prendre les précautions appropriées, comme le port de gants, selon le type de solutions biologique ou chimique avec lesquelles vous travaillez.
Avant de mesurer le spectre UV-visible de l’échantillon, allumez l’appareil et laissez les lampes et composants électroniques chauffer.
Préparez un échantillon vierge de la même solution, ayant le même pH et une force ionique similaire, mais sans le composant analysé; l’analyse de cet échantillon est une étape nécessaire vu que la cuvette et le solvant peuvent disperser la lumière.
Les porte-échantillons de spectrophotomètre traditionnel sont conçus pour accueillir des cuvettes en plastique et en quartz. Pipetez la solution vierge dans la cuvette.
Après avoir essuyé toute empreinte de doigts et éclaboussures sur l’extérieur de la cuvette, insérez correctement la cuvette dans le porte-échantillon et fermez la porte du compartiment à cuvettes.
N’oubliez jamais de fermer la porte, car la radiation UV émise depuis un spectrophotomètre ouvert peut endommager les yeux et la peau.
Programmez la longueur d’onde désirée ou la gamme de longueurs d’onde qui sera transmise à l’échantillon. Celle-ci va dépendre de la longueur d’onde optimale que le composant analysé peut absorber. Ensuite, mettez la machine à zéro en prenant une mesure de l’échantillon vierge, ce qui permettra de soustraire l’absorbance de fond due au tampon de l’échantillon.
En fonction du type d’expérience spectrophotométrique que vous réalisez, il peut être nécessaire de générer une courbe standard avant la mesure des échantillons, à partir de laquelle la concentration du composé analysé dans vos échantillons pourra finalement être déterminée.
Laissez l’échantillon atteindre la température appropriée et mélangez le doucement, de manière à ne pas introduire de bulles. L’échantillon peut alors être ajouté directement à la cuvette, à l’intérieur de la machine, et une lecture peut etre réalisée.
Après la réalisation de la mesure d’absorbance sur l’échantillon, procédez au calcul approprié pour votre expérience ; par exemple la détermination de la concentration ou du taux d’activité enzymatique.
Le spectrophotomètre est utilisé quotidiennement dans beaucoup de laboratoires de recherche biologique.
Une des utilisations habituelles du spectrophotomètre est la mesure de la densité de cellules. La mesure de densité de cellules est utile pour générer des courbes de croissance logarithmique pour les bactéries, à partir desquelles le temps optimal pour l’intégration de protéines recombinantes peut être déterminé.
Le spectrophotomètre peut aussi être utilisé pour mesurer les taux de réaction chimique. Dans cet exemple, l’absorbance est utilisée pour surveiller une réaction enzymatique, par la disparition d’une réaction intermédiaire à 452 nm au cours du temps. Le taux de cette étape enzymatique peut être calculé en assortissant les données à l’équation appropriée.
Récemment, l’introduction de spectrophotomètres pour micro-volume a éliminé le besoin de porte-échantillons. Ces spectrophotomètres utilisent la tension de surface pour tenir l’échantillon.
Les spectrophotomètres pour micro-volume sont optimaux pour mesurer la qualité et la concentration de couteux échantillons de petit volume, tels que les biomolécules, incluant les protéines et acides nucléiques.
L’absorbance d’une protéine à 280 nm dépend du contenu en chaînes latérales aromatiques trouvées dans le tryptophane, la tyrosine, et la phénylalanine, ainsi que l’existence de ponts disulfure entre deux cystéines.
La concentration d’une protéine peut être déterminée à partir de son absorbance à 280 nm et de son coefficient d’absorption, qui est basé sur la composition de l’acide aminé.
L’ADN et l’ARN ont une absorbance maximale à 260 nm, à partir de laquelle leur concentration peut être déterminée. La pureté de l’acide nucléique peut aussi être évaluée à partir du ratio des lectures d’absorbance à des longueurs d’onde spécifiques.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE au spectrophotomètre. Dans cette vidéo nous avons vu quelques principes de base, incluant les concepts de la spectrophotométrie et les composants d’un spectrophotomètre. Nous avons aussi montré le fonctionnement étape par étape du spectrophotomètre, et discuté de ses utilisations en recherche biologique.
Merci de nous avoir regardé!
Q1: How does a spectrophotometer measure the concentration of a solute in a solution?
A spectrophotometer measures concentration by quantifying how much light a sample absorbs. When a beam of light passes through the sample, molecules absorb photons, reducing light intensity. The instrument measures absorbance, which relates directly to solute concentration through the Beer-Lambert Law. This linear relationship between absorbance and concentration allows researchers to determine unknown concentrations from measured absorbance values.
Q2: What is the difference between transmittance and absorbance in spectrophotometry?
Transmittance is the fraction of light that passes through a sample, calculated as the intensity of transmitted light divided by incident light intensity. Absorbance is the inverse logarithm of transmittance and represents how much light the sample absorbs. Spectrophotometers directly measure absorbance, which is the more useful parameter for determining solute concentration using the Beer-Lambert Law.
Q3: What are the main components of a spectrophotometer and what does each do?
A spectrophotometer contains a light source, collimator that focuses light into a straight beam, monochromator that separates light into component wavelengths, and a wavelength selector or slit for choosing the desired wavelength. It also includes a sample holder for cuvettes, a photoelectric detector that measures absorbed photons, and a display screen. Newer models connect directly to computers for experiment control and data display.
Q4: Why is it important to prepare a blank solution before measuring a sample?
A blank solution contains the same solvent and buffer as the sample but without the analyte. The cell and solvent can scatter light, creating background absorbance. By zeroing the instrument with the blank, this background is subtracted from your sample measurement, ensuring accurate absorbance readings. The blank must have the same pH and similar ionic strength as your sample for proper calibration.
Q5: How can spectrophotometry be used to monitor enzyme activity in real time?
Spectrophotometry monitors enzyme activity by tracking changes in absorbance over time. For example, if an enzymatic reaction produces or consumes a compound with a specific absorbance maximum, researchers can measure absorbance at that wavelength repeatedly. The rate of absorbance change reflects the reaction rate, allowing calculation of enzyme kinetics. This method is particularly useful for monitoring disappearance of reaction intermediates at specific wavelengths like 452 nanometers.
Q6: What are the advantages of microvolume spectrophotometers for measuring biomolecules?
Microvolume spectrophotometers use surface tension to hold samples, eliminating the need for traditional cuvette holders. They are optimal for measuring expensive, limited-volume samples such as proteins and nucleic acids. These instruments can determine protein concentration from absorbance at 280 nanometers based on aromatic amino acid content, and assess nucleic acid concentration and purity from absorbance readings at 260 nanometers.
Q7: What precautions should be taken when operating a spectrophotometer?
Always wear appropriate gloves when handling biological or chemical solutions. Allow the instrument to warm up before use. Never leave the cuvette compartment door open, as UV radiation can damage eyes and skin. Before inserting the cuvette, wipe away fingerprints and spills from the outside. Allow samples to reach the appropriate temperature and mix gently to avoid introducing bubbles that could affect measurements.