Conception d'un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l'ingénierie tissulaire

Nous avons conçu un nouveau bioréacteur de chargement mécanique qui peut appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à une biocomposites du cartilage avant la transplantation dans un défaut de cartilage articulaire.

L’objectif global de l’expérience suivante est de fabriquer des biocomposites fonctionnels issus de l’ingénierie tissulaire pour la transplantation. Ceci est réalisé en appliquant une contrainte mécanique uniaxiale ou bioaxiale précise pour fournir des stimuli biophysiques aux cellules dans des composites de biomatériaux tridimensionnels. Dans un deuxième temps, le bioréacteur est équipé d’une cellule de charge, qui fournit un retour de force et des tests mécaniques des biocomposites pendant le chargement.

Ensuite, les biocomposites sont cultivés sur une période de plusieurs semaines afin d’induire des changements à l’échelle macroscopique dans le contenu biochimique de construction et des résultats de résistance sont obtenus qui montrent l’effet de différents types de charge en fonction des différences significatives de teneur en glycosaminoglycanes et en collagène, d’échafaudage, d’épaisseur et de module d’équilibre. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des effets de la charge biaxiale sur le tissu cartilagineux modifié, elle peut également être appliquée à d’autres tissus peu porteurs tels que les os et les tendons, démontrant ainsi la procédure par Amy May et Rob Stefani de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, installez un bioréacteur bioaxial comme illustré ici.

La base du bioréacteur est composée d’une plaque d’aluminium mesurant 25 centimètres sur 30 centimètres sur 12,5 millimètres. Les options de positionnement variables disponibles permettent un montage flexible de plaques de culture tissulaire de différentes formes et tailles. Ensuite, assurez-vous que les étages sont montés sur la base afin que l’étage horizontal fournisse un cisaillement dynamique en oscillant uniquement le long de l’axe x.

Et l’étage vertical fournit une compression dynamique en oscillant uniquement le long de l’axe Z. L’étape suivante consiste à fabriquer une plaque de chargement en polysulfone personnalisée. Le matériau polysulfone est idéal en raison de sa biocompatibilité, de sa facilité d’usinage et de sa facilité de stérilisation.

Couplez la plaque, la plate-forme mobile biaxiale via un support à angle droit usiné avec précision. Les butées cinématiques fixées à la plaque de base, ont des vis de réglage fines pour permettre un alignement précis des plaques de culture non réalisable à la main. Ensuite, fixez l’actionneur du moteur pas à pas à chaque plate-forme, qui acquerra un retour de position pour le logiciel.

Les actionneurs de moteur pas à pas présentés ici ont une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 micromètre et une résolution de 20 nanomètres, ce qui se traduit par une précision de moins de trois micromètres. Plus de 50 millimètres de course contrôlent les mouvements des platines à l’aide du logiciel de technologie de positionnement avancée de Thor Lab. Le logiciel contrôle le moteur pas à pas afin d’ajuster les paramètres de charge de fréquence et d’amplitude de la pure et de la compression indépendamment et simultanément. Ensuite, placez une cellule de charge miniature de cinq livres entre le platine de chargement et la plate-forme mobile pour fournir le retour de force nécessaire à la détection du contact entre le platine et les constructions, ainsi que pour évaluer les réponses de charge.

Assurez-vous que le capteur de pesage a des précisions élevées de 0,15 % à 0,25 % de pleine échelle, et que l’unité d’affichage du capteur de charge dispose d’un port RS 2 32 pour permettre la collecte de données sur un ordinateur. Afin d’immobiliser les échantillons dans les puits d’une plaque de 24 puits, préparez un moule pour un gel aros de 1,5 millimètre d’épaisseur à l’aide d’un système de coulée de gel avec des entretoises de 1,5 millimètre. Une fois assemblé, versez une solution de 4 %aros entre les deux plaques de verre et laissez refroidir le mélange.

Retirez ensuite la plaque supérieure et perforez un disque de 16 millimètres de diamètre dans la dalle agricole. Pour chaque échantillon, bien dans chaque disque, percez un trou pour que l’échantillon soit placé. Placez les disques terminés dans les puits d’une plaque à 24 puits.

Appuyez ensuite sur des tissus de 2,25 millimètres d’épaisseur et de cinq millimètres de diamètre dans chacun des supports de gel. L’échantillon doit dépasser du haut de chaque support aérodynamique. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de milieu de culture dans chaque puits et replacez le couvercle.

Remettez ensuite la plaque dans l’incubateur jusqu’à ce qu’il soit temps de charger l’échantillon. Pour commencer le chargement mécanique des constructions tissulaires, fixez la plaque d’aluminium à la cellule de charge et fixez un ensemble de platine stérile à la platine verticale en tout temps. L’incubateur doit fonctionner dans des conditions de faible humidité pour éviter toute défaillance de l’instrument.

Ensuite, allumez le contrôleur du moteur pas à pas et le PC. Ouvrez le programme utilisateur de la technologie de positionnement avancée et accédez à l’onglet de contrôle graphique sur les deux écrans. Appuyez sur le bouton zéro d’accueil pour envoyer les deux moteurs pas à pas en position zéro, qui est définie comme la position supérieure et la position la plus à droite.

Préparez les échantillons pour le chargement en retirant certains milieux de chaque puits afin d’éviter les débordements lors du chargement mécanique. Ensuite, placez la plaque à 24 puits dans le bioréacteur et alignez soigneusement la plaque avec le platine à l’aide de quatre localisateurs cinématiques réglables, assurez-vous d’aligner la plaque. Au ras de l’avant de la base du bioréacteur dans l’onglet de contrôle graphique.

Manuellement fin. Ajustez l’alignement en cliquant sur la case de position pour le déplacer horizontalement. Lorsque la plaque est alignée avec les puits de la plaque, commencez à abaisser la plaque jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec les échantillons.

Une fois la position de départ atteinte, allez dans l’onglet du séquenceur de mouvement et chargez la séquence de mouvement souhaitée en appuyant sur Charger ou créez votre propre programme comme décrit dans le protocole texte accompagnant cette vidéo. Appuyez ensuite sur run pour commencer le programme. Le logiciel dirigera les moteurs pour appliquer le régime de conditionnement souhaité aux échantillons.

Lorsque le programme est terminé, soulevez manuellement la plaque de manière à ce qu’elle dégage le haut de la plaque de culture tissulaire. Retirez ensuite la plaque de roue 24 du bioréacteur et replacez le média. Enfin, retirez délicatement le platine de la cellule de charge, puis éteignez les instruments.

L’utilisation du bioréacteur biaxial décrit dans cette vidéo a eu un effet significatif sur la quantité de glycosaminoglycanes et de collagène sécrétés par les cellules dans les constructions tissulaires. Le conditionnement a eu lieu cinq jours par semaine pendant trois heures par jour avec une déformation par compression de 10 % et une déformation par cisaillement de 5 % à un hertz. Après 30 jours de culture, la quantité de glyco Amin, de glycanes et de collagène sécrétée par les chondrocytes exposés à la charge était significativement plus élevée que dans les échantillons témoins.

De plus, la charge biaxiale a créé des constructions plus épaisses, mais n’a montré aucun effet sur l’élasticité des constructions. À l’aide de ce protocole de dosage, après 30 jours de conditionnement et de culture, des coupes transversales des constructions tissulaires ont été colorées avec des marqueurs typiques du cartilage, notamment du safran bleu et du collagène o et de type 2. Les trois groupes différents comprennent l’absence de conditionnement, la charge uniaxiale et la charge biaxiale.

Alors que tous les groupes présentent une coloration positive pour le bleu d’alium, le safran et l’O, les échantillons chargés en bixi montrent des quantités accrues de collagène de type 2 par rapport aux échantillons à charge nulle et à charge axiale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer des charges uniaxiales ou biaxiales sur des constructions en développement d’ingénierie tissulaire.