Accélération de diabète de type 1 chez la souris par induction transfert adoptif de lymphocytes CD4 + T Cells diabétogéniques

L'objectif général de cette procédure est d'induire rapidement un diabète de type 1 chez des souris en transférant des lymphocytes T diabétogènes provenant de souris transgéniques vers des souris dépourvues de lymphocytes T et B endogènes. Commencez par prélever les spléens et les ganglions lymphatiques des souris donneuses, puis purifiez les lymphocytes T positifs pour CD4. Ensuite, transférez de façon adoptive les lymphocytes T donneurs purifiés vers des souris receveuses non obèses diabétiques.

Ensuite, surveiller les souris receveuses pour le développement du diabète de type 1. En définitive, ce protocole peut être utilisé pour étudier la pathogenèse du diabète et pour explorer des interventions thérapeutiques par rapport à d'autres méthodes. Le principal avantage de cette technique, consistant à transférer des lymphocytes T CD4 positifs BDC 2.5 dans des receveurs non immunodéprimés, est le développement rapide et reproductible du diabète de type 1.

Pour les donneurs de cellules T CD4+ diabétogènes, utilisez des souris femelles BDC 2.5 prédiabétiques âgées de six semaines, dont l'absence de diabète aura été confirmée par mesure de la glycémie urinaire. Pour retirer la rate et les ganglions lymphatiques, imbibez le pelage d'éthanol à 70 %, puis incisez la peau et la repoussez jusqu'à l'exposition des muscles des membres antérieurs. Près de la base des membres antérieurs, deux ganglions lymphatiques de chaque côté doivent être visibles. Saisissez délicatement chaque ganglion lymphatique avec de petites pinces et retirez-le en sectionnant le tissu conjonctif.

Ensuite, faites une incision d'un pouce dans le péritoine à l'aide des petites ciseaux. Saisissez maintenant délicatement la rate en son centre. Retirez soigneusement le tissu conjonctif et la graisse adjacente.

Ensuite, retirez la rate, le tissu adipeux et les ganglions lymphatiques dans 10 millilitres de DMEM sur glace. À l’aide de l’extrémité du piston d’une seringue stérile de 10 millilitres, pressez doucement les organes lymphoïdes à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres. Pour obtenir une suspension monocellulaire.

Rincez chaque passoire avec un millilitre de DMEM plusieurs fois afin d'optimiser la récupération des cellules. Ensuite, transférez les cellules recueillies dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 400 G pendant sept minutes. À température ambiante, remettez en suspension le culot cellulaire dans trois millilitres de tampon CK.

Incubez maintenant chaque échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Pour lysér les globules rouges, ajoutez maintenant 12 millilitres de DMEM et faites précipiter les cellules par centrifugation. Lavez le culot cellulaire une fois dans 10 millilitres de DMEM.

Ensuite, nous suspendons les cellules dans cinq millilitres de tampon de marquage, et utilisons un microscope à contraste de phase et un hémocytomètre pour dénombrer le nombre de cellules viables. Retirer maintenant environ un fois 10 de six cellules par contrôle de marquage. Marquer également les cellules avec des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre le CD quatre positif afin de trier les lymphocytes T transgéniques non activés.

Incuber tous ces échantillons à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière pendant 30 minutes. Laver ensuite les cellules avec un volume de tampon fax équivalent à trois fois le volume de marquage, et resuspendre les cellules dans le tampon fax à une concentration d'un à deux fois 10 puissance sept cellules par millilitre pour l'échantillon de tri, et à 300 microlitres pour les témoins de simple marquage. Ensuite, faire passer l'échantillon cellulaire à travers un tube à embout filtreur de 35 micromètres.

Pour éliminer les agrégats cellulaires, soumettez les échantillons à un trieur cellulaire manipulé par un opérateur qualifié. Prévoyez environ trois heures, y compris le temps de mise en place, pour trier environ 1,5 × 10⁸ cellules T transgéniques naïves CD4 positives au total. Vous pouvez vous attendre à environ 2,5 × 10⁶ cellules par souris, et la vitesse de tri sera d’environ 2 × 10⁴ événements par seconde sur un appareil tel que le BD Fox Aria. Récupérez les cellules triées dans trois millilitres de DMEM.

Enregistrez le nombre absolu de cellules triées et centrifugez-les pendant sept minutes. À 400 G, nous suspendons les culots cellulaires dans du sérum physiologique tamponné au phosphate stérile pour le transfert adoptif de lymphocytes T. À l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 18, resuspendez délicatement les lymphocytes T positifs pour le CD4 purifiés par fax.

Chargez la seringue d'un millilitre, puis, en prévision de l'injection, fixez une aiguille de calibre 27 et demi à la seringue. Immobilisez les souris réceptrices présentant un nœud coulant et nettoyez leur queue avec de l'éthanol à 70 % pour désinfecter le site d'injection. Ensuite, injectez une fois dix puissance six cellules T CD4 positives purifiées par souris dans l'une des veines latérales de la queue.

Lorsque vous effectuez vos injections intraveineuses par la queue, assurez-vous de ne pas forcer sur le piston. Si l'aiguille est correctement positionnée dans la veine, l'injection doit s'effectuer presque sans résistance. Cinq jours après le transfert des lymphocytes T, surveillez quotidiennement les souris réceptrices pour l'apparition d'un diabète de type 1.

Mesurez le glucose urinaire à l'aide de bandelettes réactives conformément aux instructions du fabricant. Notez que les souris présentant deux lectures consécutives de glucose urinaire supérieures à 250 milligrammes par décilitre sont considérées comme diabétiques. Dans une expérience typique, chaque souris donneuse BDC 2.5 fournit environ deux fois et demie 10 puissance 6 de cellules T naïves transgéniques CD4 positives après tri cellulaire ; après transfert adoptif de cellules T CD4 positives diabétogènes, les souris ont été surveillées pour les concentrations de glucose urinaire.

Le transfert adoptif d'un petit nombre de cellules provenant de souris donneuses BDC 2.5 a induit un diabète de type 1 chez tous les receveurs non skid d'ici le 11e jour. Lorsqu'elle est correctement réalisée, cette technique peut être effectuée en environ huit heures, de la récolte des organes au transfert des lymphocytes T.