Conception d'un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l'ingénierie tissulaire

L'objectif général de l'expérience suivante est de fabriquer des biocomposites fonctionnels, conçus par ingénierie tissulaire, destinés à la transplantation. Cela est réalisé en appliquant une contrainte mécanique précise, uniaxiale ou biaxiale, afin de fournir des stimuli biophysiques aux cellules au sein de composites biomatériaux tridimensionnels. Dans un deuxième temps, le bioréacteur est équipé d'une cellule de charge, qui assure un retour de force et permet des essais mécaniques des biocomposites pendant la sollicitation.

Les prochains biocomposites sont cultivés sur une période de plusieurs semaines afin d'induire des modifications à grande échelle de la teneur biochimique et de la résistance des constructions. Les résultats obtenus montrent l'effet de différents types de sollicitations mécaniques, fondé sur les différences significatives de teneur en glycosaminoglycanes et en collagène, en tenant compte du support, de l'épaisseur et du module d'équilibre. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les effets du chargement biaxial sur le tissu cartilagineux génie-biologique, elle peut également être appliquée à d'autres tissus soumis à de faibles charges, tels que l'os et le tendon, démontrant ainsi la procédure réalisée par Amy May et Rob Stefani de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, installez un bioréacteur biaxial comme illustré ici.

La base du bioréacteur est composée d'une plaque en aluminium mesurant 25 centimètres sur 30 centimètres sur 12,5 millimètres. Les options de positionnement variables permettent un montage flexible de plaques de culture tissulaire de différentes formes et tailles. Ensuite, assurez-vous que les plateaux sont fixés sur la base de manière que le plateau horizontal exerce un cisaillement dynamique en oscillant uniquement selon l'axe des x.

Et la plateforme verticale assure une compression dynamique en oscillant uniquement selon l'axe Z. L'étape suivante consiste à fabriquer une plaque de chargement personnalisée en polysulfone. Le polysulfone est un matériau idéal en raison de sa biocompatibilité, de sa facilité d'usinage et de sa facilité de stérilisation.

Fixez la plaque à la plateforme mobile biaxiale à l’aide d’un support d’angle droit usiné de précision. Les butées cinématiques fixées sur la plaque de base sont équipées de vis de réglage fin permettant un alignement précis des plaques de culture, impossible à obtenir manuellement. Ensuite, fixez l’actionneur moteur pas à pas à chaque plateforme, qui fournira une rétroaction de position au logiciel.

Les actionneurs à moteur pas à pas présentés ici ont une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 micromètre et une résolution de 20 nanomètres, ce qui se traduit par une précision inférieure à trois micromètres sur une course de 50 millimètres. Contrôlez les mouvements des plateaux à l’aide du logiciel de technologie de positionnement avancé de Thor Labs. Le logiciel commande le moteur pas à pas afin de régler indépendamment et simultanément les paramètres de charge en fréquence et en amplitude, tant en cisaillement qu’en compression. Ensuite, placez une cellule de charge miniature de cinq livres entre la platine de chargement et la plateforme mobile afin d’assurer la rétroaction en force nécessaire à la détection du contact entre la platine et les constructions, ainsi qu’à l’évaluation des réponses sous charge.

Veillez à ce que la cellule de charge ait une haute précision de 0,15 % à 0,25 % de la pleine échelle, et que l'unité d'affichage de la cellule de charge dispose d'un port RS 232 permettant la collecte de données sur un ordinateur. Afin d'immobiliser les échantillons dans les puits d'une plaque de 24 puits, préparez un moule pour un gel d'agarose de 1,5 millimètre d'épaisseur à l'aide d'un système de coulée de gel équipé de cales de 1,5 millimètre. Une fois assemblé, versez une solution de 4 % d'agarose entre les deux plaques de verre et laissez le mélange refroidir.

Ensuite, retirez la plaque supérieure et découpez un disque de 16 millimètres de diamètre dans la gélose. Pour chaque puits, prélèvement sur chaque disque, percez un trou destiné à accueillir l'échantillon. Placez les disques ainsi préparés dans les puits d'une plaque de 24 puits.

Ensuite, appuyez fermement pour insérer des constructions tissulaires de 2,25 millimètres d'épaisseur et de 5 millimètres de diamètre dans chacun des supports de gel. L'échantillon doit dépasser par le haut de chaque support d'aérosol. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de milieu de culture dans chaque puits et remplacez le couvercle.

Ensuite, remettre la plaque dans l'incubateur jusqu'au moment du chargement des échantillons. Pour commencer le chargement mécanique des constructions tissulaires, fixer la plaque en aluminium à la cellule de charge et attacher en permanence un ensemble en platine stérile à la platine verticale. L'incubateur doit fonctionner à faible humidité afin d'éviter une défaillance de l'appareil.

Ensuite, allumez le contrôleur du moteur pas à pas et l'ordinateur. Ouvrez le programme utilisateur Advanced Positioning Technology et accédez à l'onglet de commande graphique sur les deux écrans. Appuyez sur le bouton de mise à zéro pour ramener les deux moteurs pas à pas à la position zéro, définie comme étant la position la plus haute et la plus à droite.

Préparez les échantillons pour le chargement en retirant une partie du milieu de chaque puits afin d'éviter un débordement lors du chargement mécanique. Ensuite, placez la plaque 24 puits dans le bioréacteur et alignez soigneusement la plaque avec le plateau à l'aide de quatre dispositifs de positionnement cinématiques réglables ; assurez-vous de bien aligner la plaque. Effectuez l'alignement avec l'avant de la base du bioréacteur dans l'onglet de contrôle graphique.

Réglez manuellement avec précision. Ajustez l'alignement en cliquant sur la boîte de position pour la déplacer horizontalement. Lorsque la plaque est alignée avec les puits de la plaque, commencez à abaisser la plaque jusqu'au premier contact avec les échantillons.

Une fois la position de départ atteinte, accédez à l'onglet du séquenceur de mouvements et chargez la séquence de mouvements souhaitée en appuyant sur charger ou créez votre propre programme comme décrit dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Ensuite, appuyez sur exécuter pour démarrer le programme. Le logiciel dirigera les moteurs afin d'appliquer le régime de conditionnement souhaité aux échantillons.

Lorsque le programme est terminé, soulevez manuellement la plaque afin qu'elle dépasse le haut de la plaque de culture tissulaire. Ensuite, retirez la plaque à 24 puits du bioréacteur et remplacez le milieu. Enfin, retirez soigneusement le platine de la cellule de charge, puis éteignez les instruments.

L'utilisation du bioreacteur biaxial décrit dans cette vidéo a eu un effet significatif sur la quantité de glycosaminoglycanes et de collagène sécrétée par les cellules au sein de constructions issues du génie tissulaire. L'entraînement a eu lieu cinq jours par semaine pendant trois heures par jour, avec une déformation en compression de 10 % et une déformation en cisaillement de 5 % à un hertz. Après 30 jours de culture, la quantité de glycosaminoglycanes et de collagène sécrétée par les chondrocytes soumis à une sollicitation biaxiale était significativement plus élevée que celle des échantillons témoins. Une sollicitation uniaxiale n'a augmenté significativement que la quantité de glycosaminoglycanes.

De plus, la sollicitation biaxiale a produit des constructions plus épaisses, mais n'a montré aucun effet sur l'élasticité des constructions. À l'aide de ce protocole de dosage, après 30 jours de conditionnement et de culture, des sections transversales des constructions tissulaires ont été colorées avec des marqueurs typiques du cartilage, notamment le safran bleu o et le collagène de type II. Les trois groupes différents comprennent l'absence de conditionnement, la sollicitation uniaxiale et la sollicitation biaxiale.

Alors que tous les groupes présentent une coloration positive au Bleu d'alium et à la Safranine O, les échantillons chargés biaxialement montrent des quantités accrues de collagène de type II par rapport aux échantillons non chargés et à ceux chargés uniaxialement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'appliquer des charges uniaxiales ou biaxiales sur des constructions tissulaires ingénierisées en cours de développement.