Accélération de diabète de type 1 chez la souris par induction transfert adoptif de lymphocytes CD4 + T Cells diabétogéniques

L’objectif global de cette procédure est d’induire rapidement le diabète de type 1 chez la souris en transférant des lymphocytes T diabétogènes de souris transgéniques vers des souris dépourvues de lymphocytes T et B endogènes. Commencez par prélever la rate et les ganglions lymphatiques des souris donneuses et purifier les cellules T CD-quatre positives. Ensuite, transférez les lymphocytes T purifiés du donneur dans des souris receveuses non dérapantes.

Ensuite, surveillez les souris receveuses pour le développement du diabète de type 1. En fin de compte, ce protocole peut être utilisé pour étudier la pathogenèse du diabète et pour étudier les interventions thérapeutiques par rapport à d’autres méthodes. Le principal avantage de cette technique de transfert de cellules T positives BDC 2.5, CD 4 chez des receveurs non dérapants est le développement rapide et reproductible du diabète de type 1.

Pour les donneurs de la CD diabétique, quatre lymphocytes T positifs utilisent des souris femelles prédiabétiques BDC 2,5 âgées de six semaines qui ont été déterminées comme étant exemptes de diabète par mesure de la glycémie dans l’urine. Pour enlever la rate et les ganglions lymphatiques, trempez la fourrure avec de l’éthanol à 70 %, puis coupez la peau, rétractez la peau jusqu’à ce que les muscles des membres antérieurs soient exposés. Près de la base des membres antérieurs, deux ganglions lymphatiques de chaque côté doivent être visibles Saisissez soigneusement chaque ganglion lymphatique avec une petite pince à épiler et retirez-le en coupant le tissu conjonctif.

Ensuite, faites une incision d’un pouce dans le péritoine à l’aide des petits ciseaux. Maintenant, saisissez doucement la rate au centre. Coupez soigneusement le tissu conjonctif et la graisse attachée.

Ensuite, retirez la rate, la dentelle, la rate et les ganglions lymphatiques dans 10 millilitres de DMEM sur glace. Avec l’extrémité d’un piston de seringue stérile de 10 millilitres, appuyez doucement sur les organes lymphoïdes à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres. Pour obtenir une suspension à cellule unique.

Rincez chaque passoire avec un millilitre de DMEM plusieurs fois pour maximiser la récupération des cellules. Transférez ensuite les cellules collectées dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 400 G pendant sept minutes. À température ambiante, remettre en suspension la pastille de cellule dans trois millilitres d’un tampon CK.

Maintenant, incubez chaque température ambiante pendant cinq minutes. Pour lyser, les globules rouges ajoutent maintenant 12 millilitres de DMEM et granulent les cellules par centrifugation. Lavez la pastille cellulaire une fois dans 10 millilitres de DMEM.

Ensuite, nous suspendons les cellules dans cinq millilitres de tampon de coloration fact, et utilisons un microscope à contraste de phase et un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules viables. Maintenant, retirez environ une fois 10 des six cellules par contrôle de coloration. Colorez également les cellules avec des anticorps monoclonaux de souris pour trier les cellules T transgéniques non activées et 4 positives.

Incuber tous ces échantillons à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes. Lavez maintenant les cellules avec trois fois le volume de coloration de la mémoire tampon de télécopie et suspendez à nouveau les cellules dans la mémoire tampon de télécopie une à deux fois : 10 à sept cellules par millilitre pour le tri de l’échantillon et 300 microlitres pour les contrôles de coloration unique. Ensuite, faites passer l’échantillon de cellule à travers un tube de capuchon de crépine de 35 micromètres.

Pour éliminer les amas de cellules, traitez les échantillons pour un trieur de cellules avec un opérateur formé Prévoyez environ trois heures, y compris le temps de configuration, pour trier environ 1,5 fois 10 au huitième total de quatre lymphocytes T positifs pour CD naïfs transgéniques. Vous pouvez vous attendre à environ 2,5 fois 10 des six cellules par souris et le taux de tri sera d’environ deux fois 10 des quatrièmes événements par seconde sur un instrument tel que le BD Fox Aria. Rassemblez les cellules triées dans trois millilitres de DMEM.

Enregistrez le nombre absolu de cellules triées et centrifugez-les pendant sept minutes. À 400 G, nous suspendons les pastilles cellulaires dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate pour le transfert adoptif de cellules T. À l’aide d’une seringue d’un millilitre insérée dans une aiguille de calibre 18, remettre doucement en suspension le CD purifié par télécopieur à quatre lymphocytes T positifs.

Chargez la seringue d’un millilitre puis, en préparation de l’injection, fixez une aiguille de calibre 27 points et demi à la seringue. Maîtrisez les souris qui ont reçu un patin à nœuds et essuyez leur queue avec de l’éthanol à 70 % pour désinfecter le site d’injection. Ensuite, injectez une fois 10e des six CD purifiés de quatre lymphocytes T positifs par souris dans l’une ou l’autre des veines latérales de la queue.

Lorsque vous faites vos injections dans la veine de la queue, assurez-vous de ne pas forcer le piston. Si l’aiguille est réellement dans la veine, votre injection devrait se produire avec presque aucune résistance à partir de cinq jours après le transfert de cellules T. Surveillez quotidiennement les souris réceptrices du patin pour le développement du diabète de type 1.

Mesurez le glucose urinaire à l’aide de bandelettes réactives selon le fabricant et les instructions. Notez que les souris avec deux lectures consécutives de glucose urinaire supérieur à 250 milligrammes par décilitre sont considérées comme diabétiques. Dans une expérience typique, chaque souris donneuse de BDC 2.5 produit environ deux fois et demie 10 des six cellules T transgéniques naïves de CD quatre positifs après le tri cellulaire après le transfert adoptif de cellules de CD diabétogène quatre cellules T positives, les souris ont été surveillées pour les concentrations de glucose dans l’urine.

Le transfert adoptif d’un petit nombre de cellules à partir de souris donneuses BDC 2.5 a induit un diabète de type 1 chez tous les receveurs non skid au 11e jour. Lorsqu’elle est bien faite, cette technique peut être réalisée en environ huit heures, du prélèvement d’organe au transfert de cellules T.