Détermination de l'activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

L'objectif général de la procédure suivante est d'évaluer rapidement l'activité des enzymes extracellulaires microbiennes dans divers environnements naturels. Cette évaluation est réalisée en ajoutant des échantillons d'eau ou de boues de sol dans une microplaque afin d'obtenir une réplication adéquate. Dans un deuxième temps, un substrat artificiel colorimétrique ou fluorimétrique est ajouté dans les puits de la microplaque, ce qui permet aux réactions enzymatiques de se produire. Ensuite, l'absorbance ou la fluorescence est mesurée afin de déterminer la quantité de produit final libérée au cours de la réaction.

Les résultats montrent des différences d'activité enzymatique extracellulaire entre les échantillons, basées sur l'absorbance ou la fluorescence de la réaction finale. Aujourd'hui, nous allons démontrer comment mesurer l'activité enzymatique extracellulaire dans des environnements naturels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en écologie microbienne, telles que les taux de transformation de la matière organique et la minéralisation des nutriments dans les sols, les sédiments et les eaux. En général, les personnes novices dans l'utilisation de cette méthode éprouvent des difficultés en raison de la séparation délicate des particules de la solution réactionnelle, particulièrement lors de l'analyse d'un grand nombre d'échantillons.

Une démonstration visuelle de cette procédure est essentielle, car la disposition des puits de la plaque peut être difficile à apprendre, et la prise de mesures à plusieurs intervalles rend cette procédure plus complexe. L'analyse colorimétrique de l'activité enzymatique extracellulaire pour les sols et les sédiments commence par la préparation du tampon substrat et des solutions étalons comme décrit dans le protocole écrit pour le sol ; préparez une suspension de chaque échantillon à analyser dans un tube stérile de centrifugation de 15 millilitres. Ajoutez une concentration d’environ un gramme par millilitre en utilisant un tampon acétate 50 millimolaire pour les sédiments.

Ajoutez suffisamment de tampon acétate pour rendre la suspension facilement pompable. Le volume exact de suspension nécessaire varie selon le nombre d'enzymes analysées, mais un minimum de cinq millilitres est recommandé. Vortexez chaque suspension jusqu'à ce que tous les grumeaux de sol ou de sédiment soient dispersés.

Et notez le volume final. Coupez l'extrémité des embouts de pipette avec des ciseaux avant la pipetage. Étant donné que les boues de sol ont tendance à obstruer les embouts, vortexez à nouveau chaque boue et pipetez immédiatement 150 microlitres dans chacun des six puits.

Sur un bloc de 96 puits profonds. Il est important de vortexer soigneusement et fréquemment. Afin de maintenir les particules du sol en suspension, laisser au moins deux puits par bloc vides pour servir de témoin de substrat.

Préparez 1 bloc de 96 puits pour chaque enzyme à tester. Versez environ cinq millilitres de tampon acétate dans un réservoir de pipette et utilisez une pipette multipicanaux pour ajouter 150 microlitres de tampon dans les deux derniers puits de chaque échantillon.

Pour les témoins de tampon d'échantillon et pour les deux puits témoins de substrat. Verser environ 10 millilitres de la solution de substrat p-nitrophénol ou PNP appropriée dans un réservoir de pipette et utiliser une pipette multipuits à huit canaux pour ajouter 150 microlitres de la solution de substrat dans les quatre premiers puits de chaque échantillon ainsi que dans les deux puits témoins de substrat. Noter l'heure à laquelle la réaction commence, dès l'ajout de la solution de substrat.

Incuber les plaques à température ambiante de 0,5 à quatre heures. Le temps d'incubation exact variera selon le niveau d'activité dans les échantillons et l'enzyme à doser. Pendant l'incubation des dosages, préparer une microplaque transparente de 96 puits.

Pour chaque bloc à puits profonds afin de lire l'absorbance, pipeter 190 microlitres d'eau distillée et 10 microlitres de soude à une molaire dans chaque puits de la microplaque. La soude ralentit la réaction enzymatique et augmente le pH, ce qui intensifie la couleur du PNP libéré pendant la réaction après incubation. Centrifuger les blocs de 96 puits à 2000 à 5 000 ×g pendant cinq minutes afin de former un culot de particules de sol.

Le retrait du liquide sans perturber le culot peut s'avérer difficile. Il faut éviter d'utiliser trop d'échantillon de sol au départ. Assurez-vous de centrifuger suffisamment longtemps et utilisez un mouvement précis mais assuré pour prélever le liquide.

Utilisez une pipette multicanal pour prélever 100 microlitres de chacun, en prenant soin d'éviter le culot. Transférez le liquide dans le puits correspondant d'une microplaque transparente de 96 puits préparée, allumez le lecteur de microplaque et configurez les logiciels nécessaires, puis enregistrez l'absorbance à 410 nanomètres. Après avoir déterminé la masse sèche des échantillons comme décrit dans le protocole écrit, calculez l'absorbance finale de chaque échantillon en soustrayant l'absorbance du témoin de l'échantillon de l'absorbance du test de l'échantillon.

Si les témoins de substrat présentent une absorbance élevée supérieure à 0,060, soustrayez-les. Puis, procédez au calcul de l'activité enzymatique en micromoles par heure par gramme de masse sèche à l'aide de cette équation. Après avoir organisé une microplaque noire pour chaque enzyme selon l'exemple indiqué dans le protocole écrit, versez environ cinq millilitres du premier échantillon d'eau dans un réservoir de pipette et utilisez une pipette à huit canaux pour transférer 200 microlitres dans chacun des puits.

Dans la colonne un de la microplaque, jetez les pointes de pipette utilisées et répétez selon les besoins pour chaque échantillon d’eau afin de remplir les colonnes une à neuf. Mettez en place des témoins pour tenir compte des échantillons, des étalons, du substrat et de l’arrêt de la réaction sur la même microplaque noire que les échantillons. Les témoins d’échantillon contiennent de l’eau échantillon et un tampon bicarbonate et ne sont pas utilisés dans les calculs d’activité, mais permettront de démontrer la cohérence des mesures tout au long de l’expérience.

Les témoins de trempe sont constitués d'eau échantillon et d'une quantité standard de marqueur fluorescent, et servent à mesurer la diffraction de la fluorescence. Les témoins d'eau échantillon et de substrat sont composés respectivement soit de substrat lié, soit de marqueur fluorescent standard, ainsi que de tampon bicarbonate. Versez environ cinq millilitres de tampon bicarbonate cinq millimolaire dans un réservoir de pipette propre.

Introduisez 50 microlitres de tampon dans les puits un à neuf des lignes d et e de la microplaque afin de former deux puits témoins par échantillon ; changez les embouts de pipette, puis transférez 200 microlitres de tampon bicarbonaté dans les puits 10 à 12 des lignes A et H. Bien que l’éclairage soit maintenu intense dans cette démonstration pour des raisons de tournage, il convient de réduire la lumière ambiante en atténuant ou en éteignant les luminaires, car l’étalon fluorescent est sensible à la lumière. Versez environ cinq millilitres de 10 micromolaire de 4-méthylumbelliférol (MUB) dans un réservoir de pipette propre, puis pipetez 50 microlitres dans les puits un à 12 de la ligne H. Ensuite, pipetez 50 microlitres dans les puits un à neuf des lignes G et F afin de constituer trois réplicats de témoins de piégeage par échantillon ainsi que des témoins standards globaux. Placez la microplaque à l’abri de la lumière ou recouvrez-la d’un couvercle opaque afin de limiter la dégradation de la MUB par la lumière, allumez le fluorimètre et configurez les logiciels nécessaires pour être prêt à effectuer la lecture avant d’ajouter le substrat.

Pour environ cinq millilitres du substrat MUB approprié placé dans un réservoir de pipette propre, utilisez un pipeteur à 12 canaux pour transférer 50 microlitres dans les puits un à douze de la rangée A et dans les puits un à neuf des rangées B et C, afin de réaliser trois tests en réplicat pour chaque échantillon et trois témoins de substrat. Procédez immédiatement à l’enregistrement de la fluorescence. Lisez la fluorescence initiale immédiatement après l’ajout du substrat dans la microplaque. Après la lecture, incubez la microplaque à température ambiante, à l’abri de la lumière ou recouverte d’un couvercle opaque.

Pour réduire la dégradation de MUB par la lumière. Le temps d'incubation nécessaire pour mesurer l'activité enzymatique potentielle maximale dépendra de la concentration de l'enzyme dans un échantillon. Étant donné que cette concentration est inconnue, avant le dosage de l'échantillon, une microplaque devra être lue à plusieurs intervalles de temps.

Pour la plupart des enzymes, des intervalles de 10 à 15 minutes sur une durée d'une heure sont appropriés, bien que certains échantillons à forte concentration atteignent leur maximum avant 10 minutes. Poursuivez la lecture de la fluorescence en microplaque aux intervalles prévus pendant au moins une heure. Veillez à garder la microplaque couverte ou à l'abri de la lumière entre les lectures.

Pour chaque échantillon et chaque intervalle de temps, calculez la fluorescence initiale moyenne de l'échantillon, la fluorescence finale moyenne de l'échantillon, la fluorescence moyenne du témoin standard et la fluorescence moyenne du témoin de blocage pour chaque intervalle de temps. Calculez l'activité enzymatique en m par heure par millilitre, en utilisant l'équation indiquée dans le protocole écrit.

Examinez les valeurs d'activité calculées pour chaque pas de temps et déterminez l'activité potentielle finale à partir du pas de temps présentant l'activité la plus élevée. Si les valeurs d'activité continuent d'augmenter, des pas de temps ultérieurs peuvent être nécessaires. Si les valeurs d'activité diminuent tout au long de l'expérience, refaites l'essai avec des pas de temps plus courts.

Les sols et les sédiments aquatiques présentent généralement des niveaux appréciables d'activité enzymatique extracellulaire en raison de communautés microbiennes fixées qui se développent à la surface des particules. Cette figure montre comment cette activité varie en fonction de la taille des particules provenant du sédiment de surface d'un cours d'eau de troisième ordre dans le nord du Mississippi, USA. Une étude précédente a montré que les communautés bactériennes présentes sur les particules de sédiment de ce cours d'eau peuvent être séparées en trois groupes distincts selon une analyse moléculaire de leur structure communautaire.

Ceux sur les particules de 0,063 millimètre, ceux sur les particules de 0,125, 0,25 et 0,5 millimètre, et ceux sur les particules d’un millimètre. L’analyse des profils d’activité des enzymes extracellulaires confirme cette conclusion, la phosphatase présentant des niveaux similaires sur les particules de 0,125, 0,25 et 0,5 millimètre, mais étant nettement plus élevée sur les fractions d’un millimètre et de 0,063 millimètre lorsqu’elle est mesurée à l’aide de la technique utilisant un substrat lié au PNP. D'autres enzymes telles que la bêta-glucosidase et la NAGase présentent des pics similaires sur les particules les plus fines, mais ne sont pas augmentées sur les particules d’un millimètre.

Mettre en évidence le fait que différentes enzymes peuvent présenter des répartitions environnementales distinctes, et que celles-ci peuvent être élucidées à l'aide de ce dosage. Les barres d'erreur relativement faibles indiquent que les dosages colorimétriques de l'activité enzymatique sur les sédiments sont reproductibles et donc adaptés à une analyse statistique. Lors de la comparaison de différents échantillons environnementaux, les eaux naturelles ont tendance à présenter une activité enzymatique extracellulaire par millilitre plus faible que les sols ou les sédiments par gramme.

À ce titre, elles doivent être analysées de manière florométrique à l'aide de substrats liés au MUB. Cette figure montre comment l'activité des enzymes, la phosphatase, bêta, glucosidase et les NGAs, varie en fonction de la profondeur. Dans un lac peu profond du nord du Mississippi, États-Unis, le lac est connu pour être pauvre en nutriments, ce que suggère également l'activité relativement élevée de la phosphatase et des enzymes que les micro-organismes produisent afin d'acquérir du phosphate à partir de composés organiques.

Pour les trois enzymes, les échantillons d'analyse prélevés à la surface de l'eau et à une profondeur de 50 centimètres ont montré une activité similaire. Alors que l'activité était plus élevée dans l'échantillon à 100 centimètres, ce dernier provenait essentiellement de l'interface eau-sédiment, et la présence de particules de sédiment dans l'échantillon explique probablement l'activité plus élevée observée, en particulier pour les bêta-glucosidases et les N-AGAs. Comme avec les substrats PNP, les faibles barres d'erreur montrent que, même avec seulement trois mesures répétées, la reproductibilité des dosages fluorométriques utilisant des substrats MUB est élevée.

Notez que les unités d'activité enzymatique pour les échantillons d'eau sont exprimées en nanomoles de substrat consommé, tandis que celles de l'activité enzymatique sur les particules de sédiment sont exprimées en micromoles de substrat consommé, bien que la taille unitaire soit comparable. Cela souligne le fait que les sols et les sédiments ont tendance à présenter une activité extracellulaire nettement plus élevée que les eaux naturelles. Cela démontre également la sensibilité accrue de la technique utilisant le substrat lié au MUB et la nécessité d'utiliser cette méthode pour doser l'activité enzymatique extracellulaire dans les échantillons d'eau, une fois maîtrisée.

Cette technique peut être utilisée pour analyser neuf échantillons d'eau pour jusqu'à des enzymes en un peu plus d'une heure. Lors de l'application de cette procédure aux sols et aux sédiments, il est important d'utiliser un matériau massique connu afin que l'activité puisse être exprimée sur une base de poids sec. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer l'activité des enzymes extracellulaires dans divers environnements naturels, en utilisant soit des techniques colorimétriques, soit fluorimétriques.