Name: Détermination de lactivité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Apprenez à mesurer l'activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, sols et sédiments par dosage colorimétrique ou fluorimétrique en microplaques. Cette méthode permet une analyse rapide et reproductible.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Le financement des aspects de ce travail a été fourni par différentes sources, y compris le Département américain de l&#39;Agriculture de l&#39;accord de coopération spécifique 58-6408-1-595 et la National Science Foundation (prix 1049911).

Colorimétrique Analyse des extracellulaire activité enzymatique dans les sols et les sédiments Une. Préparation du substrat et solutions tampons pour les analyses colorimétriques de l&#39;activité enzymatique <ol><li> H préparer tampon acétate 50 mM (pH 5,0 à 5,5), en mélangeant 50 ml de 0,1 M d&#39;acide acétique (2,87 ml d&#39;acide acétique glacial dans 500 ml d&#39;eau), 150 ml de 0,1 M d&#39;acétate de sodium et 200 ml d&#39;eau distillée 2 O. Ajuster le pH à 5,0 à 5,5 avec 0,1 M d&#39;acide acétique, si nécessaire. </li><li> Préparer une solution de 1 M d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) dans l&#39;eau distillée 2 O. </li><li> Préparer des solutions de substrat de NP lié p dans 50 mM de tampon acétate. Pour doser la phosphatase préparer 5 mM p NP-phosphate dans 50 mM de tampon acétate, pour doser β-glucosidase préparer 5 mM p NP-β-glucopyranoside, pour doser NAGase préparer 2 mM pNP-β-N-acétyl-glucosaminide. Préparer toutes les solutions de substrat dans stériles 15 ml ou 50 ml tubes de centrifugation. Les solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant 2 à 3 semaines. </li></ol> 2. Détermination d&#39;une norme pour convertir l&#39;absorbance à p NP Concentration <ol><li> Préparer des solutions standard de p-nitrophénol dans 50 mM de tampon acétate. Les concentrations devraient varier de 0,025 à 1 mM. </li><li> Transfert trois répétitions de 100 pi de chaque concentration à une microplaque de 96 puits clair. Ajouter 10 ul de NaOH 1 M et 190 ul de H 2 O distillée à chaque puits. </li><li> absorbance record à 410 nm en utilisant un lecteur de microplaques. </li><li> Concentrations se multiplient dans la courbe standard par 0,3 pour obtenir micromoles p NP par 300 volume de réaction ul. Tracer la courbe d&#39;absorbance en fonction pmol de p NP. La pente de la courbe sert de facteur de conversion (C) qui se rapportent à l&#39;absorbance umole de p NP dans chaque réaction enzymatique. </li></ol> 3. Conduite de l&#39;Enzyme Assay <ol><li> Pour le sol, préparer une suspension de chaque échantillon à analyser dans un 15 ml tube à centrifuger stérile à une concentration d&#39;environ 1 g / ml-1 en utilisant 50 mM de tampon acétate. Pour les sédiments, ajouter un tampon d&#39;acétate assez pour faire la bouillie facilement pipettable. Le volume exact de bouillie nécessaire variera en fonction du nombre d&#39;enzymes testés, mais un minimum de 5 ml est recommandé. Vortex chaque suspension jusqu&#39;à ce que toutes les mottes de terre ou les sédiments se sont dispersés et noter le volume final. </li><li> Re-vortex chaque suspension et la pipette juste 150 pi dans chacun des six puits sur un bloc de 96 puits deepwell (Figure 1). Il est important de vortex complètement et fréquemment afin de maintenir les particules de sol en suspension. Laisser au moins deux puits par bloc vide pour servir de contrôle de substrat. Remarque: clip la fin de pointes de pipettes avec des ciseaux avant de pipetage comme les boues, ont tendance à obstruer conseils. Préparer un bloc à 96 puits pour chaque enzyme à doser. </li><li> Verser environ 5 ml de tampon acétate dans un réservoir de pipette et en utilisant une pipette à 8 canaux d&#39;ajouter 150 ul du tampon à la last deux puits de chaque échantillon (ce seront des contrôles de tampon échantillon) et les deux puits de contrôle de substrat (Figure 1) </li><li> Verser environ 10 ml de la solution de NP-substrat p appropriée dans un réservoir de pipette et en utilisant une pipette à 8 canaux d&#39;ajouter 150 ul de la solution de substrat pour les quatre premiers puits de chaque échantillon et les deux puits de contrôle de substrat (Figure 1). Noter le temps que la réaction commence dès que la solution de substrat est ajouté. </li><li> Incuber les plaques à température ambiante (22 ° C) pendant 0,5-4 h. Temps d&#39;incubation exacte varie en fonction du niveau d&#39;activité dans les échantillons et l&#39;enzyme à doser. Pour la plupart des sols et des sédiments, de la phosphatase et de β-glucosidase nécessitent des temps d&#39;incubation de 0,5 à 1,5 heures, tandis que la NAGase et d&#39;autres enzymes nécessitent des temps d&#39;incubation de&gt; 2 h. </li><li> Bien que des essais sont en période d&#39;incubation préparer clair microplaques de 96 puits à l&#39;absorbance. Préparer une microplaque pour chaque bloc deepwell (c&#39;est à dire pour chaque enzyme dosé). Introduire à la pipette 10 ul de NaOH 1 M et 190 ul d&#39;eau distillée dans chaque puits de la microplaque. Remarque: NaOH ralentit la réaction enzymatique et augmente le pH qui améliore la couleur de la NP p libéré pendant la réaction. </li><li> Après incubation, centrifuger les blocs de 96 puits à 2000-5000 x g pendant 5 min pour sédimenter les particules du sol. </li><li> Utilisez une pipette multicanaux de retirer 100 pi de chaque puits, en veillant à éviter le culot, et le transférer dans le puits correspondant à préparé microplaque de 96 puits clair. </li><li> Allumez le lecteur de microplaques et mettre en place les logiciels nécessaires. absorbance record à 410 nm. Si l&#39;absorbance d&#39;un bien donné est au-dessus de la limite de détection linéaire du lecteur de plaques, diluer ainsi que 1:01 avec de l&#39;eau et re-mesure. Si l&#39;absorbance est encore trop élevé, le test doit être répété avec un temps d&#39;incubation plus courte. </li></ol> 4. Détermination de la masse sèche des échantillons <ol><li> Introduire à la pipette 1 ml de chaque sampl<html> e bouillie dans une casserole en aluminium préalablement pesée. </li><li> Sécher dans une étuve de séchage à 75 ° C pendant 48 h et peser. Soustraire le poids de la cuve à partir de cette valeur pour obtenir la masse sèche du sol ou de sédiment dans 1 ml de la suspension. Multiplier par un facteur de 0,15 pour déterminer la masse sèche de l&#39;échantillon dans les 150 ul ajoutés à chaque puits dans le dosage d&#39;enzyme. </li></ol> 5. Calcul de l&#39;activité enzymatique par masse sèche de sol ou les sédiments <ol><li> Calculer l&#39;absorbance finale de chaque échantillon en soustrayant l&#39;absorbance de l&#39;échantillon de contrôle à partir de l&#39;absorbance de l&#39;échantillon d&#39;essai. Si les contrôles de substrat ont une forte absorption (environ&gt; 0,060) alors soustraire ceux aussi. </li><li> Calcul de l&#39;activité enzymatique en pmoles hr -1 -1 g de matière sèche à partir de l&#39;équation: </li></ol> l&#39;activité de l&#39;enzyme = absorbance finale / (C x temps d&#39;incubation x échantillon masse sèche) Analyse fluorescent de extracellulaire activité enzymatique dans les eaux naturelles TLE &quot;&gt; 1. Préparation du support, Standard et solutions tampons pour analyses fluorométriques de l&#39;activité enzymatique <ol><li> Préparer 200 uM des solutions de substrats MUB-liés (par exemple 4-MUB-β-glucopyranoside, le 4-MUB-phosphate, le 4-MUB-N-acétyl-β-D-glucosaminide) en dissolvant le substrat approprié dans stérile (autoclavée) distillée H 2 O dans 15 ml stériles ou 50 ml tubes de centrifugation. Enveloppez tubes en papier d&#39;aluminium pour exclure la lumière et stocker au réfrigérateur avant de l&#39;utiliser. Les substrats doivent être stables pendant au moins 1 semaine si elles sont stockées de cette manière. </li><li> Préparer une norme MUB en faisant une solution stock de 100 uM 4 méthylumbelliférone dans de l&#39;eau distillée stérile 2 O. Conserver au réfrigérateur dans de l&#39;ambre ou bouteille en aluminium gainé. Immédiatement avant utilisation, diluer la solution 100 uM d&#39;actions par 1/10 en H 2 O stérile pour obtenir une solution de travail de 10 uM pour les dosages enzymatiques. </li><li> Préparer une solution stock de tampon de bicarbonate 100 mM en dissolvant 8,4 g de NaHCO &lt;sub&gt; 3 en 1 LH 2 O et autoclave. Diluer cette solution mère 1/20 en H 2 O stérile si nécessaire pour obtenir une solution de travail de 5 mm pour les dosages enzymatiques. </li></ol> 2. Organiser des échantillons d&#39;eau sur un 96 puits noir microplaques <ol><li> Organiser une microplaque pour chaque enzyme suivant l&#39;exemple représenté sur la figure 2. Notez que pour permettre la réplication adéquat, des normes et des contrôles, cette procédure peut doser l&#39;activité d&#39;une enzyme unique pour un maximum de neuf échantillons d&#39;eau sur une microplaque à 96 puits noir. </li><li> Verser environ 5 ml du premier échantillon dans un réservoir de pipette et utiliser une pipette à 8 canaux à pipette200 ul dans tous les puits de la colonne 1 de la microplaque (s). Jeter les embouts de pipette neufs et répéter au besoin pour chaque échantillon d&#39;eau pour remplir les colonnes 1-9. </li></ol> 3. Mise en place d&#39;échantillon, Standard, prend goût, et des contrôles de substrat <ol><li> Mettre en place des contrôles pour tenir compte des échantillons, standardss, et le substrat de trempe sur la même microplaque noire que les échantillons (Figure 2). </li><li> Contrôles exemples contiennent de l&#39;eau de l&#39;échantillon et le tampon bicarbonate, et ne sont pas utilisées dans les calculs d&#39;activité mais démontreront lecture cohérence tout au long de l&#39;expérience. Les contrôles de trempe sont constitués d&#39;eau de l&#39;échantillon et une quantité standard de l&#39;étiquette fluorescente et sont utilisés pour mesurer la diffraction de la fluorescence dans l&#39;eau de l&#39;échantillon. Substrat et contrôles standard sont constitués de tampon de substrat soit lié ou le marqueur fluorescent standard, respectivement, et le bicarbonate. </li><li> Verser environ 5 ml de 5 mM de tampon de bicarbonate dans un réservoir de pipette propre. Pipette 50 ul de tampon dans les puits de la microplaque de 1 à 9 dans les lignes D et E pour former deux puits réplicats de commandes d&#39;échantillon par échantillon. Changer d&#39;embout de pipette puis transférer 200 pi de tampon bicarbonate de puits 10 à 12 dans les lignes A et H. </li><li> Réduisez l&#39;éclairage ambiant par gradation ou d&#39;éteindre lipo ds que la norme fluorescent est sensible à la lumière. </li><li> Verser environ 5 ml de 10 pM de 4-méthylumbelliférone dans un réservoir de pipette propre. Pipette 50 ul dans les puits de la microplaque de 1 à 12 dans la ligne H, et dans les puits 1 à 9 dans les lignes G et F pour former trois répétitions de contrôles de trempe par échantillon et l&#39;ensemble des contrôles standard. Soit placer la microplaque dans l&#39;obscurité ou couvrir avec un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB. </li><li> Allumez le fluorimètre et mettre en place les logiciels nécessaires pour être prêt à lire avant d&#39;ajouter le substrat. Note: certaines ampoules fluorimètre peuvent nécessiter un temps d&#39;échauffement de 3 minutes ou plus. </li><li> Verser environ 5 ml de substrat approprié MUB-lié (par exemple 4-MUB-phosphate) dans un réservoir de pipette propre. Utilisez une pipette 12 canaux à la pipette 50 ul dans les puits de la microplaque de 1 à 12 dans la ligne A, et dans les puits 1 à 9 dans les lignes B et C pour former trois essais répétés pour chaque échantillon et trois contrôles de substrat. Immediately passez à l&#39;étape 4.1, fluorescence d&#39;enregistrement. </li></ol> 4. Fluorescence enregistrement <ol><li> Lire la fluorescence initiale immédiatement après l&#39;addition de substrat à la microplaque. Après la lecture de la fluorescence, incuber la microplaque à température ambiante (22 ° C), soit dans le noir ou recouvert d&#39;un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB. </li><li> Le temps d&#39;incubation nécessaire pour mesurer l&#39;activité enzymatique maximale possible dans un échantillon d&#39;eau va dépendre de la concentration d&#39;enzyme dans l&#39;échantillon. Etant donné que ce n&#39;est pas connue avant le dosage est terminé, la microplaque devra être lu à intervalles de temps multiples. Typiquement, la lecture à des intervalles de 10-15 minutes au cours de 1 h est acceptable pour de nombreuses enzymes, bien que les échantillons avec une activité très élevée pour certaines enzymes peuvent culminer avant 10 min. </li><li> Continuer la lecture de fluorescence dans la microplaque à vos intervalles désignés pendant au moins 1 heure. Soyez sûr de garder la microplaque couvert ou dans l&#39;obscurité entre la lectures. </li></ol> 5. Calcul de l&#39;activité enzymatique par volume d&#39;eau <ol><li> Pour chaque échantillon à chaque intervalle de temps de calculer les: fluorescence moyenne de l&#39;échantillon initial (puits D et E), la fluorescence de l&#39;échantillon final moyen (puits AC), la fluorescence moyenne standard (puits H10-11), et la moyenne étancher fluorescence de contrôle (puits FG). </li><li> Pour chaque intervalle de temps, calculer l&#39;activité enzymatique en nmoles ml -1 h -1 à partir de l&#39;équation: </li></ol> l&#39;activité de l&#39;enzyme = (fluorescence moyenne de l&#39;échantillon - fluorescence moyenne de l&#39;échantillon initial) / ((fluorescence moyenne / 0,5 mole) x standards (moyenne étancher fluorescence de contrôle / moyenne de fluorescence) x standards (0,2 ml) x (temps en h)) <ol start="3"><li> Examiner les valeurs de l&#39;activité calculée pour chaque pas de temps. Déterminer l&#39;activité de potentiel final de l&#39;étape de temps avec la plus forte activité. Si les valeurs d&#39;activité continuent d&#39;augmenter alors pas de temps plus tard, peuvent être nécessaires, si les valeurs d&#39;activité tombent Throughout cours de l&#39;exécution, puis exécutez à nouveau avec plus courts intervalles de temps. Dernière activité est en nmoles de substrat consommée h -1 ml -1, mais peut être étendu à exprimer comme micromoles h -1 L -1. </li></ol>

<ol><li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+microbial+cellulose+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed%3A+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li>
<li>Dalal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+organic+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+agronomy%22%5BJournal%5D)">Soil organic phosphorus.</a> Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+allocation+to+extracellular+enzyme+production%3A+a+model+for+nitrogen+and+phosphorus+control+of+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).</li>
<li>Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+p-nitrophenyl+phosphate+for+assay+of+soil+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).</li>
<li>Parham, J. A., Deng, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+quantification+and+characterization+of+%CE%B2-glucosaminidase+activity+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil.</a> Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).</li>
<li>Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+heavy+metal+concentrations%2C+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li>
<li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Wetlands%22%5BJournal%5D)">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li>
<li>Hoppe, H. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water%3A+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+ecology+progress+series%22%5BJournal%5D)">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li>
<li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li>
<li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+soil%22%5BJournal%5D)">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+oceanography%22%5BJournal%5D)">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li>
<li>Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li>
<li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li>
<li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+freshwater+ecology%22%5BJournal%5D)">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+letters%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li>
<li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwater+biology%22%5BJournal%5D)">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+north+american+benthological+society%22%5BJournal%5D)">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li>
<li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li>
<li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li>
<li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Détermination de l&#39;activité d&#39;une variété d&#39;enzymes extracellulaires microbiennes dans les sols et les sédiments peut fournir des indications utiles sur les taux de minéralisation des éléments nutritifs et de matière organique traitement 17. Cependant, les sols peuvent varier dans leurs niveaux d&#39;humidité, il est donc important de normaliser l&#39;activité de sol poids sec. Cela nécessite une étape de séchage supplémentaire (typiquement de deux jours) au-delà de la simple mesure de l&#39;activ...

Les micro-organismes tels que les bactéries et les champignons d&#39;obtenir les nutriments et de carbone à partir de composés organiques complexes, grâce à la production d&#39;enzymes extracellulaires. Ces enzymes hydrolysent typiquement des polymères en sous-unités plus petites qui peuvent être prises dans la cellule. Par conséquent, au niveau écologique, ces enzymes extracellulaires microbiennes sont en grande partie responsables de la minéralisation des éléments nutritifs et de la décomposition de la matière organique qui se produit dans les milieux naturels. Des enzymes telles que la cellobiohydrolase (CBH), β-glucosidase et sont importants pour la dégradation de la cellulose et de travail à l&#39;unisson pour catalyser l&#39;hydrolyse de la cellulose en glucose 1,2, ce qui donne un substrat de carbone utilisables pour l&#39;absorption et l&#39;assimilation microbienne. La phosphatase enzyme libère solubles groupes phosphates inorganiques de organophosphates, essentiellement de minéralisation du phosphate et de la rendre disponible pour une utilisation par la plupart des organismes 3. D&#39;autres enzymes, telles que la N-acétylglucosaminidase (NAGase), sont important dans la dégradation de la chitine et peut faire à la fois du carbone et de l&#39;azote disponible pour l&#39;acquisition microbienne 4. Une des procédures pour le dosage de l&#39;activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les milieux naturels est l&#39;utilisation d&#39;artificiel p-nitrophényl (p NP) des substrats liés, une approche qui a été initialement développé pour détecter sol activité de la phosphatase 5. Cette approche repose sur la détection d&#39;un produit final coloré, le p-nitrophénol, qui est libéré lorsque le substrat artificiel est hydrolysé par l&#39;enzyme appropriée. Le p-nitrophénol peut ensuite être quantifié par colorimétrie en mesurant son absorbance à environ 400-410 nm. Cette méthode a depuis été appliquée pour détecter d&#39;autres enzymes telles que la NAGase 6, et a été utilisé dans diverses études portant sur ​​l&#39;activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les sols et les sédiments 9.7. Une approche alternative qui était originally développé pour évaluer l&#39;activité glucosidase extracellulaire dans les milieux aquatiques 10,11 rend l&#39;utilisation de 4-méthylumbelliférone (IUM) substrats liés. Le produit final libéré (4-méthylumbelliférone) est hautement fluorescent et peut être détectée en utilisant un fluorimètre avec un paramètre d&#39;excitation / émission d&#39;environ 360/460 nm. Une variété de substrats artificiels MUB-liés sont disponibles, permettant la mesure fluorométrique de l&#39;activité d&#39;au moins autant d&#39;enzymes (par exemple β-glucosidase, la cellobiohydrolase, NAGase, phosphatases) que l&#39;on peut doser à l&#39;aide de la procédure colorimétrique de NP-substrat p. D&#39;autres enzymes extracellulaires microbiens, tels que la leucine aminopeptidase de la protéine dégradant, peuvent être analysés par fluorimétrie à l&#39;aide de 7-amino-4-méthylcoumarine (CUO) des substrats liés. Les deux MUB et substrats COU-liés ont été utilisés pour déterminer l&#39;activité enzymatique dans divers échantillons terrestres et aquatiques 12,13. Bien que des études antérieures ont descrmicroplaque fluorimétrique ou colorimétrique ibed approches pour déterminer l&#39;activité enzymatique extracellulaire 14, il ya un besoin pour une présentation claire de la façon de mener de tels essais. Ici, nous démontrons les procédures pour la conduite des techniques à haut débit de microplaques pour l&#39;analyse de l&#39;activité enzymatique extracellulaire dans les sols et les sédiments à l&#39;aide de l&#39;approche colorimétrique p substrats de NP-lié et dans les eaux naturelles en utilisant la technique des substrats MUB-Linked Fluorescent. Nous nous concentrons sur la mesure des activités de β-glucosidase, NAGase, et phosphatase que ces enzymes peuvent être liées au carbone, l&#39;azote et le cycle du phosphore, respectivement. Cependant, les modes opératoires décrits ici peuvent être appliqués à la mesure d&#39;autres enzymes extracellulaires en utilisant différents substrats artificiels.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>RÉACTIFS ET MATÉRIAUX</fort></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial Divers</td><td></td><td></td><td>fournisseurs</td></tr><tr><td>Acétate</td><td></td><td></td> de sodium <td>Divers fournisseurs</td></tr><tr><td>Hydroxyde de</td><td></td><td></td> sodium <td>Divers fournisseurs</td></tr><tr><td>p-Nitrophenol</td><td>Fisher</td><td>BP612-1</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>p-Nitrophényle (pNP)-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3234</td><td>pNP</td></tr><tr><td>pNP-&#946 ;-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>pNP-substrat</td></tr><tr><td>pNP-&#946 ;-N-acétylglucosaminide</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>p Substrat NP</td></tr><tr><td>Microplaques transparentes à 96 puits</td><td>Fisher</td><td>12-563-301</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Blocs de puits profonds à 96 puits</td><td>disponibles Costar</td><td>3958</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Bacs de pesée</td><td></td><td></td> en aluminium <td>Divers fournisseurs</td></tr><tr><td>Tubes</td><td></td><td></td> à centrifuger stériles de 15 ml <td>Divers fournisseurs</td></tr><tr><td>Tubes</td><td></td><td></td> <td>à centrifuger stériles de 50 mlDivers fournisseurs</td></tr><tr><td>4-Méthylumbellifère</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Méthylombelliféryl (MUB)-phosphate</td><td>Sigma</td><td>M8883</td><td>Substrat MUB</td></tr><tr><td>4-MUB-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>M3633</td><td>Substrat MUB</td></tr><tr><td>4-MUB-N-acétylglucosaminide</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>Substrat MUB</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td></td> de sodium<td></td><td>Divers fournisseurs</td></tr><tr><td>Microplaque noire 96 puits</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir</td><td></td><td></td> de pipette <td>Divers fournisseurs</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>Pour microplaques/blocs de puits profonds</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Fluorimètre à microplaques</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>Alternatives disponibles</td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td> 8 canaux <td>Divers fournisseurs</td></tr></tbody></table>

détermination de l&#39;activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Une grande partie du cycle des éléments nutritifs et la transformation du carbone en milieu naturel se produit grâce à l&#39;activité des enzymes libérées par les micro-organismes extracellulaires. Ainsi, la mesure de l&#39;activité de ces enzymes extracellulaires peut donner un aperçu des taux de processus au niveau de l&#39;écosystème, telles que la décomposition de la matière organique et la minéralisation de l&#39;azote ou du phosphore. Des dosages de l&#39;activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons environnementaux impliquent typiquement l&#39;exposition des échantillons à des substrats colorimétriques ou fluorométriques artificiels et suivant le taux de l&#39;hydrolyse du substrat. Nous décrivons ici microplaques basé méthodes de ces procédures qui permettent l&#39;analyse d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons dans un court laps de temps. Les échantillons sont laissés à réagir avec des substrats artificiels à l&#39;intérieur de microplaques de 96 puits ou de puits profond blocs de microplaques, et l&#39;activité enzymatique est ensuite déterminée par absorption ou de fluorescence du produit final résultant de l&#39;utilisation d&#39;un reade microplaque typiquer ou fluorimètre. Ces procédures à haut débit non seulement de faciliter les comparaisons entre les sites ou les écosystèmes séparés spatialement, mais aussi de réduire sensiblement le coût de ces tests en réduisant les volumes globaux de réactifs nécessaires par échantillon.

Les sols et les sédiments aquatiques ont généralement des niveaux appréciables d&#39;activité enzymatique extracellulaire par suite des communautés microbiennes joints (biofilms) se développant sur ​​la surface des particules. Figure 3 montre comment cette activité varie en fonction de la taille des particules obtenues à partir du sédiment de surface d&#39;une troisième courant de l&#39;ordre dans le nord du Mississippi, États-Unis. Une étude antérieure a montré que les communautés bactériennes sur des ...

procédures de microplaques sont décrites pour l&#39;analyse colorimétrique ou fluorimétrique de l&#39;activité enzymatique extracellulaire. Ces procédures permettent l&#39;analyse rapide d&#39;une telle activité dans un grand nombre d&#39;échantillons de l&#39;environnement dans un laps de temps raisonnable.

Détermination de l&#39;activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

L'objectif général de la procédure suivante est d'évaluer rapidement l'activité des enzymes extracellulaires microbiennes dans divers environnements naturels. Cette évaluation est réalisée en ajoutant des échantillons d'eau ou de boues de sol dans une microplaque afin d'obtenir une réplication adéquate. Dans un deuxième temps, un substrat artificiel colorimétrique ou fluorimétrique est ajouté dans les puits de la microplaque, ce qui permet aux réactions enzymatiques de se produire. Ensuite, l'absorbance ou la fluorescence est mesurée afin de déterminer la quantité de produit final libérée au cours de la réaction.Les résultats montrent des différences d'activité enzymatique extracellulaire entre les échantillons, basées sur l'absorbance ou la fluorescence de la réaction finale. Aujourd'hui, nous allons démontrer comment mesurer l'activité enzymatique extracellulaire dans des environnements naturels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en écologie microbienne, telles que les taux de transformation de la matière organique et la minéralisation des nutriments dans les sols, les sédiments et les eaux. En général, les personnes novices dans l'utilisation de cette méth

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

Recherche

JoVE Journal

Environment

Environnement

Ce protocole décrit un écran haut débit pour l'activité cellulolytique d'une banque métagénomique exprimé dans Escherichia coli. L'écran est la solution basée et hautement automatisé et utilise un pot de chimie dans des microplaques 384 puits avec la lecture finale comme une mesure d'absorbance.

Un écran à haut débit pour la bioprospection minière activité cellulase à partir des bibliothèques métagénomique

Nous décrivons un faible coût, la méthode à haut débit pour le dépistage de l'activité endoglucanase...

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cette vidéo présente un test de dépistage de composés antimicrobiens qui éliminent efficacement les biofilms à l’aide d’une plaque cheville. La méthodologie surveille l'état métabolique du biofilm après un traitement avec des composés antimicrobiens, ce qui facilite la détermination de la concentration minimale d'éradication du biofilm.

Un dosage du biofilm sur plaque PEG pour le criblage d’agents antibactériens

Pour mesurer les taux potentiels de sol activités enzymatiques extracellulaires, des substrats synthétiques qui sont liés à un colorant fluorescent sont ajoutés à des échantillons de sol. L'activité enzymatique est mesurée en tant que le colorant fluorescent est libéré du substrat par une réaction catalysée par une enzyme, où la fluorescence est élevé, plus la dégradation du substrat.

À haut débit Fluorometric Mesure de sol Potentiel activités enzymatiques extracellulaires

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Ici, nous présentons des protocoles pour cribler et caractériser rapidement l’activité antimicrobienne des enzymes. Le test de diffusion sur microlames et le test de libération de colorant utilisent des substrats bactériens cibles pour l’évaluation qualitative et quantitative de l’activité enzymatique.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Ce travail présente une méthode de criblage à haut débit utilisant un système universel de criblage enzymatique génétique qui peut théoriquement être appliqué à plus de 200 enzymes. Ici, le système de criblage unique identifie trois enzymes différentes (lipase, cellulase et phosphatase alcaline) en changeant simplement le substrat utilisé (acétate de p-nitrophényle, p-nitrophényl-β-D-cellobioside et phosphate de phényle).

Multi-enzyme préalable au moyen d&#39;un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

Un test à haut débit pour le criblage enzymatique est décrit. Ce kit de dosage multiplexé prêt à l’emploi comprend des substrats pré-choisis de l’iomasseB hromogèneC (CPH) et des substrats complexes Inon solubles de l’iomasse Bhromogène (ICB). Les enzymes cibles sont les endoenzymes et les protéases qui dégradent les polysaccharides.

Criblage à haut débit d&#39;Enzymes Glucides dégradant Utilisation Novel Insoluble chromogénique Substrat Assay Kits

Nous présentons un protocole pour le dépistage rapide des échantillons environnementaux pour potentiel de sidérophores contribuant à la biodisponibilité des micronutriments et de chiffre d’affaires dans les systèmes terrestres.

Sidérophore High-throughput Screening d’échantillons environnementaux : planter la rhizosphère sols, sols en vrac et tissus

Les tests d'interaction de co-culture présentés dans ce protocole sont peu coûteux, haut débit, et simple. Ces essais peuvent être utilisés pour observer les interactions microbiennes dans la co-culture, identifier les modèles d'interaction et caractériser le potentiel inhibiteur d'une souche microbienne d'intérêt contre les agents pathogènes humains et environnementaux.

Tests de co-culture à haut débit pour l'étude des interactions microbiennes

Apprenez à mesurer l'activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, sols et sédiments par dosage colorimétrique ou fluorimétrique en microplaques. Cette méthode permet une analyse rapide et reproductible.

Détermination de lactivité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages (Vidéo) | JoVE Journal

Détermination de l'activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Explorer plus de vidéos