Name: Application dun In vitro DNA Assay Protection de bien visualiser les propriétés de médiation du stress de la protéine Dps (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Découvrez l'essai de protection de l'ADN in vitro pour visualiser l'effet protecteur de la protéine Dps contre les dommages oxydatifs. Cette méthode permet d'étudier le stress oxydatif chez E. coli.

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Nous sommes reconnaissants à Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, et Kourosh Honarmand Ebrahimi pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par un financement de démarrage de l&#39;Université de Technologie de Delft.

1. Dps Expression et purification L&#39;obtention d&#39;une protéine de haute pureté est une première étape essentielle pour le dosage de l&#39;ADN-protection. Purification de la protéine Dps peut être réalisée dans 4 à 5 jours. <ol><li> Transformer une souche déficiente en protéase de E. coli (comme BL21 (DE3) pLysS) avec un vecteur pET (tels que pET17) dans lequel la séquence codant pour la protéine Dps a été cloné. </li><li> Morts les cellules transformées en bouillon sur des plaques d&#39;agar Luria (LB) contenant des antibiotiques appropriés (comme l&#39;ampicilline et le chloramphénicol pour les exemples fournis dans 1.1). Incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Inoculer une seule colonie de la plaque dans 30 ml de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés. Incuber une nuit à 37 ° C tout en agitant à 200-250 rpm. </li><li> Inoculer 2 x 1 de milieu LB L contenant les antibiotiques appropriés avec 10 ml de la culture de la nuit. Croître à 37 ° C, tout en agitant, à 600 OD </sub&gt; d&#39;environ 0,6. (Culture de cellules à OD augmente le rendement en protéines plus élevée, sans compromettre sensiblement la pureté du produit final.) Induire l&#39;expression de Dps en ajoutant IPTG à une concentration de 0,3 mM, et incuber à 37 ° C pendant 3-4 heures tout en agitant. </li><li> Récolte des cellules par centrifugation à 6000 g pendant 15 min. Reprendre les culots de cellules dans 7,5 ml de DEAE tampon A (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,1 mM EDTA) par litre de culture cellulaire induite. Les échantillons peuvent être congelés dans l&#39;azote liquide et conservés à -80 ° C, si désiré. La procédure peut ensuite être poursuivie par décongélation les échantillons dans un bain d&#39;eau à 4 ° C. </li><li> Ajouter un mélange d&#39;inhibiteurs de la protéase (tels que les inhibiteurs de protéase ensemble Calbiochem III, à 0,167 pi par ml de suspension cellulaire) à la suspension de cellules à prévenir la dégradation de Dps surexprimés. </li><li> Préparer extrait acellulaire en utilisant une presse française. Premier de la presse française avec 20 ml de DEAE tampon A (si vous utilisez un modèle à flux continu), puis perturbationst l&#39;échantillon deux fois à 20 kpsi. Centrifuger le lysat à 30.000 g pendant 35 min à 4 ° C pour clarifier des particules insolubles, et récupérer le surnageant. Le surnageant peut ensuite être congelé à l&#39;azote liquide et stockés à -80 ° C, si on le désire. </li><li> Equilibrer un ml de DEAE Sepharose 30 CL-6B avec DEAE tampon A, en utilisant une FPLC. Exécuter un tampon à travers la colonne de 1-2 ml / min avec une pression maximale de 0,2 MPa-dessus du fond. Charger l&#39;extrait acellulaire sur la colonne, et de commencer à recueillir le flux continu une fois le signal OD 280 commence à augmenter au-dessus de base. Laver la colonne avec DEAE tampon A jusqu&#39;à ce que la valeur de DO 280 retourne à la normale, tandis que la collecte en permanence le flux continu. Le flux continu devrait contenir la majorité de la protéine Dps, sans trace d&#39;ADN lié. Laver la colonne avec 100% de tampon B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M de NaCl, 0,1 mM EDTA). Cet éluat contient complexes Dps-ADN ainsi que d&#39;autres protéines et peut être jeté. </li><li> Retirer annoncecontaminant conditionnelle protéines par précipitation au sulfate d&#39;ammonium. Déterminer le volume de mise en commun accréditives. Lentement (pendant une période de 10 à 20 min) ajouter du sulfate d&#39;ammonium petit-grain sec à 62% de saturation (390 mg par ml de solution) à 4 ° C, sous bonne agitation. Agiter le mélange pendant 20 à 30 min de plus un après l&#39;ajout de la dernière partie du sulfate d&#39;ammonium afin d&#39;assurer l&#39;équilibrage complet. Dps restent solubles, tandis que les protéines contaminantes se précipiter hors de la solution. </li><li> Éliminer les protéines précipitées par centrifugation à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C et sauver le surnageant. </li><li> Lentement, ajouter un 227 mg de sulfate d&#39;ammonium supplémentaire par ml de surnageant pour atteindre 94% de saturation et remuer pendant 20-30 min pour assurer l&#39;équilibrage complet. Dps précipités à cette concentration élevée en sel et peuvent être collectées par centrifugation à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C. Dps seront dans le culot, le surnageant peut être jeté. Le culot peut être conservé à -80 ° C si desIRED. </li><li> Reprendre le Dps culot contenant en Resuspension Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1 mM EDTA). Réglez le volume de l&#39;échantillon à 2,5 ml. </li><li> Échange tampon pour éliminer le sulfate d&#39;ammonium en utilisant une colonne de filtration sur gel PD-10. Equilibrer le lit de gel avec 25 ml Resuspension Buffer. Appliquer le 2,5 ml de Dps échantillon au sommet de la colonne PD-10 et laisser tremper po Jeter l&#39;effluent à travers. Recueillir Dps en éluant avec 3,5 ml Resuspension Buffer. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon de tampon échangé à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les composants insolubles et diluer avec 6-10 ml de tampon de dilution (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) pour s&#39;assurer que le concentration en sel est suffisamment faible pour Dps de se lier à la colonne de Sepharose SP. Échantillons particulièrement concentrées de Dps peuvent devenir moins soluble lors de la dilution dans un tampon inférieur sel, comme en témoigne trouble du liquide, mais peuvent être complètement resolubilisé par l&#39;ajout d&#39;un petit Amount de 5 solution de NaCl M (un 10-20 mm supplémentaire). </li><li> Equilibrer une colonne de 30 ml SP Sepharose Fast Flow avec SP tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM, 0,1 mM EDTA). Exécuter un tampon à travers la colonne à 1,5-2 ml / min avec une limite de pression de 0,3 MPa-dessus du fond. Charger l&#39;échantillon sur la colonne. Laver avec SP tampon A jusqu&#39;à ce que la DO 280 déclarations de traces à l&#39;état initial, et jeter le accréditives. Exécuter un gradient linéaire de 150 ml de 0 à 100% de tampon B, tout en collectant des fractions de 2 ml. PDD élution dans un pic aigu à environ 50% de B, si variation de 10% est possible. </li><li> Exécutez les fractions d&#39;élution sur un gel à 15% SDS-PAGE, et vérifier la contamination de l&#39;ADN en mesurant le rapport DO 260 / DO 280 à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. Le gel ne doit montrer une bande autour de 19 kDa, et la DO 260 / DO 280 est généralement autour de 0,7. Piscine fractions les plus pures dps. Utilisez un filtre centrifuge (comme l&#39;unité de filtration Ultra Amicon) avec un10K poids moléculaire de coupure de concentrer les Dps et échanger dans un tampon de stockage (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM). Aliquote les Dps purifiés, et congeler dans l&#39;azote liquide pour le stockage à -80 ° C. </li></ol> 2. Essai de protection de l&#39;ADN Le test implique plusieurs étapes sensibles au facteur temps et doit être chronométré à la seconde pour obtenir des résultats reproductibles. Beaucoup d&#39;ingrédients et les étapes de pipetage sont impliqués, donc une table de pipetage (voir tableau 1) est conseillé de garder une trace des étapes et des volumes. Le temps total nécessaire pour le dosage est de pas plus de 3 heures. <ol><li> Mesurer 30 ml d&#39;eau dans un flacon étanche à l&#39;air; rincer l&#39;eau avec du N 2 pendant 10 minutes (à l&#39;aide de deux aiguilles de seringue, une dans le fluide, l&#39;une au-dessus de celle-ci) pour éliminer l&#39;oxygène de la solution. Ajouter 0.0168 g FeSO4 • 7H 2 O à l&#39;eau pour obtenir une solution mère de 2 mm. Sceller le flacon et rincer avec de l&#39;azote pendant 5 minutes de plus, puis mélanger. La solution doit êtreclair, si tout soupçon de jaune est détectable, préparer une nouvelle solution de fer. </li><li> Faire une solution 100 mM H 2 O 2 (10,87 pi de 9.2MH 2 O 2 dans 1 ml d&#39;eau); garder sur la glace et à l&#39;abri de la lumière en l&#39;enveloppant dans du papier d&#39;aluminium. Utilisez uniquement pendant environ 1-2 heures après la préparation raison de la désintégration spontanée. Le stock de peroxyde d&#39;hydrogène est également soumis à une panne, qui peut être partiellement atténué par un stockage approprié (dans l&#39;obscurité, à 4 ° C). Des contrôles réguliers de la concentration des actions en mesurant les 240 OD sont recommandés. </li><li> Dégeler une aliquote de Dps purifiée rapidement dans un bain d&#39;eau à température ambiante et garder sur la glace. Centrifuger pendant 10 secondes à 4000 g dans une table picocentrifuge aux agrégats de précipité. Mesurer la concentration après centrifugation à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre (DO 280 = 1,547 indique une concentration de 100 Dps monomères pM). </li><li> Diluer l&#39;ADN linéaire à partir du stock de haute concentration en utilisant 12x tampon de réaction (1M MOPS-KOH pH 7,0, NaCl 1 M) à une concentration de 100 ng / ul. ADN linéaire est utilisée pour rendre plus facile la quantification, mais l&#39;ADN plasmidique peut être utilisé aussi bien. </li><li> 1 ul du mélange ADN-tampon dans un tube PCR. Ajouter suffisamment d&#39;eau dans le mélange réactionnel de telle sorte que le volume final de la réaction (moins SDS) sera de 12 ul. Ce montant doit être calculé à l&#39;avance en utilisant le tableau de pipetage. Ajouter Dps à une concentration de dodécamère finale de 3 um. Incuber pendant 15 min à température ambiante pour permettre Dps de se lier à l&#39;ADN. </li><li> Ajouter suffisamment de solution à 2 mM FeSO4 pour atteindre la concentration souhaitée. Une expérience typique utilise une gamme de concentrations de 0 à 1 mM FeSO4. Des concentrations plus élevées provoqueront plus grande dégradation de l&#39;ADN mais peuvent également conduire à la formation de fer précipite dans le mélange réactionnel. Rapidement ajouter 1 pl de la solution à 100 mm H 2 O 2 (à une concentration finale de 10 mM), et incuber à température ambiante pendant 5 min pour permettre à l&#39;FentonMédiée par réaction de dégradation à prendre place. </li><li> Ajouter 0,8 l de 20% de SDS (dodécylsulfate de sodium). Mélanger et incuber à 85 ° C pendant 5 min à perturber les complexes Dps-ADN. Le SDS déstabilise le complexe Dps-ADN et empêche des changements de gel indésirables pour l&#39;ADN, ce qui améliore la facilité de quantification. Une étape facultative consiste à arrêter la réaction par voie catalytique dégradant le peroxyde d&#39;hydrogène en produits non toxiques. Pour les conditions décrites dans le présent protocole, cette étape n&#39;est pas nécessaire d&#39;obtenir un large éventail de dégradation de l&#39;ADN. </li><li> Incuber sur de la glace pendant 1 min, ajouter le colorant de charge, et charger sur un gel d&#39;agarose. Exécutez le gel, et tacher de l&#39;ADN en utilisant le bromure d&#39;éthidium. Le gel doit être teinté post-électrophorèse plutôt qu&#39;avant électrophorèse, pour empêcher le SDS d&#39;interférer avec la distribution de bromure d&#39;éthidium dans le gel. </li></ol>

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Le procédé de purification de Dps comme décrit dans cet article est très robuste. Pureté a toujours été élevé (&gt; 99%); pas d&#39;autres protéines apparaissent sur gels SDS-PAGE que des bandes visibles. Malgré cela, certains lots de Dps purifiés semblent avoir une activité nucléase, comme en témoigne la dégradation de l&#39;ADN partielle lorsqu&#39;ils sont incubés avec des concentrations très élevées de Dps. Cela pourrait indiquer la présence d&#39;DNases très actifs à faible concentration que nous n&#39;avons pas pu...

Les organismes aérobies doivent constamment composer avec les espèces réactives de l&#39;oxygène qui peuvent endommager leur ADN ainsi que d&#39;autres macromolécules biologiques cruciales. Un outil puissant pour contrer les effets toxiques du stress oxydatif est la protéine de liaison d&#39;ADN à partir de cellules privées (DPS). Depuis sa découverte en 1992 du affamé E. coli culture 1, Dps a été identifié dans plus de 300 espèces de bactéries et archéobactéries 2. Régulation à la hausse massive des Dps pendant la phase stationnaire rend la protéine nucleoid associée plus fortement exprimé de E. coli dans des conditions de famine 3, 4. En outre, Dps a été montré pour préserver à la fois la viabilité bactérienne et l&#39;intégrité de l&#39;ADN pendant de nombreuses diverses contraintes, notamment la famine, la concentration élevée en fer, exposition à la lumière UV, le choc thermique, et le stress oxydatif 5, 6. Structurellement, Dps auto-associés dans un complexe homo-oligomères stable de 12 monomères, which assembler en une coquille creuse sphérique. La cavité interne ~ 4,5 nm à l&#39;échelle est accessible au solvant par des pores qui permettent le passage de petites molécules 7 extérieur, et il peut séquestrer les métaux tels que le fer minéralisées 8. L&#39;effet protecteur de Dps tire de ses différentes activités biochimiques, qui comprennent les liaisons non spécifiques ADN 1, l&#39;activité ferroxydase et stockage du fer 8. Une étude détaillée des activités biochimiques bénéfiques de Dps exige d&#39;abord sa purification. Dps purification est une procédure complexe, comme Dps doivent être séparés non seulement d&#39;autres protéines, mais aussi de tout ADN lié 7. Notre processus de purification optimisé utilise de nombreuses techniques communes, composé de deux colonnes échangeuses d&#39;ions et une étape de précipitation de sulfate d&#39;ammonium. Plusieurs échanges tampons sont nécessaires, comme Dps très concentrés peuvent précipiter hors de la solution dans de faibles conditions de sel. Une fois la protéine Dps a été purifiée, Il peut être appliqué à des tests qui mesurent directement son activité ferroxydase 8, stoechiométrie DNA-binding 9, et les mécanismes de fixation du fer 10. Dps purifiées a également d&#39;autres applications potentielles. La structure sphérique creuse du Dps a été utilisé comme échafaudage pour stocker des particules hydrophobes à l&#39;intérieur de la cavité de la protéine 11 et même comme une chambre de réaction pour synthétiser de nouveaux nanoparticules magnétiques 12. La capacité de protection de Dps à la médiation dommages causés par les espèces réactives de l&#39;oxygène peut être clairement et directement démontré en utilisant le test de protection de l&#39;ADN 13, 14. Dans cette procédure in vitro, les espèces radicalaires sont produites lorsque le fer catalyse H 2 O 2 à la dégradation par la chimie de Fenton. Ces radicaux endommager directement l&#39;ADN présent dans la réaction et peuvent complètement se dégrader à des concentrations élevées. Deux activités DPS clés peuvent aussi contrer directement les effets de Fentla production de radicaux sur-médiatisée. Dps abaisse la concentration en fer catalytique par minéralisation, consommant du peroxyde d&#39;hydrogène disponible dans le procédé. En outre, Dps liaison à l&#39;ADN peut potentiellement protéger physiquement les dommages des radicaux et se condense en un petit volume avec une surface moins réactif. La combinaison de ces deux propriétés rend le dosage de la protection de l&#39;ADN bien adapté dans le but de mesurer l&#39;activité Dps protection. L&#39;essai de protection de l&#39;ADN est très polyvalent et peut être utilisé pour une variété d&#39;applications au-delà Dps caractérisation. Les dommages des radicaux est une forme courante de stress dans les cellules, et de nombreuses protéines et de produits chimiques sont utilisés pour la contrecarrer. Le principe général de l&#39;épreuve, en utilisant l&#39;intégrité de l&#39;ADN comme marqueur pour les dommages des radicaux, peut être utilisé en combinaison avec presque aucune réaction produisant des radicaux ou agent de contrecarrer. Entre autres, le test a été utilisé avec succès pour déterminer les propriétés anti-oxydantesde K. Extrait paniculata pour une utilisation dans l&#39;industrie alimentaire 15, pour caractériser les effets de l&#39;acide urique sur les dommages hydroxyle médiation 16, et d&#39;acquérir de nouvelles connaissances sur la fonction de la fourrure de la transcription des protéines de régulation 17. Malgré les nombreuses utilisations de l&#39;analyse dans les documents publiés, nous avons constaté que beaucoup d&#39;optimisation et de dépannage sont nécessaires, ce qui rend la mise en place du dosage pour la première fois un processus inutilement laborieux pour de nombreux chercheurs. Le protocole que nous présentons dans cet article vise à supprimer cette barrière à l&#39;entrée.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3)pLysS cellules compétentes</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b ADN</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB bouillon en poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteur de protéase Set III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>-10 Colonnes de dessalage</td><td>GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. Filtre (10K MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate ferreux heptahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>475898</td><td></td></tr><tr><td>Solution SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur statique</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses </td><td>Nouveau-Brunswick Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse refroidie</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Disrupteur de cellules</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2/40/AA/AA/AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Purificateur</td><td>General Electric</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>Flacons hermétiques</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles pour seringues</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

application d&#39;un<em&gt; in vitro</em&gt; dna assay protection de bien visualiser les propriétés de médiation du stress de la protéine dps

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Le stress oxydatif est un sous-produit inévitable de la vie aérobie. L&#39;oxygène moléculaire est essentielle pour le métabolisme terrestre, mais elle participe également à de nombreuses réactions néfastes au sein des organismes vivants. La combinaison du métabolisme aérobie et de fer, qui est un autre composé essentiel pour la vie, est suffisant pour produire des radicaux grâce à la chimie de Fenton et dégrader les composants cellulaires. dégradation de l&#39;ADN est sans doute le processus le plus dommageable impliquant radicaux intracellulaires, comme la réparation de l&#39;ADN est loin d&#39;être trivial. L&#39;analyse présentée dans cet article propose une technique quantitative de mesurer et de visualiser l&#39;effet des molécules et enzymes sur lésions de l&#39;ADN induites par des radicaux. L&#39;essai de protection de l&#39;ADN est un outil simple, rapide et robuste pour la caractérisation in vitro des propriétés protectrices de protéines ou de produits chimiques. Elle consiste à exposer l&#39;ADN à une réaction d&#39;oxydation nuisible et en ajoutant des concentrations variables du composé d&#39;intérêt. La réduction ou l&#39;augmentation de l&#39;altération de l&#39;ADN en fonction de la concentration du composé est ensuite visualisées par électrophorèse sur gel. Dans cet article, nous démontrons la technique du test de protection de l&#39;ADN en mesurant les propriétés protectrices de la protéine de liaison d&#39;ADN à partir de cellules privées (DPS). Le DPS est un mini-ferritine qui est utilisé par plus de 300 espèces de bactéries pour lutter puissamment facteurs de stress environnementaux. Ici, nous présentons le protocole de purification Dps et les conditions de dosage optimisé pour évaluer la protection de l&#39;ADN par Dps.

Le procédé de purification pour Dps décrits ici est très reproductible. Dps purification selon le protocole décrit, en utilisant 2 L de E. culture coli comme point de départ, va typiquement donner 2,5 ml de protéine contenant Dps 12 à des concentrations comprises entre 5 et 12 um. Temps d&#39;induction plus longue (4 heures) semblent réduire cette variabilité. la pureté des protéines est constamment au-dessus de 99%, comme en témoignent les gels SDS-PAGE (Figure 1). Le nivea...

La protéine de liaison à l&#39;ADN des cellules privées (DPS) joue un rôle crucial dans la lutte contre le stress bactérienne. Cet article traite de la purification de l&#39;<em&gt; E. coli</em&gt; Dps et le protocole pour une<em&gt; In vitro</em&gt; Essai démontrant protection Dps médiée par de l&#39;ADN de la dégradation par les espèces réactives de l&#39;oxygène.

Application d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Assay Protection de bien visualiser les propriétés de médiation du stress de la protéine Dps

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer in vitro l'effet protecteur de la protéine DPS en visualisant la réduction des dommages de l'ADN induits par les radicaux libres suite à l'activité de la DPS. Cette expérience consiste tout d'abord à purifier la DPS à partir de cellules d’E. coli, en utilisant plusieurs colonnes d’échange d’ions et une précipitation par sulfate d’ammonium. Dans un deuxième temps, la DPS purifiée est ajoutée à de l’ADN, permettant ainsi la formation d’un complexe A-D-P-S-D-N-A grâce aux propriétés de liaison non spécifique de la protéine à l’ADN. Ensuite, des solutions de fer ferreux et de peroxyde d’hydrogène sont ajoutées au mélange réactionnel afin de produire des radicaux hydroxyles par chimie de Fenton, et ainsi endommager l’ADN.Les résultats obtenus montrent une réduction des dommages à l'ADN en raison de la présence de DPS, basée sur la quantification des bandes d'ADN non endommagé sur des gels d'agarose après électrophorèse. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés lors de la préparation des réactifs. Ceci entraîne des réactions indésirables telles que la formation de précipités de fer ferrique ou la dégradation spontanée du peroxyde d'hydrogène.Bien que cette méthode permette de comprendre l'activité protectrice de la DPS contre le stress oxydatif, elle peut également être utilisée pour quantifier les effets d'autres protéines et produits chimiques sur la dégradation de l'ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de la chimie oxydative, comme la détermination des propriétés antioxydantes d'extraits cellulaires destinés à l'industrie alimentaire. Une étape essentielle préalable au test de protection de l'ADN consiste à obtenir une protéine DPS de haute pureté.Pour commencer la procédure d'expression et de purification de DPS, transformer une souche d'E. coli déficiente en protéase avec un vecteur pET dans lequel la séquence codant pour la protéine DPS a été clonée. Ensemencer deux flacons d'un litre de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés avec 10 millilitres chacun d'une culture initiale croissante, issue d'une seule colonie de cellules transformées, et faire croître à 37 degrés Celsius sous agitation jusqu'à une DO 600 d'environ 0,6.Lorsque les cellules ont atteint la densité optique souhaitée, induire l'expression de DPS en ajoutant du IPTG à une concentration de 0,3 millimolaire, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures sous agitation. Récolter les cellules par centrifugation à 6 000 g pendant 15 minutes. Resuspendre les culots cellulaires dans 7,5 millilitres de tampon DEAE par litre de culture cellulaire induite, ainsi qu'un mélange d'inhibiteurs de protéases dans la suspension cellulaire regroupée. Pour prévenir la dégradation de la TPS surexprimée, préparer un extrait cellulaire libre d'ADN en utilisant un pressoir français.Passer la presse française avec 20 millilitres de tampon DEAE A, puis lyser l'échantillon deux fois à 20 KPSI. Centrifuger le lysat à 30 000 g pendant 35 minutes à 4 degrés Celsius. Pour éliminer les particules insolubles, conserver le surnageant et charger l'extrait cellulaire libre de cellules sur une colonne DEAE SRO SEAL 6B de 30 millilitres préalablement équilibrée avec le tampon DEAE A, en commençant à recueillir le flux sortant. Dès que le signal d'absorbance à 280 nm commence à augmenter au-dessus de la ligne de base, laver la colonne avec le tampon DEAE A jusqu'à ce que la valeur d'absorbance à 280 nm revienne à la ligne de base, tout en continuant à recueillir le flux sortant.Le flux traversant doit contenir la majeure partie de la protéine DPS dépourvue d'ADN lié ; lavez la colonne avec 100 % de tampon B. L'éluat contient des complexes D-P-S-ADN ainsi que d'autres protéines et peut être mis au rebut. L'étape suivante consiste à éliminer les protéines contaminantes supplémentaires par précipitation à l'aide de sulfate d'ammonium, généralement effectuée dans la chambre froide.Après avoir déterminé le volume du flux combiné, ajouter lentement du sulfate d'ammonium en grains fins à sec jusqu'à une saturation de 62 %, sur une période de 10 à 20 minutes à quatre degrés Celsius, tout en agitant. Éliminer soigneusement les protéines précipitées par centrifugation à 20 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Conserver lentement le surnageant.Ajouter 227 milligrammes supplémentaires de sulfate d'ammonium par millilitre de surnageant pour atteindre une saturation de 94 % et agiter de 20 à 30 minutes. Afin de garantir un équilibre complet des précipités de TPS à cette concentration élevée de sel, recueillir les DPS par centrifugation à 20 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Resuspendre le culot contenant les DPS dans le tampon de resuspension Resus et ajuster le volume de l'échantillon à 2,5 millilitres.Éliminer le sulfate d'ammonium par échange de tampon à l'aide d'une colonne de filtration sur gel PD 10 dont le lit de gel a été équilibré avec 25 millilitres de tampon de suspension Resus. Appliquer les 2,5 millilitres de l'échantillon DPS sur le dessus de la colonne PD 10 et laisser pénétrer, puis jeter l'écoulement initial. Recueillir le DPS en éluant avec 3,5 millilitres de tampon de suspension Resus centrifugé.Échantillon échangé dans du tampon centrifugé à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour éliminer les composants insolubles, diluer l'échantillon avec six à 10 millilitres de tampon de dilution afin de s'assurer que la concentration en sel est suffisamment faible pour la DPS. Pour assurer la liaison à la colonne SP SPHEROS, charger l'échantillon sur une colonne SP spheros fast flow de 30 millilitres préalablement équilibrée avec du tampon SP.Effectuer un lavage avec le tampon SP A jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm revienne à la ligne de base, puis jeter l'écoulement. Appliquer un gradient linéaire de 150 millilitres passant de 0 à 100 % de tampon B tout en collectant des fractions de 2 millilitres. Le DPS éluera selon un pic net vers 50 % de tampon B, bien qu'une variation de 10 % soit possible.Vérifiez les fractions éluantes quant à une contamination par l'ADN en mesurant le rapport de l'OD à 260 nm sur l'OD à 280 nm. À l'aide d'un spectrophotomètre, le rapport doit généralement être d'environ 0,7 lorsque les fractions éluantes sont analysées sur un gel SDS-PAGE à 15 %. Le gel ne doit présenter qu'une seule bande d'environ 19 kilodaltons.Rassembler les fractions DPS de purs après concentration et échange du DPS dans un tampon de stockage. À l’aide d’une unité de filtration centrifuge, aliquoter le DPS purifié et congeler dans de l’azote liquide pour un stockage à moins 80 degrés Celsius. Le test de protection génétique comprend plusieurs réactifs et des schémas complexes de pathogènes.Une préparation minutieuse des réactifs et un chronométrage précis sont une exigence absolue pour la reproductibilité. L'utilisation d'une table de pipetage est conseillée afin de suivre les étapes et les volumes durant cette procédure. Mesurer 30 millilitres d'eau dans un flacon hermétique pour éliminer l'oxygène de la solution.Barboter l’eau avec de l’azote pendant 10 minutes à l’aide de deux aiguilles de seringue, une dans le liquide et l’autre au-dessus. Ajouter 0,0168 grammes de sulfate ferreux hétérahydrate à l’eau afin d’obtenir une solution mère à deux millimolaires. Boucher le flacon et barboter avec de l’azote pendant cinq minutes supplémentaires.Ensuite, mélanger. La solution doit être limpide ; si la moindre teinte jaune est perceptible, préparer une nouvelle solution de fer. Préparer une solution de peroxyde d'hydrogène à 100 millimolaire, la conserver sur de la glace et la protéger de la lumière en raison de sa dégradation spontanée.Utilisez cette solution de peroxyde d'hydrogène uniquement pendant environ une à deux heures après sa préparation. Suivez un éloqua de DPS purifié rapidement dans un bain-marie à température ambiante et placez sur glace. Effectuez une courte centrifugation de 10 secondes à 4 000 ×g dans une microcentrifugeuse de table pour précipiter les agrégats après centrifugation. Mesurez la concentration à l'aide d'un spectrophotomètre, puis diluez l'ADN linéaire provenant d'une solution mère à haute concentration à l'aide d'un tampon de réaction 12 x afin d'obtenir une concentration de 100 nanogrammes par microlitre. Ajoutez à l'aide d'une pipette suffisamment d'eau dans les tubes PCR pour que le volume final de la réaction soit de 12 microlitres.Ensuite, préparez un échantillon stock d’ADN mélangé au DPS afin que la concentration finale en oligonucléotide soit de trois micromoles par litre ; pipetez le mélange ADN-DPS dans les tubes de PCR. Les tubes témoins reçoivent uniquement de l’ADN. Incubez pendant 15 minutes à température ambiante pour permettre au DPS de se lier à l’ADN. Ajoutez suffisamment de solution de sulfate ferreux à deux millimoles par litre pour atteindre la concentration souhaitée, puis ajoutez rapidement un microlitre de solution de peroxyde d’hydrogène à 100 millimoles par litre afin d’obtenir une concentration finale de 10 millimoles par litre, et incubez à température ambiante pendant cinq minutes.Pour permettre la réaction de dégradation médiée par Fenton, ajouter un microlitre de mélange SDS à 20 % et incuber à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de rompre les complexes D-P-S-D-N-A ; le SDS déstabilise le complexe DPS-ADN et empêche les décalages indésirables de l'ADN sur gel, ce qui facilite la quantification. Incuber ensuite sur glace pendant une minute, ajouter le colorant de charge et déposer sur un gel d'agarose pour électrophorèse. Réaliser la coloration de l'ADN avec du bromure d'athérium après l'électrophorèse, et non avant. Cela empêche le SDS d'interférer avec la répartition du bromure d'athérium dans le gel.Les étapes intermédiaires de la purification du DPS analysées par électrophorèse SDS sont présentées ici. La première bande correspond à l'extrait cellulaire libre. La deuxième bande correspond au flux traversant de la colonne DEAE SPHEROS.La bande trois correspond à l'EIT de la colonne DEAE. La bande quatre correspond au surnageant de la précipitation par 60 % de sulfate d'ammonium. La bande cinq correspond à l'échantillon DPS après précipitation par 90 % de sulfate d'ammonium et échange de tampon à l'aide d'une colonne PD 10.Et la voie six correspond aux fractions pures DPS regroupées. Après la protéine de la colonne SP sphéros. Les marqueurs de poids moléculaire se trouvent dans la voie sept. Les pourcentages indiqués au bas de chaque piste représentent la pureté du DPS déterminée par un logiciel de quantification d'image. Le processus de purification du DPS présenté ici est très reproductible, et la pureté protéique est régulièrement supérieure à 99 %. Aucune autre protéine n'apparaît sur les gels SDS-PAGE sous forme de bandes visibles. Le DPS purifié peut être utilisé dans un test de protection de l'ADN, dans lequel le fer catalyse la dégradation du peroxyde d'hydrogène par la chimie de Fenton, produisant des espèces radicalaires qui endommagent directement l'ADN présent dans la réaction ; des résultats représentatifs sont montrés dans cette figure.Toutes les pistes contiennent 100 nanogrammes d'ADN linéaire de cinq kilobases ; la piste un contient uniquement de l'ADN, la piste deux contient de l'ADN avec un millimolaire de peroxyde d'hydrogène, et la piste trois contient de l'ADN avec un millimolaire de peroxyde d'hydrogène et 166 micromolaires de sulfate ferreux. Toutefois, l'ADN a été dégradé. Les pistes quatre à huit contiennent de l'ADN avec trois micromolaires de DPSD démér, un millimolaire de peroxyde d'hydrogène, et des concentrations croissantes de fer de gauche à droite.Le fait que la DPS assure la protection de l'ADN contre la dégradation oxydative est évident lors de la comparaison entre les bandes trois et cinq. Une augmentation globale de la dégradation de l'ADN avec la concentration croissante de fer est également apparente. Les résultats obtenus par le test de protection de l'ADN peuvent être quantifiés à l'aide d'un logiciel de traitement d'image tel qu'ImageQuant.Ce graphique montre le résultat de cette quantification moyenné sur trois dosages. Les barres d'erreur indiquent le niveau élevé de reproductibilité obtenu. Une fois maîtrisé.Cette technique peut être réalisée en environ quatre heures pour jusqu'à 40 échantillons, ce qui permet de caractériser de nombreuses conditions différentes en parallèle. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer vos réactifs avec précision et de chronométrer chaque étape aussi exactement que possible. Étant donné que le test est très sensible aux durées d'incubation, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir une protéine DPS de haute pureté et de la caractériser dans un test in vitro afin de déterminer son activité dans la protection de l'ADN contre la dégradation par des espèces oxydantes réactives.

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