Name: Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Découvrez une approche comparative d'interactomique combinant Y2H et HT-GPCA pour cartographier les interactions protéine-protéine hôte-pathogène. Cette méthode quantitative permet d'identifier des biomarqueurs spécifiques de génotypes et des cibles thérapeutiques potentielles.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été financé en partie par des fonds de l&#39;Institut Pasteur et par des subventions de la Ligue Nationale contre le Cancer (subventions R05/75-129 et RS07/75-75), l&#39;Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC subventions A09 / 1/5031 et 4867), et l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 et 026 01 ANR09 MIEN). MM a été récipiendaire d&#39;une bourse MENRT.

1. Levures Examens double-hybride <ol><li> Faire les solutions requises suivantes: <ol><li> Complete Out Drop synthétique (SD): dissoudre 26,7 g de la base minimale SD avec du glucose dans 1 litre d&#39;eau. Ajouter 2 g de mélange d&#39;acide aminé préparée comme suit: 2 g hemisulfate Adénine, 2 HCl arginine g, 2 HCl histidine g, 2 g Isoleucine, 4 g de leucine, 2 HCl lysine g, 2 g de méthionine, 3 g phénylalanine, 2 g L -sérine, 2 g de L-thréonine, le tryptophane 3 g, 2 g Tyrosine, 1,2 g uracile, 9 g de valine. </li><li> Baisse sélective Out SD-L/-W/-H: SD contenant tous les acides aminés essentiels, sauf celles spécifié (-L:-leucine;-W:-tryptophane;-H:-histidine). </li><li> YPGlu: Pour 1 L, poids 10 g d&#39;extrait de levure, 10 g de Bactopeptone et 20 g de glucose. Complet avec 25 g Bacto agar pour un milieu solide. </li><li> YCM: Idem YPGlu, mais le pH ajusté à 4,5. </li></ol></li><li> L&#39;accouplement et la diffusion <ol><li> Utilisez portions congelées de pré-transformationed Y187 souche de levure (mating type α) contenant une banque d&#39;ADNc cloné dans pACT2. Vérifier la viabilité des cellules en étalant des dilutions en série sur des plaques SD-L. </li><li> Clonage de l&#39;ORF pathogène dans pGBKT7 vecteur, et de transformer le plasmide recombinant utilisant une procédure standard dans AH109 souche de levure (mating type a). </li><li> Propagation pGBKT7 transformées AH109 levure sur des plaques SD-W. Incuber deux jours au moins 30 ° C dans un incubateur humidifié. Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C jusqu&#39;à ce que le dépistage du double hybride. </li><li> Utilisation 3-aminotriazole (3-AT), un inhibiteur compétitif de l&#39;enzyme HIS3, pour contrer le potentiel d&#39;auto-transactivation du gène rapporteur HIS3 par les protéines de l&#39;pathogènes. Effectuer un test d&#39;auto-activation par la détermination de la concentration de 3-AT, ce qui empêche la croissance de la levure transformée pGBKT7 sur des plaques SD-W/-H. </li><li> Seed 30 ml de SD-W avec quelques colonies de pGBKT7 transformé AH109. Incuber 30 heures à 30 ° C avec rotation. </li><li> Seed 200 ml de SD-W avec les 30 mldes AH109 cultures. Incuber avec rotation autour de 20 heures à 30 ° C. </li><li> Incuber décongelé ADNc bibliothèque transformée Y187 dans 20 ml YPGlu, incuber 10 min à 30 ° C avec rotation. </li><li> Centrifugeuse un volume de pGBKT7 transformé AH109 culture correspondant à une quantité équivalente de Y187 cellules de levure viables pendant 5 min à 3500 rpm à 20 ° C. Retirer délicatement le surnageant et remettre le culot dans 10 ml YPGlu. </li><li> Mélanger la levure AH109 remis en suspension avec Y187 bibliothèque contenant. Transférer dans un tube de 50 ml. Centrifuger 5 min à 3500 rpm à 20 ° C, retirer soigneusement le surnageant (fragile granulés). </li><li> Remettre le culot en YPGlu pour obtenir un total de 1,5 ml. </li><li> levure de propagation à 3 YCM-Agar plaques de 150 mm, 0,5 ml / plaque. Incuber 4,5 heures à 30 ° C. </li><li> Recueillir levure accouplé à partir de plaques YCM en grattant avec un verre de râteau dans 10 ml de SD-L/-W/-H. Rincer les plaques deux fois avec 5 ml de milieu SD-L/-W/-H et la piscine. </li><li> Centrifuger 5 min à 3500 rpm, 20° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 levure moyen SD-L/-W/-H ml. </li><li> Étaler la levure accouplé à 10 plaques (0,5 ml / plaque) d&#39;agar SD-L/-W/-H complétées avec la concentration appropriée de 3-aminotriazole (3-AT) déterminé dans le test d&#39;auto-activation. Incuber à 30 ° C dans une atmosphère humidifiée pour 6-10 jours. </li><li> Déterminer le taux de diploïdes (2n), afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité de l&#39;accouplement en étalant 250 ul de dilutions en série (10 -4 à 10 -6) de la suspension de levure accouplées sur des plaques de SD-L/-W. Incuber les plaques à 30 ° C pendant deux jours. Compter les colonies cultivées sur SD-L/-W, et en déduire le nombre diploïde totale présente dans le volume initial de levure accouplés. Signaler ce nombre diploïde de viable nombre de levure bibliothèque contenant de calculer le taux diploïde. Il devrait se situer autour de 10-25%. </li><li> 6-10 jours après incubation à 30 ° C, prélever des colonies de levures accouplées à SD-L/-W/-H frais + 3-AT plaques. [Astuce: pour la levure dans un schéma de 8voies de 12 puits reproduisant une plaque de 96 puits de sorte qu&#39;il sera plus facile ensuite pour le séquençage]. Laissez colonies de levures se développent pendant 4-5 jours à 30 ° C dans une atmosphère humidifiée. </li></ol></li><li> Dépistage de his3 clones positifs par PCR et séquençage L&#39;objectif est d&#39;amplifier par PCR l&#39;ORF contenue dans les pACT2 vecteurs de colonies de levures cultivées sur des plaques de SD-L/-H/-W sélectifs. <ol><li> Mettez une plaque à 96 puits PCR sur la glace. </li><li> Pour lyse des cellules de levure, ajouter 50 ul par puits d&#39;une solution 20T zymolase (2,5 mg / ml dans 10 mM de tampon HEPES pH 7,7). </li><li> Resuspendre doucement une colonie par puits. </li><li> Incuber 15 minutes à 37 ° C et 15 min à 95 ° C. </li><li> Mettez la plaque arrière sur la glace. Ajouter 50 ul d&#39;eau distillée par puits. Bien mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 3500 rpm et 4 ° C. </li><li> Amplifier par PCR de 10 ul de détecter une insertion en utilisant des amorces de recuit les deux côtés de l&#39;ORF dérivés d&#39;ADNc dans des vecteurs PACT2. Le protocole est gompte tenu de l&#39;amplification de 96 colonies de levures lysées avec le ExTaq polymérase. Préparer le mélange suivant: 525 pi de tampon 10X ExTaq, 420 pl dNTP mix (2,5 mM), 10,5 ul Forward Primer (1 pg / pl), 10,5 ul amorce inverse (1 pg / pl), 31,5 ul ExTaq (5 U / pl ) et 3202,5 ​​pi H 2 0. Distribuer 40 ul du mélange par puits dans une plaque PCR 96 puits. Ajouter 10 ul de levure lysée par puits. Effectuer une amplification comme suit: 94 ° C pendant 3 min, puis 35 cycles à 94 ° C pendant 30 sec, 60 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 4 min, et se terminent par 72 ° C pendant 7 min. Exécuter 3 ul des produits de PCR sur un gel d&#39;agarose à 1,2% pour détecter des clones positifs à la PCR. Notez que l&#39;utilisation préfabriqué 96 et des gels d&#39;agarose est recommandé. [Astuce: plaque peut être conservé à -20 ° C pendant quelques mois et réutilisée pour une nouvelle PCR] </li><li> Séquencer les fragments amplifiés par PCR isolés de HIS3 clones positifs. Effectuer une analyse de BLAST pour identifier cellulaire ORF. Alignements faible confiance (E &amp; valeurgt; 10 -10, identité &lt;80%, longueur peptide &lt;20 acides aminés) sont rejetés ainsi que frameshifted et codon stop prématuré contenant des séquences. </li></ol></li></ol> 2. Bâtiment matrice pour HT-ACPG HT-ACPG est un test basé sur des cellules de mammifères où les deux protéines pathogènes et l&#39;hôte sont exprimés transitoirement fusionné avec des fragments complémentaires de la scission Gaussia princeps luciférase. Lors de l&#39;interaction des partenaires, cette enzyme est reconstitué en permettant la mesure de son activité enzymatique. L&#39;intensité de l&#39;interaction est donc déduit un ratio de Luminescence normalisé (voir ci-dessous et la figure 1) <ol start="4"><li> Sélection des partenaires de la cellule hôte <ol><li> Sélectionnez protéines qui sont identifiés plus de trois fois dans les projections Y2H pour une validation supplémentaire dans les cellules de mammifères pour augmenter la confiance des données 9. </li><li> Ajouter partenaires d&#39;interaction connues des protéines pathogènes comme positive contrôles. </li></ol></li><li> Transférer dans des vecteurs compatibles HT-ACPG <ol><li> Cloner chaque protéine ORF pathogène dans un vecteur pSPICA-N2 pour générer des protéines pathogènes avec des acides aminés 110 à 185 des princeps Gaussia humanisés luciférase soudés à leur extrémité N-terminale (fusions de protéines GL2-pathogène). </li><li> Amplifier par PCR protéine cellulaire ORF directement à partir des clones positifs Y2H ou de l&#39;ORF autres ressources (ORFéome humain <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ) et de les transférer dans des vecteurs pSPICA-N1 pour générer des protéines fusionnés à l&#39;extrémité N-terminale avec les acides aminés 18-109 de humanisé Gaussia princeps luciférase (fusions de protéines GL1-hôte). [Astuce: Pour le clonage à grande échelle, le système de clonage Gateway est recommandé. Dans ce cas, pour l&#39;amplification PCR, utiliser des amorces conçues pour contenir des sites compatibles Gateway]. </li><li> Séquence tous les vecteurs d&#39;expression. Séquences de la pSPICA-N1-N2 et pSPICApeut être trouvée dans la référence 8. </li></ol></li></ol> Notez que les constructions de plasmide peut être inversée, c&#39;est à dire les protéines pathogènes dans pSPICA-N1 et accueil protéine dans pSPICA-N2. 3. High-Throughput Gaussia princeps luciférase-Based Assay de complémentation protéique (HT-ACPG) <ol start="6"><li> La transfection cellulaire <ol><li> cellules 293T de semences à 350.000 cellules / ml de DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), sans antibiotique. Distribuer 100 pl / puits dans des plaques de culture stériles blanches. Ne pas dépasser 10 plaques en une seule expérience. Laissez cellules se développent pendant 24 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. [Astuce:. Depuis les plasmides pSPICA contiennent une origine SV40, l&#39;utilisation de cellules 293T permet leur réplication dans les cellules transfectées et donc conduit à la surexpression des deux fragments de luciférase] </li><li> Le lendemain, transfecter des cellules à l&#39;aide de n&#39;importe quel protocole de transfection approprié. Notez que pour certains réactifs de transfection, le numbre de cellules ensemencées peut être adapté. Utilisez 100 ng par puits à la fois l&#39;agent pathogène et hôte ORF des constructions plasmidiques. Co-transfect 10 ng par puits d&#39;une de CMV-luciférase Firefly plasmide pour normaliser l&#39;efficacité de la transfection. Chaque point est testé en triple. [Astuce:. Mélanges d&#39;ADN peuvent être effectuées la veille de la transfection et conservés à -20 ° C avec des joints adhésifs] </li><li> Transfert mélange de transfection pour les plaques de cellules 293T culture. Attention à déposer délicatement le mélange de l&#39;ADN sur les cellules, comme 293T ne sont pas fortement adhérent et se détachent facilement du fond du puits. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire pour 24-30 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> La lyse des cellules et Gaussia dosage de la luciférase <ol><li> Laver les cellules avec du PBS (100 pl / puits). Ajouter 40 tampon de lyse 1X Rénilla ul. Incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation. </li><li> Économisez 10 pi de lysats de cellules dans un autre plat blance pour le dosage ultérieur de l&#39;activité de la luciférase de luciole. Conserver à 4 ° C ou bien à -20 ° C avec joint d&#39;étanchéité. </li><li> Mesurer l&#39;activité Gaussia sur les 30 pi restants de lysats de cellules en ajoutant 100 ul de réactif de dosage de la luciférase Renilla et de comptage luminescence pendant 10 secondes avec un luminomètre. Dosage d&#39;une plaque de 96 puits prend environ une demi-heure. Effectuer la mesure avec des extraits de cellules fraîches depuis la congélation ou à long terme peut affecter l&#39;activité Gaussia interaction médiée. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Mesure de l&#39;activité Firefly <ol><li> Mesurer l&#39;activité Firefly sur le économisé 10 pi de lysats de cellules en ajoutant 50 pl de Firefly réactif de dosage de la luciférase et de comptage luminescence pendant 10 sec. Dosage d&#39;une plaque de 96 puits prend environ une demi-heure. [Astuce: Le dosage de la luciférase Firefly peut être effectuée le lendemain sur les lysats congelés.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> Calculs de NLR <ol><li&gt; A chaque interaction, calculer le rapport entre l&#39;activité de luciférase de luciole et de Gaussia activité luciférase pour obtenir une valeur de luminescence Gaussia normalisée en tenant compte de l&#39;efficacité de transfection et de la viabilité des cellules. Calculer la moyenne des trois exemplaires. </li><li> Pour surveiller l&#39;interaction, estimer un rapport de Luminescence normalisé (NLR) pour chaque paire pathogène-hôte. Pour ce faire, il faut diviser l&#39;activité de luminescence Gaussia normalisée détectée en présence de l&#39;agent pathogène et les deux protéines de l&#39;hôte par la somme des activités mesurées dans les puits de contrôle (figure 1 d&#39;après la référence 8). Le NLR valeur seuil pour les interactions positives a été estimée à environ 3,5 8. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> L&#39;analyse des données <ol><li> Effectuer classification hiérarchique utilisant le paquet statistique R. Tout d&#39;abord, grouper les données de NLR dans des catégories, puis calculer un dendrogramme d&#39;interaction en utilisant la méthode de liaison complète. Visualiser cettedendrogramme avec JavaTreeView 10. Calculez la distance entre dendrogramme de l&#39;interaction et de l&#39;arbre phylogénétique en utilisant un coefficient de corrélation de Pearson. </li><li> Pour générer des réseaux d&#39;interaction, sélectionnez les interactions positives de l&#39;ensemble de données HT-ACPG et utiliser le logiciel Cytoscape 1. Extraire les degrés des protéines de l&#39;hôte et tracer leur distribution pour accéder aux dynamiques locales réseau. Réseaux pathogènes hôte peuvent être superposées à la Interactome hôte de fournir une évaluation de l&#39;impact global des protéines pathogènes dans le réseau cellulaire de l&#39;hôte. </li><li> Extraire le GO (Gene Ontology) termes associés aux facteurs cellulaires ciblés avec la base de données bioinformatiques DAVID 12 pour évaluer l&#39;enrichissement fonctionnel de l&#39;ensemble de données. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+viruses+hijack+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li>
<li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li>
<li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+protein+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230(2008).</li>
<li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26(2012).</li>
<li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32(2008).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li>
<li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li>
<li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li>
<li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li>
<li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape+2.8%3A+new+features+for+data+integration+and+network+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761(2012).</li>
<li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li>
<li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Indépendamment, la levure deux essais d&#39;interaction hybrides et les mammifères, comme la TPS déroulant, LUMIER ou MAPPIT, se sont avérés être des outils efficaces pour détecter les interactions protéine-protéine, mais sont limitées par le taux élevé de faux positifs et de faux négatifs interactions associés à ces techniques 15. En outre, les preuves sont de plus en plus que la combinaison de méthodes orthogonales augmente la fiabilité de l&#39;ensemble de données d&#39;interaction obtenu 7. Le ...

La quantité croissante de données recueillies pour produire des cartes d&#39;interaction protéine-protéine ouvre des perspectives pour mieux comprendre les infections pathogènes. Comme compréhension globale des infections pathogènes commence à émerger, il donne accès à la gamme des perturbations induites par les protéines pathogènes lors de la connexion du protéome humain 1. Il offre ainsi un moyen de comprendre comment les agents pathogènes manipuler la machinerie de la cellule hôte. En particulier, la cartographie de plusieurs réseaux d&#39;interactions virus-hôte a révélé que les protéines virales cibler préférentiellement les protéines hôtes qui sont fortement connectés dans le réseau cellulaire (hubs), ou qui sont au cœur de nombreux chemins dans un réseau (protéines goulets d&#39;étranglement) 2-4. Ces interactions permettent virus de manipuler les processus cellulaires importants, ce qui est essentiel à reproduire et produire une descendance infectieuse. Interactions cartographie comparée ont été récemment menées sur des virus apparentés dans le but d&#39;extraire des informations relatives àpathogenèse 4. En outre, des études sur la relation hôte-pathogènes interactions paysage ont été étendues à de nombreux agents pathogènes 5. L&#39;identification des facteurs de cellule ciblée donne un aperçu des stratégies utilisées par les agents pathogènes pour infecter les cellules et permet la détection de marqueurs potentiels pathogènes. Le système double-hybride en levure est la méthode la plus populaire pour identifier les interactions binaires depuis le dépistage génétique est un outil efficace et sensible pour la cartographie à haut débit des interactions protéine-protéine. L&#39;approche proposée ici améliore encore des projections de Y2H individuelles en évaluant une protéine de multiples variantes de souches de pathogènes, offrant ainsi l&#39;accès à une vue d&#39;ensemble comparative des interactions protéine-protéine pathogène-hôte. En outre, une limitation majeure de la levure dépistage double-hybride réside dans un taux de faux négatifs élevés, car il récupère environ 20% du total des interactions 6. Cela implique que les interactions détectées avec seulement un sous-ensemble de pathoGens variantes auraient échappé à la détection avec les autres. Par conséquent, chacun des partenaires issus de toutes les projections de deux hybrides sont rendues encore plus difficiles pour l&#39;interaction avec la gamme complète des souches étudiées, en fournissant des ensembles de données d&#39;interaction comparatifs. Comme il a été démontré que la combinaison de différentes méthodes augmente fortement la robustesse des ensembles de données d&#39;interaction protéine-protéine 7, cette validation est effectuée dans des cellules de mammifères par un essai de complémentation protéique fragment nouvellement développé appelé HT-ACPG 8. Ce système à base de cellules permet la détection des interactions protéine par complémentation de la Gaussia princeps divisé luciférase et a été conçu pour être compatible avec un format à haut débit. Merci à sa technologie luminescence basée et son faible bruit de fond par rapport à d&#39;autres test basé sur la fluorescence, HT-ACPG montre une grande sensibilité frappante. Dans l&#39;ensemble, cette approche constitue un moyen efficaceoutil pour générer une cartographie complète des imbrications hôte-pathogène, ce qui représente la première étape vers une compréhension globale de la cellule hôte détournement.

<table><tbody><tr><td>Souches de levure</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimal SD base</td><td>US biologique</td><td>D9500</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td><td>Acros organics</td><td>264571000</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase</td><td>Seikagaku</td><td>120491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin (PBS)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Renilla luciferase</td><td>test Promega</td><td>E2820</td><td></td></tr><tr><td>Blanc plaque de culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>96-wellPlaques PCR</td><td>4titude</td><td>4t-i0730/C</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur (30 &deg ; C)</td><td>Incubateur Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(37 &deg ; C)</td><td>Luminomètre Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Berthold</td><td>Centro XS-LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Des efforts importants ont été recueillies pour produire des cartes réseau interactions à grande échelle globale protéine-protéine. Cela est essentiel à comprendre les relations pathogène-hôte et a été essentiellement réalisée par des projections génétiques dans la levure de systèmes à deux hybrides. La récente amélioration de la détection des interactions protéine-protéine par un test de complémentation de fragment luciférase basé Gaussia offre maintenant la possibilité de développer des approches interactomic comparatives d&#39;intégration nécessaires pour comparer rigoureusement les profils d&#39;interaction des protéines de différentes variantes de la souche pathogène contre un ensemble commun de facteurs cellulaires. Ce document se concentre spécifiquement sur ​​l&#39;utilité de la combinaison de deux méthodes orthogonaux pour générer des ensembles de données d&#39;interaction protéine-protéine: deux hybrides de levure (Y2H) et un nouveau test, test à haut débit Gaussia princeps protéines complémentation (HT-ACPG) réalisée dans les cellules de mammifères. nt &quot;&gt; Une identification à grande échelle des partenaires cellulaires d&#39;une protéine pathogène est effectuée par base de levure accouplement projections de deux hybrides de banques d&#39;ADNc en utilisant de multiples variantes de souches de pathogènes. Un sous-ensemble de partenaires d&#39;interaction sélectionnés sur un score de haute fiabilité statistique est plus validé dans les cellules de mammifères pour les interactions par paire avec l&#39;ensemble des agents pathogènes les protéines variantes utilisant HT-ACPG. Cette combinaison de deux méthodes complémentaires améliore la robustesse de l&#39;ensemble de données d&#39;interaction, et permet l&#39;exécution d&#39;une analyse de l&#39;interaction comparatifs rigoureux. Ces interactomique comparatifs constituer une stratégie fiable et puissant pour décrypter toute les imbrications pathogène-hôte.

Une des grandes forces de HT-ACPG réside dans sa sensibilité élevée, comme en témoigne l&#39;évaluation des taux négatifs faux positifs et faux pour la protéine E2 du VPH dans la figure 2 (adapté de la référence 13). Pour déterminer le taux de faux négatifs, les interactions connues de E2 de HPV16 ont été évalués par HT-ACPG (figure 2A). Quatre des 18 interactions n&#39;ont pas été récupérés (correspondant à un taux de faux négatifs de 22%). Les interactions faux positifs ont été mesuré...

Cet article se concentre sur l&#39;identification des ensembles de données d&#39;interaction de haut confiantes entre l&#39;hôte et les protéines pathogènes en utilisant une combinaison des deux méthodes orthogonales: deux hybrides de levure suivie d&#39;un test d&#39;interaction à haut débit dans les cellules de mammifères appelé HT-ACPG.

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser des études ectomiques afin de comparer les profils d'interaction de protéines provenant de différentes variantes de pathogènes contre un ensemble commun de facteurs cellulaires. Cela est réalisé par des criblages basés sur la levure deux-hybride par accouplement de ADNc afin d'identifier les partenaires d'interaction potentiels des protéines provenant de différentes variantes de pathogènes. Dans une deuxième étape, les cadres de lecture ouverts des partenaires d'interaction sont séquencés et transférés dans des vecteurs compatibles pour une validation ultérieure.Ensuite, un ensemble de partenaires individuels issus de tous les criblages par double hybride est sélectionné et testé à nouveau pour leur interaction avec l'ensemble des souches étudiées. Cela est réalisé à l'aide d'un test de complémentation de fragments protéiques orthogonal, basé sur la luciférase, effectué dans des cellules de mammifères afin d'obtenir des jeux de données d'interaction comparatifs robustes. Les résultats montrent des intensités d'interaction différentes entre les protéines du pathogène et les protéines cellulaires, selon les mesures de lucifé

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo décrit le test de ligature de proximité pour étudier in situ les interactions protéine-protéine dans les cellules de nématodes. La proximité des protéines d’intérêt génère la matrice d’ADN circulaire à l’aide d’une sonde PLA attachée à un anticorps secondaire. La sonde est encore amplifiée à l’aide de la solution d’amplification, qui produit un long ADN simple brin suivi de l’hybridation de la sonde détecteur, permettant la localisation des interactions protéine-protéine dans les...

Essai de ligature de proximité pour étudier les interactions protéine-protéine in situ

Cet article illustre l’utilisation du marquage radio par chasse d’impulsions en combinaison avec la photoréticulation spécifique au site pour surveiller les interactions entre une protéine d’intérêt et d’autres facteurs chez E. coli. Contrairement aux méthodes traditionnelles de réticulation chimique, cette approche génère des « instantanés » à haute résolution d’une voie d’assemblage ordonnée dans une cellule vivante.

Surveillance de l’assemblage d’un facteur de virulence bactérienne sécrété à l’aide d’une réticulation spécifique au site

Les protéines interagissent entre elles et ces interactions déterminent en grande partie leurs fonctions. Les partenaires d’interaction protéique peuvent être identifiés à haut débit in vivo à l’aide d’un test de fitness chez la levure basé sur le test de complémentation de fragments de protéine dihydrofolate réductase (DHFR-PCA).

L&#39;échelle du génome interaction protéine-protéine Le dépistage par Protein-fragment complémentation Assay (PCA) dans les cellules vivantes

Décrit est un workflow protéomique pour identifier des partenaires d'interaction de protéine d'une fraction subcellulaire nucléaire utilisant l'enrichissement d'immunoaffinité d'une protéine donnée d'intérêt et de la spectrométrie de masse sans étiquette. Le flux de travail comprend la fractionnement subcellulaire, l'immunoprécipitation, la préparation de l'échantillon assisté par filtre, le nettoyage hors ligne, la spectrométrie de masse et un pipeline de bioinformatique en aval.

Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Cette étude visait à présenter une stratégie pour identifier les interactions médicament-peptide. La stratégie consiste à biopanner les peptides courts reconnaissant les médicaments à partir d'un biocapteur de microbalance quartz-cristal (QCM), suivi d'une analyse bioinformatique pour évaluer quantitativement les informations obtenues pour la reconnaissance et l'annotation des sites de liaison médicamenteux sur les protéines.

Stratégie d&apos;analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines

Ici, nous présentons un protocole pour profiler l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène pendant l’infection par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ce protocole utilise une quantification sans étiquette pour mesurer les changements dans l’abondance des protéines de l’hôte (p. ex., macrophages) et de l’agent pathogène (p. ex., cryptococcus néoformans)en une seule expérience.

Flux de travail quantitatif protéomique sans étiquette pour les interactions hôte-pathogène axées sur la découverte

Le protocole présenté ici décrit un pipeline complet pour analyser les données de transcriptome de séquençage de l’ARN, des lectures brutes à l’analyse fonctionnelle, y compris le contrôle de la qualité et les étapes de prétraitement aux approches analytiques statistiques avancées.

Analyse du transcriptome à haut débit pour l’étude des interactions hôte-pathogène

Nous présentons un outil de biologie des systèmes JUMPn pour effectuer et visualiser l’analyse de réseau pour des données protéomiques quantitatives, avec un protocole détaillé comprenant le prétraitement des données, le regroupement de co-expression, l’enrichissement des voies et l’analyse du réseau d’interaction protéine-protéine.

JUMPn : Une application simplifiée pour le regroupement de la co-expression des protéines et l’analyse des réseaux en protéomique

Ici, nous présentons un protocole permettant la capture et l’identification d’interactions protéine-protéine spécifiques à une maladie à partir de cellules et de tissus natifs à l’aide de sondes chimiques et de spectrométrie de masse. Les ensembles de données d’interaction qui en résultent sont analysés par le biais d’une plate-forme Web dédiée pour révéler les dysfonctionnements dynamiques du réseau et les altérations des voies liées à la maladie.

Cartographie des interactions protéine-protéine dysfonctionnelles dans la maladie

Une méthode est décrite de sélectionner individuellement, manipuler, et les agents pathogènes d'image en direct en utilisant un piège optique couplé à un microscope à disque rotatif. Le piège optique offre un contrôle spatial et temporel des organismes et les places adjacentes aux cellules hôtes. La microscopie à fluorescence capture dynamique des interactions intercellulaires avec perturbation minimale pour les cellules.

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Découvrez une approche comparative d'interactomique combinant Y2H et HT-GPCA pour cartographier les interactions protéine-protéine hôte-pathogène. Cette méthode quantitative permet d'identifier des biomarqueurs spécifiques de génotypes et des cibles thérapeutiques potentielles.

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Explorer plus de vidéos