Isolation, traitement et analyse des cellules gingivales murins

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de traiter précisément la gencive murine en vue d'une analyse ultérieure par cytométrie en flux. Cela est réalisé en isolant d'abord chirurgicalement la gencive de manière méticuleuse. Ensuite, le tissu excisé est traité pour générer une suspension monocellulaire.

Ensuite, une coloration extracellulaire et intracellulaire avec des anticorps est réalisée. Enfin, l'échantillon est analysé par cytométrie en flux. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant différentes populations cellulaires dans la gencive ainsi que les modifications cellulaires survenant dans le tissu après une agression immunologique, grâce à l'analyse par cytométrie en flux.

L'avantage principal de cette technique, par rapport aux méthodes comme la chimie en OC ou la monofluorescence, est qu'il s'agit d'une méthode rapide et simple permettant d'analyser un grand nombre de cellules, offrant ainsi la possibilité d'analyser simultanément plusieurs variables, ainsi que de trier différents types cellulaires pour des expériences ultérieures. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que la manière dont les micro-organismes influencent l'homéostasie gingivale et son lien avec la perte osseuse induite par l'inflammation dans un modèle expérimental de parodontite. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons commencé à étudier le rôle des cellules RI durant la parodontite. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la technique d'accélération du gène GVA est difficile à maîtriser en raison de la petite taille et de l'accès relativement peu pratique à la MU une J gva.

Pour commencer, préparez les solutions de milieu et les instruments chirurgicaux stérilisés conformément au protocole décrit dans le texte. Après avoir euthanasié une souris selon les méthodes approuvées par le comité de soins et d'utilisation des animaux de votre établissement, utilisez des ciseaux droits effilés pour inciser de chaque côté de la cavité buccale, y compris les joues et le rame mandibulaire, puis abaissez le mandibule en orientant les ciseaux perpendiculairement au plan du palais osseux. Incisez les tissus mous et durs selon une ligne imaginaire située à un millimètre derrière les troisièmes molaires.

Ensuite, réalisez une incision dans les tissus mous et durs, à deux millimètres en arrière des incisives. Puis abaissez la partie antérieure de la bouche afin d'exposer la cavité nasale, en maintenant les ciseaux parallèles au palais. Insérez une lame dans la cavité nasale et utilisez l'autre pour pratiquer une incision au niveau du vestibule, en coupant jusqu'à l'incision postérieure.

Répétez l'incision de l'autre côté du maxillaire pour le détacher du crâne. Ensuite, sectionnez-le au milieu et retirez le tissu palatal de chaque hémimaxillaire afin d'exposer l'os alvéolaire à l'aide d'abs et de pinces. Détachez les tissus gingivaux du bord antérieur et placez-les dans une plaque contenant du PBS et 2 % de sérum de veau fœtal (FCS) pour le traitement de la gencive, puis transférez-les dans une boîte de culture contenant un millilitre de PBS, deux milligrammes par millilitre de collagénase de type deux et un milligramme par millilitre de DNAs.

Tranchez à l’aide d’un scalpel stérile de numéro 15. Hachez finement le tissu avant de le transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les cellules tissulaires restantes depuis la plaque avec un millilitre de P-B-S-F-C-S et transférez-les dans le tube.

Incuber le tissu dans un incubateur rotatif préchauffé à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant 20 minutes. Ajouter ensuite 20 microlitres de EDTA 0,5 molaire et incuber pendant 10 minutes supplémentaires. Ensuite, ajouter du P-B-S-F-C-S jusqu'à un volume final de 12 millilitres et centrifuger l'échantillon à quatre degrés Celsius, à 400 × g pendant huit minutes.

Après avoir éliminé le surnageant, resuspendre les cellules dans deux millilitres de P-B-S-F-C-S. Filtrer l'échantillon à travers un tamis cellulaire de 70 microns après avoir centrifugé le flux passant à quatre degrés Celsius et 320 fois G pendant cinq minutes. Resuspendre les cellules dans 300 microlitres de P-B-S-F-C-S.

Enfin, compter les cellules en travaillant sous une hotte à température fraîche et avec les lumières éteintes dans un volume total de 100 microlitres, ajouter 0,2 à 0,5 microgrammes de chaque anticorps sélectionné par un fois 10 à la sixième cellules et vortexer brièvement. Après avoir incubé les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes à l’abri de la lumière, ajouter deux millilitres de P-B-S-F-C-S et centrifuger à 320 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour fixer les cellules, aspirer le surnageant, puis, tout en vortexant, les resuspendre en ajoutant goutte à goutte 500 microlitres de BD cyto perms froid.

Incubez les tubes à quatre degrés Celsius à l'obscurité pendant 40 minutes après le vortex d'incubation. Ajoutez ensuite brièvement un millilitre de tampon BD Perm Wash et centrifugez à 800 × g à quatre degrés Celsius pendant sept minutes. Après avoir répété le lavage, aspirez tout sauf 300 microlitres du tampon de lavage.

Ensuite, pour colorer les cellules de manière intracellulaire dans un volume total de 100 microlitres, ajouter un microgramme de chaque anticorps sélectionné par un fois 10 à la puissance six cellules. Vortexer brièvement et incuber à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. Après avoir lavé les cellules deux fois comme précédemment et avoir retiré tout le surnageant, resuspendre les cellules dans 300 microlitres de tampon de perméabilisation BD froid et frais.

Après un vortex bref, filtrer la suspension dans des tubes fax. Conserver les tubes sur glace ou au réfrigérateur à l’obscurité jusqu’au moment d’effectuer l’analyse fax. Cellules gingivales regroupées à partir de deux souris naïves.

Ont été réalisées sur un cytomètre de flux LSR deux et analysées à l'aide du logiciel FlowJo. Les graphiques de dispersion latérale et de dispersion avant présentés ici montrent la répartition des cellules. La stratégie de sélection permettant d'identifier les lymphocytes, les monocytes, les cellules dendritiques et les granulocytes est indiquée à des fins de comparaison.

Cette figure représente un tracé FACS illustrant des cellules gingivales purifiées à partir de souris infectées par P. gingivalis, 21 jours après une gavage oral dans le cadre d'une parodontite expérimentale. Une augmentation des diverses populations de cellules immunitaires peut être facilement détectée chez les souris infectées par rapport aux souris naïves présentées ici. Les cellules immunitaires présentes dans la gencive traitée sont identifiées en sélectionnant les cellules exprimant le marqueur hématopoïétique CD45.

Ces cellules ont été davantage séparées en lymphocytes T CD3 positifs, illustrés sur cette figure. Les neutrophiles ont également été identifiés selon l'expression des molécules LY6G et CD11b. Enfin, les cellules de Langerhans et la sous-population épithéliale des cellules dendritiques ont été identifiées en ciblant les cellules positives pour la classe II du CMH et pour CD11c, ainsi que l'expression de EpCAM et de l'antigène RIN (CD207). Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures et demie à cinq heures si elle est effectuée correctement selon cette procédure.

D'autres méthodes, telles que la PCR en temps réel, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'expression génique au niveau de la cellule unique, après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie pour explorer la réponse locale dans la VGA gingivale face à toute agression dans le domaine de la recherche parodontale. Cette technique nous a permis d'élucider le rôle des cellules immunitaires et non immunitaires de la VGA gingivale dans la pathogenèse de la parodontite expérimentale.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et de traiter les VAG urinaires afin d'obtenir une suspension monocellulaire, qui sera ensuite soumise à une coloration virale intracellulaire et extracellulaire pour une analyse par cytométrie en flux.