Analyse quantitative multispectrale Après transplantation de tissu fluorescent pour la visualisation des origines cellulaires, types et Interactions

L'objectif de la procédure suivante est d'utiliser une interrogation multispectrale de compositions cellulaires multiplexées ou de modèles afin de déterminer la contribution des différentes populations résidentes de la moelle osseuse au développement du stroma tumoral. Cela est réalisé en transplantant d'abord une souris réceptrice transgénique marquée par la GFP avec des cellules souches de moelle osseuse exprimant la RFP. Dans une deuxième étape, les cellules tumorales d'intérêt sont injectées dans le même récipient, puis, après prise en charge, la tumeur excisée est découpée en sections, incluse dans la paraffine et marquée par des anticorps immunofluorescents.

Ensuite, une bibliothèque spectrale de toutes les longueurs d'onde utilisées pour acquérir les images des sections tumorales est créée une fois que la bibliothèque spectrale est complète. Les lames sont ensuite imagées lors de la dernière étape, et une analyse des données est effectuée afin de permettre l'identification et l'association des profils de marquage des marqueurs cellulaires d'intérêt. En définitive, de nouvelles entités cellulaires ou phénotypes peuvent être identifiés grâce à l'étiquetage multiplexé de marqueurs extracellulaires et cellulaires, permettant ainsi une meilleure compréhension de la composition de tissus complexes tels que le microenvironnement tumoral.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux techniques classiques d'immunofluorescence est que l'analyse multispectrale permet de multiplexer sept fluorochromes ou plus sur la même lame, offrant ainsi une interrogation beaucoup plus précise et détaillée de la composition cellulaire du microenvironnement tumoral ou d'un tissu en régénération. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'origine et la composition du microenvironnement tumoral, elle peut être appliquée à d'autres systèmes tels que la médecine régénérative, la biologie du développement et la biologie immunitaire. Chris Booth, assistant de recherche dans mon laboratoire, démontre cette procédure aux côtés du Dr Spa. En raison des restrictions imposées par l'Université de l'Indiana (IU Cook) dans cet établissement, nous discuterons mais ne montrerons pas de manipulations directes sur des souris.

Ces procédures de moelle osseuse et nos techniques d'engraftement tumoral sont décrites dans nos travaux antérieurs, tels que les cellules souches de kid et autres. 2009. Après avoir isolé les cellules de la moelle osseuse à partir des membres postérieurs symétriques, resuspendre les cellules à raison de 2 millions de cellules par 100 microlitres de PBS par souris. Utiliser une lampe chauffante pour dilater les vaisseaux d'une souris receveuse irradiée exprimant la GFP et placer la souris dans un dispositif de contention pour injection intraveineuse via la queue.

À l'aide d'une aiguille de calibre 29, côté biseau vers le haut, injecter systématiquement les suspensions cellulaires dans la veine de la queue ou par voie rétro-orbitaire. Utiliser un pansement stérile pour appliquer une légère pression sur la queue après l'injection. Injecter à une souris 100 microlitres de PBS uniquement, servant de contrôle d'engraftement, le jour de l'injection.

Ré-suspendre les cellules tumorales d'intérêt dans du PBS à raison d'un million de cellules par 100 microlitres. Après avoir stérilisé l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %. Utiliser une main pour immobiliser la souris par la nuque et la queue, puis, de l'autre main, tenir l'aiguille avec le biseau vers le haut et injecter les cellules tumorales dans la cavité intrapéritonéale de la souris receveuse.

Après 15 à 30 jours, euthanasier les souris et exciser la tumeur de leur abdomen. Ensuite, fixer les tumeurs dans du formol à 10 % pendant 24 heures. Puis sectionner le tissu fixé en tranches de cinq à dix micromètres pour les procédures de coloration ultérieures.

Après avoir fixé les sections de tissu dans du paraffine, faire chauffer les échantillons pendant une heure à 56 degrés Celsius. Ensuite, laver les lames selon la séquence suivante. Après le dernier lavage à l'éthanol, rincer les lames dans de l'eau pendant deux minutes en immergeant lentement et en sortant le porte-lames du bain d'eau 10 fois.

Placez ensuite le tampon de citrate de sodium au micro-ondes pour le chauffer. Après avoir porté les lames à ébullition pendant 20 minutes dans le tampon de citrate de sodium, laissez les échantillons refroidir dans le tampon pendant 30 minutes. Rincez ensuite avec de l'eau ionisée pendant cinq minutes supplémentaires.

Ensuite, tapotez la lame pour laisser rouler les grosses gouttes d'eau, en prenant soin de ne pas dessécher la section tissulaire. Utilisez un stylo à barrière hydrophobe pour délimiter les sections autour des échantillons tumoraux, puis appliquez immédiatement du tampon de blocage sur l'échantillon afin d'éviter que la section tissulaire ne s'assèche. Après une heure, incubez les lames avec l'anticorps primaire d'intérêt dans une boîte humidifiée placée sur un agitateur rotatif lent à quatre degrés pendant la nuit.

Le lendemain matin, laver les lames deux fois dans du PBST pendant 10 minutes chaque fois, avec agitation douce, pendant que les sections sont lavées. Diluer les anticorps secondaires à un ratio d'un anticorps pour 1000 dans le tampon de blocage. Incuber ensuite les sections dans les anticorps secondaires appropriés dans une boîte humide recouverte de papier d'aluminium, sur un agitateur rotatif lent, à température ambiante pendant deux heures.

Lavez les lames deux fois dans du PBST pendant cinq minutes avec agitation douce et protégez-les de la lumière. Ensuite, coloriez la lame témoin et les lames d'analyse avec du DPI pendant une minute, en gardant les lames couvertes pendant l'incubation. En plaçant une lamelle sur chaque échantillon, scellez les bords de chaque lamelle avec un durcisseur à ongles.

Maintenant, pour effectuer l'imagerie multispectrale, utilisez un objectif à immersion huileuse afin de capturer une image initiale de la lame d'analyse et obtenir les temps d'exposition appropriés pour chacune des plages spectrales de la bibliothèque spectrale. Par exemple, ce tableau présente les protocoles recommandés pour la bibliothèque spectrale en fonction du nombre de fluorochromes utilisés dans l'expérience. Ensuite, imagez la lame non colorée afin d'obtenir la lame de fond dans la bibliothèque spectrale pour cette expérience.

Image suivante, la lame non colorée afin d'obtenir l'image du fond pour la bibliothèque spectrale. Ensuite, acquérir l'image de chaque lame témoin monocouche colorée avec un seul fluorochrome, en enregistrant les images sous le nom de l'anticorps secondaire utilisé pour chaque lame. Une fois la bibliothèque spectrale établie, acquérir les images des régions d'intérêt sur la lame d'analyse afin d'analyser les images des tissus tumoraux.

Tout d'abord, importez un échantillonnage représentatif des images de nuances acquises à l'aide du logiciel inform. Ensuite, ouvrez la bibliothèque spectrale sécurisée comme indiqué par le programme. Puis, identifiez les régions tissulaires d'intérêt à analyser.

Identifier les cellules individuelles en fonction de la coloration par DAPI. Le cytoplasme sera identifié automatiquement en fonction de la forme du noyau. Choisissez maintenant la mesure d'intensité fluorescente souhaitée pour chaque paramètre fluorescent, puis associez les images acquises, en laissant le logiciel traiter les données à l'aide de l'algorithme proposé.

Lorsque le traitement de l'image est terminé, fusionnez les fichiers obtenus. Ensuite, en utilisant cette technique d'imagerie multispectrale pour analyser et représenter graphiquement les tumeurs dans ce modèle murin transgénique de greffe de moelle osseuse, les composants tumoraux stromaux d'origine médullaire ont été identifiés par cytométrie en flux trois semaines après la greffe de moelle osseuse. Puis, six semaines après l'injection initiale, des coupes provenant des tumeurs ovariennes injectées non marquées ont été analysées après création d'une bibliothèque spectrale à l'aide de lames témoins monocolorées ; des images de la coupe de tumeur ovarienne marquée avec GFP DPI et deux autres marqueurs ont été analysées.

L'ajout de marqueurs supplémentaires est possible. Par exemple, ici, la bibliothèque spectrale et l'image associée d'une section de tumeur avec six marqueurs plus une coloration nucléaire sont présentées à l'aide du logiciel adéquat. Les régions tissulaires d'intérêt au sein de la section de tumeur sont classifiables, comme illustré sur les images représentatives montrées ici.

Par exemple, cette image illustre la classification des segments de tissu suivie de la segmentation des cellules. Sur la base de la coloration nucléaire dpi. La quantification des marqueurs fluorescents peut ensuite être mesurée dans le noyau et le cytoplasme de chaque cellule et exportée pour une analyse ultérieure.

L'algorithme de segmentation tissulaire est capable d'identifier davantage de sous-types tissulaires en se basant sur l'architecture tissulaire et non uniquement sur l'identification des fluorochromes, offrant ainsi un outil analytique plus robuste pour classer la coloration en régions tissulaires distinctes. Sur cette image, l'ordinateur a été entraîné à identifier cinq sous-régions selon les motifs architecturaux présents dans le tissu. Le fond est défini par l'espace vide.

La tumeur hémolytique est définie par l'abondance de globules rouges au sein du tissu. La tumeur est définie par des cellules fortement peuplées. La graisse est définie par de grandes compartiments cellulaires vides et symétriques, et les muscles par un motif strié.

Grâce à cette méthode, une population de cellules doublement positives peut être analysée selon un seuil d'intensité fluorescente déterminé. Par exemple, pour les cellules positives à la GFP et à l'actine alpha des muscles lisses, comme illustré ici pour une détection spectrale supplémentaire au-delà de quatre couleurs, veuillez consulter les documents de conseils et astuces associés pour la multiplexion de cinq sondes ou plus. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la qualité des images dépend fortement des lames témoins monocolorées correctement préparées.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que l'hybridation in situ en fluorescence peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les compartiments cellulaires et le tissu de l'environnement tumoral. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre notre technique de simulation, l'interrogation multispectrale des composants multicellulaires, et une fois cette dernière réalisée, vous devriez avoir une compréhension approfondie de la manière d'identifier plusieurs cibles cellulaires sur une même lame. Vous saurez également comment quantifier ces cibles cellulaires et comprendre l'évolution du stroma tumoral ou d'un tissu régénératif, ou de votre tissu d'intérêt.