Analyse quantitative multispectrale Après transplantation de tissu fluorescent pour la visualisation des origines cellulaires, types et Interactions

L’objectif de la procédure suivante est d’utiliser l’interrogation multispectrale de compositions cellulaires multiplex ou l’imitation pour déterminer les contributions de diverses populations résidentes de la moelle osseuse au développement du stroma tumoral. Ceci est accompli en transplantant d’abord une souris receveuse transgénique marquée GFP avec des cellules souches de moelle osseuse exprimant RFP. Dans la deuxième étape, les cellules tumorales d’intérêt sont injectées dans le même receveur, puis après la greffe, la tumeur excise est sectionnée, noyée dans de la paraffine et marquée avec des anticorps immunofluorescents.

Ensuite, une bibliothèque spectrale de toutes les longueurs d’onde utilisées pour l’acquisition d’images des sections tumorales est créée une fois la bibliothèque spectrale terminée. Les lames sont imagées dans la dernière étape, l’analyse des données est effectuée pour permettre l’identification et l’association des motifs de coloration des marqueurs cellulaires d’intérêt. En fin de compte, de nouvelles entités cellulaires ou phénotypes peuvent être identifiés sur la base du marquage multiplex de marqueurs extracellulaires et cellulaires afin de mieux comprendre la composition de tissus complexes tels que le microenvironnement tumoral.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques d’immunofluorescence standard est que l’analyse multispectrale vous permet de multiplexer sept fluoro quatre ou plus sur la même lame, ce qui permet une interrogation beaucoup plus précise et détaillée de la composition cellulaire du microenvironnement tumoral ou d’un tissu régénératif. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’origine et de la composition du microenvironnement tumoral, elle peut être appliquée à d’autres systèmes tels que la médecine régénérative, la biologie du développement et la biologie immunitaire. La démonstration de cette procédure avec le Dr Spa est Chris Booth, un assistant de recherche dans mon laboratoire. En raison de la restriction IU Cook dans cette institution, nous discuterons mais ne montrerons aucune manipulation directe de souris sur des souris.

Ces procédures de moelle osseuse et nos techniques de greffe de tumeur peuvent être trouvées dans nos travaux antérieurs, tels que les cellules souches de chevreau et d’autres. 2009 pour commencer après avoir isolé les cellules de la moelle osseuse des membres postérieurs en miroir, resus suspendre les cellules à 2 millions de cellules par 100 microlitres de PBS par souris. Utilisez une lampe chauffante pour dilater les vaisseaux d’une souris GFP réceptrice irradiée et placez la souris dans une contrainte d’injection de veine de queue.

À l’aide d’une aiguille de calibre 29, côté biseauté vers le haut, injectez systématiquement les suspensions cellulaires dans la queue ou la veine rétroorbitaire. Utilisez de la gaze stérile pour appliquer une légère pression sur la queue après l’injection. Injectez une souris avec 100 microlitres de PBS uniquement comme contrôle de la greffe le jour de l’injection.

Mettre en suspension les cellules tumorales d’intérêt dans le PBS à 1 million de cellules par 100 microlitres. Après avoir stérilisé l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez une main pour retenir la souris par la peau du cou et de la queue, puis de l’autre main, tenez l’aiguille côté biseau vers le haut et injectez les cellules tumorales dans la cavité interpéritonéale de la souris receveuse.

Après 15 à 30 jours, euthanasiez les souris et excisez la tumeur de son abdomen. Ensuite, fixez les tumeurs avec de la formine à 10 % pendant 24 heures. Ensuite, sectionnez le tissu fixé en tranches de cinq à 10 micromètres pour les procédures de coloration ultérieures.

Après avoir fixé les sections de tissu dans de la paraffine, faites cuire les échantillons pendant une heure à 56 degrés Celsius. Lavez ensuite les lames selon l’ordre suivant Après le dernier lavage à l’éthanol, rincez les lames à l’eau pendant deux minutes. Immerger lentement et soulever le support de coloration dans et hors de l’eau 10 fois.

Ensuite, placez le tampon de citrate de sodium au micro-ondes pour le chauffer. Après avoir fait bouillir les lames pendant 20 minutes dans un tampon de citrate de sodium, laissez refroidir les échantillons dans le tampon pendant 30 minutes. Ensuite, lavez-vous à l’eau ionisée pendant encore cinq minutes.

Ensuite, tapotez la diapositive pour laisser couler les grosses gouttes d’eau, veillez à ne pas dessécher la section du tissu. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour marquer les sections autour des sections tumorales, puis placez immédiatement un tampon de blocage sur l’échantillon pour empêcher la section de tissu de se dessécher. Au bout d’une heure, incubez les lames avec l’anticorps principal d’intérêt dans une boîte de chambre d’humidité sur un agitateur à rotation lente à quatre degrés pendant la nuit.

Le lendemain matin, lavez les lames deux fois dans PBST pendant 10 minutes à chaque fois en secouant doucement pendant que les sections sont lavées. Diluez les anticorps secondaires à un rapport de 1 à 1000 entre les anticorps et le tampon de blocage. Ensuite, incubez les sections dans les anticorps secondaires appropriés dans la boîte de la chambre d’humidité recouverte d’une feuille d’aluminium sur un agitateur à rotation lente à température ambiante après deux heures.

Lavez les lames deux fois dans PBST pendant cinq minutes en les secouant doucement et à l’abri de la lumière. Ensuite, colorez la lame dappy uniquement et les lames d’analyse avec DPI pendant une minute, en gardant les lames couvertes pendant l’incubation. En plaçant une lamelle sur chaque échantillon, scellez les bords de chaque lamelle avec un durcisseur d’ongles.

Maintenant, pour effectuer l’imagerie multispectrale, utilisez un objectif à huile pour prendre une première image de la lame d’analyse afin d’obtenir les temps d’exposition appropriés pour chacune des gammes spectrales de la bibliothèque spectrale. Par exemple, ce tableau présente des protocoles de bibliothèque spectrale suggérés en fonction du nombre de quatre étages utilisés dans l’expérience. Ensuite, imagez la lame non colorée pour la lame d’arrière-plan dans la bibliothèque spectrale de cette expérience.

Image suivante, la diapositive non colorée pour obtenir l’image d’arrière-plan de la bibliothèque spectrale. Maintenant, imagez chaque lame de contrôle à quatre étages colorés, en enregistrant les images sous le nom de l’anticorps secondaire utilisé pour chaque lame. Une fois la bibliothèque suspectable terminée, collectez des images des régions d’intérêt sur la lame d’analyse pour analyser les images des tissus tumoraux.

Tout d’abord, importez un assortiment représentatif des images de nuances acquises à l’aide du logiciel inform. Ouvrez ensuite la bibliothèque spectrale sécurisée comme indiqué par le programme. Ensuite, identifiez les régions tissulaires d’intérêt à analyser.

Identifiez les cellules individuelles sur la base de la coloration DAPI. Le cytoplasme sera identifié automatiquement en fonction de la forme du noyau. Choisissez maintenant la lecture de l’intensité fluorescente de votre choix pour chaque paramètre fluorescent, puis faites correspondre les images acquises, en laissant le logiciel traiter les données à l’aide de l’algorithme proposé.

Une fois le traitement de l’image terminé, fusionnez les fichiers résultants. Ensuite, en utilisant cette technique d’imagerie multispectrale pour analyser et représenter graphiquement les tumeurs dans ce modèle de souris transgénique de greffe de moelle osseuse, les composants tumoraux stromaux d’origine de la moelle osseuse ont été discernés par cytométrie en flux trois semaines après la greffe de moelle osseuse. Puis, six semaines après l’injection initiale, des coupes de tumeurs ovariennes injectées non marquées ont été analysées après la création d’une bibliothèque spectrale avec des lames de contrôle monochromes, des images de la section de la tumeur ovarienne colorée avec GFP DPI et deux autres marqueurs ont été analysés.

L’ajout de marqueurs supplémentaires est possible. Par exemple, ici, la bibliothèque spectrale et l’image qui l’accompagne d’une section de tumeur avec six marqueurs plus une coloration nucléaire sont montrées à l’aide du logiciel informé. Les régions tissulaires d’intérêt dans la coupe de la tumeur sont classifiables comme le montrent les images représentatives présentées ici.

Par exemple, cette image montre la classification des segments de tissu suivie de la segmentation des cellules. Basé sur la coloration nucléaire dpi. La quantification des marqueurs fluorescents peut ensuite être mesurée dans le noyau et le cytoplasme de chaque cellule et exportée pour une analyse plus approfondie.

L’algorithme de segmentation tissulaire est capable d’identifier davantage les sous-types de tissus en fonction de l’architecture tissulaire et pas seulement de l’identification des fluorochromes, fournissant ainsi un outil analytique plus robuste pour classer la coloration en régions tissulaires distinctes. Dans cette image, l’ordinateur a été entraîné à identifier cinq sous-régions en fonction des motifs architecturaux du tissu. L’arrière-plan est défini par un espace vide.

La tumeur hémolytique est définie par l’abondance de globules rouges dans le tissu. La tumeur est définie par les cellules densément peuplées. La graisse est définie par les grands compartiments cellulaires vides symétriques et les muscles définis par un motif strié.

En utilisant cette méthode, une population cellulaire double positive peut être analysée sur la base d’un seuil d’intensité fluorescente déterminé. Par exemple, pour les cellules positives à la GFP et les cellules alpha positives à l’actine musculaire lisse, comme illustré ici pour une détection spectrale supplémentaire au-delà de quatre couleurs, veuillez consulter les documents de conseils et astuces liés pour multiplexer cinq sondes ou plus. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité des images dépend fortement des diapositives de contrôle couleur uniques appropriées utilisées.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’hybridation in situ par fluorescence peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les compartiments cellulaires et les tissus du microenvironnement tumoral. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de notre technique d’imitation, l’interrogation multispectrale des composants multicellulaires, et en complétant cela, vous devriez avoir une compréhension approfondie de la façon d’identifier plusieurs cibles cellulaires sur une seule diapositive. Comment compter Unix ces cibles cellulaires et avoir une bonne compréhension de l’évolution du stroma tumoral ou du tissu régénératif, ou de votre tissu d’intérêt.