Name: Conception dun bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour lingénierie tissulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez la conception d'un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode applique une contrainte précise pour stimuler les cellules dans les biocomposites tridimensionnels et améliorer la qualité des tissus.

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Ce travail a été soutenu par le Bureau de la recherche et du développement, RR &amp; D services, ministère américain des Anciens combattants, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 et le ministère de la Défense W81XWH-10-1-0643.

1. Biaxiale Chargement bioréacteur Conception <ol><li> Le bioréacteur emploie deux étapes fabriqués par Thor-labs (Newton, MA) pour les applications laser à guidage de précision pour appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale de tissus fabriqués avec une grande précision de la dose de charge (amplitude et fréquence) et l&#39;application d&#39;un large éventail de conditions de culture de tissus de simple à plaques à 24 puits (Figure 1). </li><li> Chargement bi-axial est réalisé en deux étapes travelmax (LNR50SE). Ces étages sont montées orthogonalement dans une configuration XZ. La phase horizontale fournit des mouvements de cisaillement dynamiques en oscillant le long de l&#39;axe des X. La phase verticale fournit une charge de compression dynamique en faisant osciller le long de l&#39;axe Z. Ces étapes ont une gamme de voyage de 50 mm et sont entraînés indépendamment par stepper actionneurs à moteur (DRV014), commandé par un pilote de moteur pas à pas en boucle fermée (BSC102) qui offre des capacités de Micro-progression, ce qui permet des tailles de pas de moins de50 nm. </li><li> Le dispositif est monté sur un support rigide 25 cm x 30 cm x 12,5 plaque de base en aluminium de mm qui est utilisé en tant que plate-forme pour le montage de composants de la machine et pour le montage de plaques de culture de tissus. Butées réglables cinématiques sont utilisés pour verrouiller les plaques de culture de tissus en place sur la plaque de base en aluminium. Ces arrêts cinématiques ont des vis de réglage fin pour permettre un alignement précis qui est par ailleurs pas réalisable à la main. La conception modulaire de la plaque de base permet un placement souple de ces arrêts cinématiques pour accueillir des plaques de différentes tailles et formes (boîtes de Petri par rapport aux plaques multi-puits). </li><li> Une coutume-usiné polysulfone chargement plaque est couplée à la plate-forme mobile bi-axial via un usinage de précision crochet droit. Matériau polysulfone a été choisi en raison de sa biocompatibilité, une facilité d&#39;usinage, et la facilité de stérilisation. </li><li> Mouvements des étapes sont contrôlées par la technologie de positionnement avancé Thor-laboratoires d&#39;(APT) du logiciel. Le moteur pas à pas, c&#39;est noused en association avec le logiciel qui permet l&#39;ajustement de paramètres de charge de fréquence et d&#39;amplitude à la fois de cisaillement et de compression indépendante et simultanée. </li><li> Rétroaction de position est fournie par des codeurs optiques linéaires qui sont attachés à chaque plate-forme mobile et sont intégrés au logiciel. Le système de codeur a une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 um et une résolution de 20 nm, traduisant une précision de positionnement inférieure à 3 um sur la totalité de 50 mm de course. Ces codeurs fournissent la rétroaction de position nécessaire à l&#39;électronique de commande pour assurer une véritable capacité de nanopositionnement et une lecture directe de la position absolue. </li><li> Afin d&#39;assurer le retour de force nécessaire pour détecter un contact entre plateau et des échantillons et évaluer les réponses de chargement, une cellule de charge miniature de précision (Honeywell Modèle 31) est positionné entre le chargement d&#39;impression et la plate-forme mobile (Figure 2). La cellule de charge a une précision élevées de0,15% à 0,25% de la pleine échelle. L&#39;unité d&#39;affichage (SC500) pour la cellule de charge peut également fournir des mesures de charge allant jusqu&#39;à 5 décimales. En outre, il dispose d&#39;un port RS-232 pour permettre la collecte de données sur un ordinateur. </li></ol> 2. Cell-ensemencées Agarose constructions <ol><li> Préparer 4% d&#39;agarose: Ajouter 0,8 g d&#39;agarose à 20 ml de DMEM (sans additifs) dans un flacon de 50 ml, faire bouillir, puis garder à 70 ° C four jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Ajuster le volume de la suspension cellulaire de la double quantité de la densité d&#39;ensemencement des cellules désirée. Cette suspension est mélangée à volume égal de 4% p / v d&#39;agarose pour créer un gel d&#39;agarose à 2% à la densité de semis voulue. </li><li> Placez la fois la suspension cellulaire et une pipette de 10 ml dans l&#39;incubateur. </li><li> Mettre en place le système de coulée de gel. Une 1,5 mm et une plaque d&#39;espacement de 0,75 mm devrait être mis ensemble pour créer un gel d&#39;une épaisseur de 2,25 mm. D&#39;autres plaques d&#39;écartement de taille peuvent être utilisés pour créer un gel d&#39;épaisseurs différentes. Le système de coulée de gel n&#39;est pas suffisamment grand pour contenir ces plaques togetelle, alors ils doivent être scellés en toute sécurité pour éviter les fuites. </li><li> L&#39;étape suivante consiste à mélanger rapidement la suspension de cellules avec de l&#39;agarose et la pipette préparée précédemment dans le moule de gel avant que l&#39;agarose se solidifie. Retirez le agarose liquide du four et placez un thermomètre stérile en elle. La gélose doit refroidir à 42-43 ° C avant de les mélanger avec les cellules. Réchauffer la suspension de cellules à 37 ° C. Une fois que l&#39;agarose frappe 43 ° C, une pipette rapidement la quantité désirée puis pipette immédiatement la suspension de cellules de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Puis ajouter immédiatement la totalité du mélange dans le moule de gel. </li><li> Laisser le gel se solidifier pendant 10-15 minutes, puis inclinez-le soigneusement à l&#39;horizontale. </li><li> Retirer la plaque de verre supérieure et disques de punch avec la biopsie. Les disques peuvent être ramassés avec une petite spatule stérile. Dans notre expérience, un ml de gel 9 est assez grand pour faire plus d&#39;une centaine de disques de 5 mm de diamètre. </li></ol> 3. Culture des disques </p&gt; <ol><li> Placer un disque dans chaque puits d&#39;une plaque de culture non-tissulaire 24 ainsi traitée. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de différenciation chondrocytaire sans sérum à chaque puits. </li><li> Mettez les plaques dans l&#39;incubateur (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Pour les changements de supports, remplacer 1 ml par puits tous les 2-3 jours. </li></ol> 4. Immobilisation des échantillons pour Chargement mécanique <ol><li> Préparer 4% d&#39;agarose (pas de suspension cellulaire ajoutée) et le gel doit être plus mince que les échantillons eux-mêmes (pour éviter les interférences pendant le chargement). L&#39;épaisseur recommandée est de 1,5-1,9 mm (pour les échantillons de 2,25 mm d&#39;épaisseur). </li><li> Une fois gélifiées, les disques d&#39;un diamètre de 16 mm poinçon pour plaques à 24 puits. Dans chaque disque, un trou de poinçon de 5 mm de l&#39;échantillon à être placé in Si on le souhaite, un autre trou de poinçon de 5 mm sur le bord du disque à la pipette pour être placé lors de changements de supports. </li><li> Une fois que les puits d&#39;agarose ont été faites, place dans 24 plaques à puits, comme le montre la figure 3. </li><li> Une fois le w agaroseElls sont en plaque de 24 puits, Press Fit échantillons dans chaque puits. L&#39;échantillon ne doit faire saillie à partir de la partie supérieure du puits d&#39;agarose. </li></ol> 5. Chargement mécanique <ol><li> Stériliser plateau (Figure 2). </li><li> Fixer la plaque d&#39;aluminium pour charger la cellule. Sécurisé platine / cellule / aluminium ensemble de plaque de charge à l&#39;étage de charge. </li><li> Allumez le contrôleur de moteur pas à pas (interrupteur à l&#39;arrière). </li><li> Allumez le programme ouvert &quot;APT utilisateur&quot; (Figure 4) et PC. <ol><li> Écran gauche contrôle moteur pas à pas horizontal. Écran droite contrôle moteur pas à pas vertical. Dans chaque écran, onglet &quot;graphique de configuration» permet un positionnement manuel et onglet &quot;Sequencer Move&quot; permet l&#39;automatisation. Toutes les unités sont mm. </li></ol></li><li> Allez à l&#39;onglet &quot;Contrôle graphique&quot; sur les deux écrans et appuyez sur le bouton &quot;Home / Zero&quot;. Les deux moteurs pas à pas ont une portée de 50 mm. Appuyez sur &quot;Accueil / Zero&quot; enverra deux moteurs pas à pas à la position zéro (haut et à droite la plupart des postes). </li><li> Prepare les échantillons dans la plaque de 24 puits pour le chargement en supprimant certains médias de chaque puits. Pas plus de 1 ml de milieu doit être laissé dans chaque puits pour éviter tout débordement lors du chargement. Assurez-vous que suffisamment de médias sont laissés dans le puits pour maintenir l&#39;échantillon couvert. <ol><li> Notez que l&#39;incubateur est conservé dans des conditions de faible humidité pour éviter une défaillance de l&#39;appareil. </li></ol></li><li> Placer la plaque 24 puits en bioréacteur et aligner soigneusement avec la platine. <ol><li> La plaque est fixée à l&#39;aide de quatre bioréacteur localisateurs cinématiques réglables. Pour rendre plus facile pour aligner le plateau, les deux locators gauche ont été pré-positionnés. Serrez les deux locators droite de sorte que la plaque est sécurisée. Assurez-vous d&#39;aligner la plaque parfaitement sur le devant de la base du bioréacteur. </li><li> Dans l&#39;onglet &quot;Contrôle graphique&quot;, une position moteur pas à pas spécifique peut être saisie manuellement en cliquant sur la case de position. Utilisez cette fonction pour réduire lentement le plateau et le déplacer horizontalement afin de s&#39;aligner avec la plaque. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Une fois que le plateau est proche d&#39;entrer en contact avec des échantillons, commencer à mettre la platine vers le bas par incréments très lentes (0,1 mm) jusqu&#39;à ce que vous atteignez la position de départ prédéterminée (voir partie 6). </li><li> Une fois la position de départ est atteint, allez dans &quot;Déplacer Sequencer&quot; onglet et charger la séquence de déplacement souhaitée en appuyant sur &quot;Load&quot;. Ensuite, appuyez sur &quot;Exécuter&quot; pour commencer. (Figure 5) Voir la partie 7. Rédaction d&#39;un protocole de dosage. </li><li> Lorsque vous avez terminé le chargement, le soulever manuellement le plateau. Si les échantillons sont collés sur la vitre d&#39;exposition, soigneusement mis de nouveau dans le puits approprié à l&#39;aide d&#39;une spatule stérile. </li><li> Retirer la plaque 24 et de bioréacteur et de remplacer les médias. </li><li> Retirez délicatement le plateau de la cellule de charge, puis s&#39;éteint instruments. </li></ol> 6. Calibrage Chargement Platen Pour s&#39;assurer que les souches appropriées sont appliquées aux échantillons, chaque plateau doit être soigneusement calibrée avant de commencer une expérience. <ol><li&gt; Effectuer les étapes 5.1 et 5.8. </li><li> Mettre manuellement moteur pas à pas de la position horizontale à 25 mm. </li><li> Platine inférieure avec précaution jusqu&#39;à ce qu&#39;elle arrive juste à peine en contact avec le fond du bioréacteur. Cellule de charge indique l&#39;augmentation des charges à ce point. Prenez note de la position exacte du moteur pas à pas vertical (être aussi précis que possible, que toutes les mesures de contrainte de compression seront calculés à partir de cette valeur). </li><li> Enregistrer la position. Cette valeur sera utilisée pour écrire un protocole de dosage en fonction des dimensions de l&#39;échantillon et les contraintes désirées. </li></ol> 7. Rédaction d&#39;un protocole de dosage <ol><li> Le bioréacteur est capable d&#39;appliquer des contraintes à la fois en compression et en cisaillement, que ce soit simultanément ou individuellement. Trois paramètres principaux doivent être décidées: tare contrainte de compression, amplitude de la déformation dynamique, et la fréquence de chargement. </li><li> Une souche de tare est appliquée afin d&#39;empêcher le décollage de la platine à partir de l&#39;échantillon. </li><li> Exemple amplitude de la déformation dynamique et chargement frequence sont choisis. </li></ol> Dans cette étude, nous définissons une contrainte de compression et de cisaillement comme suit: <img alt="Équation 1" fo:content-width="3.26in" fo:src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1.jpg" /> Exemple protocole de dosage bi-axial épaisseur de l&#39;échantillon: 2,25 mm Tare Strain (Compression): 10% de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon (0,225 mm) Amplitude de déformation dynamique (compression): 10% (+ / - 5% de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon) Fréquence (Compression): 1 Hz L&#39;amplitude de déformation dynamique (cisaillement): 25% de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon (0,5625 mm): La contrainte de cisaillement est appliquée à l&#39;échantillon par le cylindre d&#39;impression se déplaçant horizontalement. Fréquence (cisaillement): 0,5 Hz Protocole de dosage typique est de 3 h de chargement par jour. Dans cet exemple, le chargement dynamique et de cisaillement est appliquée simultanément plutôt que séquentiellement. Nous croyons mieux ce modèle mimics l&#39;environnement de chargement complexe dans le genou humain. <ol start="4"><li> Une fois le protocole de dosage a été sélectionné, un programme de séquence de déplacement de compression doit être écrit. </li><li> La séquence de mouvement est exactement ce que cela ressemble, une liste des positions que le moteur pas à pas se déplace à une accélération spécifié et la vitesse maximale. </li><li> Calculez des positions verticales souhaitées en fonction de dosage protocole et la valeur d&#39;étalonnage plateau (de la partie 6). </li><li> Exemple calculs pour Platen 1 sont fournis ci-dessous: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Différence de valeur d&#39;étalonnage </td><td> Position verticale </td></tr><tr><td> Platen valeur d&#39;étalonnage (touche bas du bioréacteur) </td><td> 0 mm </td><td> 29,7700 mm </td></tr><tr><td> Platen en contact avec l&#39;échantillon (échantillon de 2,25 mm) </td><td> 4,4140 mm </td><td> 25,3560 mm </td></tr><tr><td> Stpluie (5% Epaisseur) </td><td> 4,3015 mm </td><td> 25,4705 mm </td></tr><tr><td> Strain (10% Epaisseur) </td><td> 4,1890 mm </td><td> 25,5810 mm </td></tr><tr><td> Strain (15% Epaisseur) </td><td> 4,0765 mm </td><td> 25,6955 mm </td></tr></tbody></table><ol start="8"><li> Une fois que les positions sont calculées, d&#39;expérimenter avec l&#39;accélération et les valeurs maximales de vitesse pour obtenir la bonne fréquence. Le nombre de cycles doit être choisi en conséquence (par exemple 10.800 cycles de 3 h à 1 Hz). </li><li> Exemple de programme dynamique de compression de mouvement de la séquence (10% de tare compression, 10% de l&#39;amplitude de la contrainte dynamique, 1 Hz) (Figure 5) </li><li> Programme de séquence de déplacement de cisaillement dynamique: Le nombre de cycles doit être choisie en fonction de la fréquence et de la durée souhaitée (par exemple 5.400 cycles pendant 3 heures à 0,5 Hz). </li><li> Exemple de programme dynamique de cisaillement de la séquence de déplacement (10% de compression de tare, 0,5625 mm (25% de l&#39;épaisseur) de l&#39;amplitude de la déformation de cisaillement dynamique, 0,5Hz) (Figure 5). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons conçu un dispositif de chargement qui est capable d&#39;appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à des constructions de l&#39;ingénierie tissulaire fabriqués pour la transplantation. L&#39;appareil peut être utilisé comme un bioréacteur pour la culture in vitro de biocomposites ingénierie ou comme un dispositif de contrôle de décrire les caractéristiques mécaniques du tissu natif ou après d&#39;autres traitements avant. Les sujets de périphériques conçus constructions de tiss...

Nous avons conçu un bioréacteur de chargement qui est capable d&#39;appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à un tissu biocomposites ingénierie fabriqués à la transplantation. Ce dispositif est principalement conçu comme un bioréacteur pour les remplacements d&#39;ingénierie pour le cartilage articulaire, il pourrait également être utilisé pour d&#39;autres tissus porteurs dans le corps humain. Notre motivation dans cette conception de bioréacteur découle de Drachman et Sokoloff 1, qui a fait l&#39;observation séminale de formation anormale du cartilage articulaire dans des embryons de poulet paralysés en raison de l&#39;absence de mouvement. De même, l&#39;exercice physique est essentiel pour le développement du muscle normal et en os. En accord avec ce concept, de nombreux groupes de recherche ont étudié comment les différents modes de stimuli physiques pendant la culture in vitro module les propriétés biochimiques et mécaniques des biocomposites cellule de biomatériaux et d&#39;explants de tissus 2-7. Le concept de l&#39;ingénierie tissulaire fonctionnelleimplique l&#39;utilisation in vitro de stimuli mécaniques pour améliorer les propriétés fonctionnelles du tissu, à savoir les propriétés mécaniques qui permettent au tissu pour résister à la contrainte attendue in vivo et la souche 8,9. De nombreuses études font état d&#39;une charge mécanique de l&#39;utilisation en termes de cisaillement et de compression pour stimuler constructions de cartilage d&#39;ingénierie pour les joints articulaires. 10 Mauck et al. Suggèrent que le chargement mécanique seul peut induire chondrogénèse des cellules souches mésenchymateuses même en l&#39;absence de facteurs de croissance qui sont considérés comme essentiels. Application de la charge mécanique intermittente comme la compression ou de cisaillement lors de la culture de tissus a été montré pour moduler cartilage et la formation osseuse, mais la dosimétrie optimale de chargement diffère selon les propriétés des tissus et cellules 11. La fonction la plus importante du cartilage articulaire est la capacité à résister à des forces de compression et de cisaillement à l&#39;intérieurl&#39;articulation, donc il doit avoir une grande compression et modules de cisaillement. Le manque de résistance mécanique fonctionnelle et ultrastructure physiologique dans le cartilage d&#39;ingénierie a abouti à la répartition sur le néo-cartilage in vivo et l&#39;échec des stratégies de remplacement de cartilage dans les articulations. Bien que la compression et de cisaillement ont été fréquemment démontré à moduler et améliorer la résistance mécanique des biocomposites du cartilage articulaire, une approche combinée est rare 6,12-15. Wartella et Wayne 16 a conçu un bioréacteur qui applique la tension et de compression pour produire des substituts de cartilage du ménisque. Waldman et al. 15 conçu un dispositif pour appliquer une compression et un cisaillement de chondrocytes cultivés dans un substrat de polyphosphate de calcium poreux. Bian et al. 17 a démontré des propriétés mécaniques correspondant cartilage natif avec la culture in vitro des chondrocytes canins adultes dans les gels et l&#39;application de deux axes mechanical chargement (compression déformation chargement et coulissant charge de contact). Le bioréacteur de chargement mécanique biaxial a été initialement conçu par Danielle Chu dans notre laboratoire avec l&#39;objectif global d&#39;induire des adaptations morphologiques dans les tissus du cartilage fabriqué constructions obtenues dans des modules de compression et de cisaillement élevées que celles actuellement disponibles 18. Nous croyons que cette recherche permettra d&#39;accroître considérablement notre compréhension plus large de la façon dont mechanotransduction peut être modulée à l&#39;ingénieur cliniquement tissus concernés.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><FORT>RÉACTIFS</fort></td></tr><tr><td>DMEM, Glycémie élevée, pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Type II</td><td>Sigma</td><td>CAS 39346-81-1</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine Glutamine 100X</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Invitrogen</td><td>041-95780</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A-2218</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acides aminés non essentiels 100x</td><td>Sigma</td><td>M-7145</td><td></td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma</td><td>P-5607</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Humain Transformer le facteur de croissance &#946 ; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Model 31 Capteur de pesage (1000 g)</td><td>Honeywell</td><td>AL311</td><td></td></tr><tr><td>Model 31 (1000 g)</td><td>Honeywell</td><td>AL311</td><td></td></tr><tr><td>Affichage monocanal</td><td>Honeywell</td><td>SC500</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Platine Travelmax linéaire encodée avec actionneur pas à pas</td><td>Thorlabs</td><td>LNR50SE/M</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de moteur pas à pas à deux canaux</td><td>Thorlabs</td><td>BSC102</td><td></td></tr><tr><td>Entraînement de moteur pas à pas trapézoïdal de 50 mm (2)</td><td>Thorlabs</td><td>DRV014</td><td></td></tr><tr><td>Localisateur cinématique réglable (4)</td><td>Thorlabs</td><td>KL02</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à angle droit de précision</td><td>Thorlabs</td><td>AP90/M</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage vertical</td><td>Thorlabs</td><td>LNR50P2/m</td><td></td></tr><tr><td>Planche d’essai en aluminium massif</td><td>Thorlabs</td><td>MB3030/M</td><td></td>Système de</tr><tr><td>coulée de gel avec plaques d’espacement de 1,5 mm et 0,75 mm </td><td>BioRad</td><td>#1653312 et #1653310</td><td></td>Disposable BioRad</tr><tr><td>, 5 mm</td><td>Miltex, Inc.</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon creux de 16 mm</td><td>Neiko Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques non traitées pour la culture tissulaire, 24 puits, fond plat</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Feuille de polysulfone ultra-résistante à l’humidité pour le chargement des plateaux</td><td>McMaster-Carr</td><td>86735k19</td><td>Usiné sur mesure</td></tr></tbody></table>

conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Nous avons conçu un dispositif de chargement qui est capable d&#39;appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à un tissu biocomposites ingénierie fabriqués à la transplantation. Alors que le dispositif fonctionne principalement comme un bioréacteur qui imite les contraintes mécaniques indigènes, il est également équipé d&#39;une cellule de charge pour fournir une rétroaction de force ou les essais mécaniques des constructions. Les sujets de périphériques conçus constructions de cartilage à biaxial chargement mécanique avec une grande précision de la dose de charge (amplitude et fréquence) et est assez compact pour tenir dans un incubateur de culture tissulaire standard. Il charge échantillons directement dans une plaque de culture de tissus, et de multiples formats de plaques sont compatibles avec le système. Le dispositif a été conçu en utilisant des composants fabriqués pour les applications laser à guidage de précision. Chargement bi-axial est réalisé en deux phases orthogonales. Les étapes ont une gamme de voyage de 50 mm et sont entraînés indépendamment par stepper actionneurs automobiles, contrôlés parun pas à pas conducteur en boucle fermée du moteur qui offre des capacités de micro-pas à pas, ce qui permet des tailles de pas de moins de 50 nm. Une polysulfone chargement cylindre est couplé à la plate-forme mobile bi-axiale. Mouvements des étapes sont contrôlées par Thor-laboratoires de technologie de positionnement avancé (APT) de logiciels. Le moteur pas à pas est utilisé avec le logiciel pour régler les paramètres de charge de fréquence et d&#39;amplitude à la fois de cisaillement et de compression indépendante et simultanée. Les informations de localisation sont fournies par des codeurs optiques linéaires qui ont une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 um et une résolution de 20 nm, traduisant une précision de positionnement inférieure à 3 um sur la totalité de 50 mm de course. Ces codeurs fournissent la rétroaction de position nécessaire à l&#39;électronique de commande pour assurer véritables capacités nanopositionnement. Afin d&#39;assurer le retour de force pour détecter le contact et d&#39;évaluer les réponses de chargement, une cellule de charge miniature de précision est positionné entre le plateau de chargement et le Movinplate-forme g. La cellule de charge a une précision élevée de 0,15% à 0,25% de la pleine échelle.

Le dispositif a été testée en utilisant des gels d&#39;agarose ensemencé avec 20 millions de cellules / ml et les chondrocytes cultivés en présence d&#39;uniaxiale (compression) ou bi-axiale (compression et de cisaillement) chargement mécanique. Chondrocytes porcins primaires ont été isolés du cartilage articulaire des porcs âgés de 2-4 mois. 5 mm de diamètre et des échantillons de 1,5 mm d&#39;épaisseur ont été cultivées dans 2 ml de milieu de culture chondrogénique défini (DMEM riche en glucose, 1% DE SON + Premix, 10...

Nous avons conçu un nouveau bioréacteur de chargement mécanique qui peut appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à une biocomposites du cartilage avant la transplantation dans un défaut de cartilage articulaire.

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de fabriquer des biocomposites fonctionnels, conçus par ingénierie tissulaire, destinés à la transplantation. Cela est réalisé en appliquant une contrainte mécanique précise, uniaxiale ou biaxiale, afin de fournir des stimuli biophysiques aux cellules au sein de composites biomatériaux tridimensionnels. Dans un deuxième temps, le bioréacteur est équipé d'une cellule de charge, qui assure un retour de force et permet des essais mécaniques des biocomposites pendant la sollicitation.Les prochains biocomposites sont cultivés sur une période de plusieurs semaines afin d'induire des modifications à grande échelle de la teneur biochimique et de la résistance des constructions. Les résultats obtenus montrent l'effet de différents types de sollicitations mécaniques, fondé sur les différences significatives de teneur en glycosaminoglycanes et en collagène, en tenant compte du support, de l'épaisseur et du module d'équilibre. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les effets du chargement biaxial sur le tissu cartilagineux génie-biologique, elle peut également être appliquée à d'autres tissus soumis à de faibles charges, tels que l'os et le tendon, démontrant ainsi la procédure réalisée par Amy May et Rob Stefani de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, installez un bioréacteur biaxial comme illustré ici.La base du bioréacteur est composée d'une plaque en aluminium mesurant 25 centimètres sur 30 centimètres sur 12,5 millimètres. Les options de positionnement variables permettent un montage flexible de plaques de culture tissulaire de différentes formes et tailles. Ensuite, assurez-vous que les plateaux sont fixés sur la base de manière que le plateau horizontal exerce un cisaillement dynamique en oscillant uniquement selon l'axe des x.Et la plateforme verticale assure une compression dynamique en oscillant uniquement selon l'axe Z. L'étape suivante consiste à fabriquer une plaque de chargement personnalisée en polysulfone. Le polysulfone est un matériau idéal en raison de sa biocompatibilité, de sa facilité d'usinage et de sa facilité de stérilisation.Fixez la plaque à la plateforme mobile biaxiale à l’aide d’un support d’angle droit usiné de précision. Les butées cinématiques fixées sur la plaque de base sont équipées de vis de réglage fin permettant un alignement précis des plaques de culture, impossible à obtenir manuellement. Ensuite, fixez l’actionneur moteur pas à pas à chaque plateforme, qui fournira une rétroaction de position au logiciel.Les actionneurs à moteur pas à pas présentés ici ont une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 micromètre et une résolution de 20 nanomètres, ce qui se traduit par une précision inférieure à trois micromètres sur une course de 50 millimètres. Contrôlez les mouvements des plateaux à l’aide du logiciel de technologie de positionnement avancé de Thor Labs. Le logiciel commande le moteur pas à pas afin de régler indépendamment et simultanément les paramètres de charge en fréquence et en amplitude, tant en cisaillement qu’en compression. Ensuite, placez une cellule de charge miniature de cinq livres entre la platine de chargement et la plateforme mobile afin d’assurer la rétroaction en force nécessaire à la détection du contact entre la platine et les constructions, ainsi qu’à l’évaluation des réponses sous charge.Veillez à ce que la cellule de charge ait une haute précision de 0,15 % à 0,25 % de la pleine échelle, et que l'unité d'affichage de la cellule de charge dispose d'un port RS 232 permettant la collecte de données sur un ordinateur. Afin d'immobiliser les échantillons dans les puits d'une plaque de 24 puits, préparez un moule pour un gel d'agarose de 1,5 millimètre d'épaisseur à l'aide d'un système de coulée de gel équipé de cales de 1,5 millimètre. Une fois assemblé, versez une solution de 4 % d'agarose entre les deux plaques de verre et laissez le mélange refroidir.Ensuite, retirez la plaque supérieure et découpez un disque de 16 millimètres de diamètre dans la gélose. Pour chaque puits, prélèvement sur chaque disque, percez un trou destiné à accueillir l'échantillon. Placez les disques ainsi préparés dans les puits d'une plaque de 24 puits.Ensuite, appuyez fermement pour insérer des constructions tissulaires de 2,25 millimètres d'épaisseur et de 5 millimètres de diamètre dans chacun des supports de gel. L'échantillon doit dépasser par le haut de chaque support d'aérosol. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de milieu de culture dans chaque puits et remplacez le couvercle.Ensuite, remettre la plaque dans l'incubateur jusqu'au moment du chargement des échantillons. Pour commencer le chargement mécanique des constructions tissulaires, fixer la plaque en aluminium à la cellule de charge et attacher en permanence un ensemble en platine stérile à la platine verticale. L'incubateur doit fonctionner à faible humidité afin d'éviter une défaillance de l'appareil.Ensuite, allumez le contrôleur du moteur pas à pas et l'ordinateur. Ouvrez le programme utilisateur Advanced Positioning Technology et accédez à l'onglet de commande graphique sur les deux écrans. Appuyez sur le bouton de mise à zéro pour ramener les deux moteurs pas à pas à la position zéro, définie comme étant la position la plus haute et la plus à droite.Préparez les échantillons pour le chargement en retirant une partie du milieu de chaque puits afin d'éviter un débordement lors du chargement mécanique. Ensuite, placez la plaque 24 puits dans le bioréacteur et alignez soigneusement la plaque avec le plateau à l'aide de quatre dispositifs de positionnement cinématiques réglables ; assurez-vous de bien aligner la plaque. Effectuez l'alignement avec l'avant de la base du bioréacteur dans l'onglet de contrôle graphique.Réglez manuellement avec précision. Ajustez l'alignement en cliquant sur la boîte de position pour la déplacer horizontalement. Lorsque la plaque est alignée avec les puits de la plaque, commencez à abaisser la plaque jusqu'au premier contact avec les échantillons.Une fois la position de départ atteinte, accédez à l'onglet du séquenceur de mouvements et chargez la séquence de mouvements souhaitée en appuyant sur charger ou créez votre propre programme comme décrit dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Ensuite, appuyez sur exécuter pour démarrer le programme. Le logiciel dirigera les moteurs afin d'appliquer le régime de conditionnement souhaité aux échantillons.Lorsque le programme est terminé, soulevez manuellement la plaque afin qu'elle dépasse le haut de la plaque de culture tissulaire. Ensuite, retirez la plaque à 24 puits du bioréacteur et remplacez le milieu. Enfin, retirez soigneusement le platine de la cellule de charge, puis éteignez les instruments.L'utilisation du bioreacteur biaxial décrit dans cette vidéo a eu un effet significatif sur la quantité de glycosaminoglycanes et de collagène sécrétée par les cellules au sein de constructions issues du génie tissulaire. L'entraînement a eu lieu cinq jours par semaine pendant trois heures par jour, avec une déformation en compression de 10 % et une déformation en cisaillement de 5 % à un hertz. Après 30 jours de culture, la quantité de glycosaminoglycanes et de collagène sécrétée par les chondrocytes soumis à une sollicitation biaxiale était significativement plus élevée que celle des échantillons témoins. Une sollicitation uniaxiale n'a augmenté significativement que la quantité de glycosaminoglycanes.De plus, la sollicitation biaxiale a produit des constructions plus épaisses, mais n'a montré aucun effet sur l'élasticité des constructions. À l'aide de ce protocole de dosage, après 30 jours de conditionnement et de culture, des sections transversales des constructions tissulaires ont été colorées avec des marqueurs typiques du cartilage, notamment le safran bleu o et le collagène de type II. Les trois groupes différents comprennent l'absence de conditionnement, la sollicitation uniaxiale et la sollicitation biaxiale.Alors que tous les groupes présentent une coloration positive au Bleu d'alium et à la Safranine O, les échantillons chargés biaxialement montrent des quantités accrues de collagène de type II par rapport aux échantillons non chargés et à ceux chargés uniaxialement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'appliquer des charges uniaxiales ou biaxiales sur des constructions tissulaires ingénierisées en cours de développement.

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