Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

L’objectif général de l’expérience suivante est d’effectuer des études ectomiques pour comparer les profils d’interaction des protéines de différents variants pathogènes avec un ensemble commun de facteurs cellulaires. Ceci est réalisé par l’accouplement de levures basées sur l’accouplement, deux criblages hybrides d’ADNC pour identifier les partenaires d’interaction potentiels des protéines de différents variants pathogènes. Dans un deuxième temps, les cadres de lecture ouverts des partenaires en interaction sont séquencés et transférés dans des vecteurs compatibles pour une validation ultérieure.

Ensuite, un ensemble de partenaires individuels émergeant des deux criblages hybrides est sélectionné et testé à nouveau pour leur interaction avec la gamme complète de souches étudiées. Cela se fait à l’aide d’un test de complémentation de fragments de protéine basé sur la luciférase orthogonale gia effectué sur des cellules de mammifères afin de fournir des ensembles de données d’interaction comparative robustes. Les résultats montrent différentes intensités d’interaction entre les protéines pathogènes et les protéines cellulaires sur la base des mesures de luciférase obtenues, et fournissent ainsi un aperçu comparatif des interactions entre les protéines de l’hôte de l’agent pathogène.

Le traitement des profils d’interaction par regroupement hiérarchique corrèle des interactions spécifiques entre des agents pathogènes de l’hôte et des traits pathologiques, et donne des informations sur l’implication des protéines pathogènes dans la pathogenèse. Le principal avantage de cette approche par rapport à d’autres méthodes de cartographie des interactions pathogènes-protéines hôtes-protéines est qu’elle fournit un ensemble de données comparatives rigoureuses sur les interactions entre plusieurs variantes de souches. Ces techniques donnent un aperçu du réseau d’interaction d’une protéine pathogène, mais elles peuvent également être appliquées à d’autres systèmes en tant que molécule infectieuse utilisant des virus complets et la génétique des rivières, par exemple, Commencez ce protocole par l’accouplement et la propagation des cellules de levure comme décrit dans la graine de protocole écrite.

30 millilitres de milieu d’abandon sélectif dépourvu de tryptophane avec quelques colonies de souche de levure AH 1 0 9 transformée avec le plasmide P-G-B-K-T sept exprimant la protéine pathogène. Incuber 30 heures à 30 degrés Celsius avec rotation. Graine suivante, 200 millilitres de milieu de chute sélective moins tryptophane avec les 30 millilitres de AH 1 0 9.

Les cultures incubent en rotation pendant 20 heures à 30 degrés Celsius. De plus, la bibliothèque CDNA a transformé Y 187 en 20 millilitres de colle YP pendant 10 minutes à 30 degrés Celsius avec rotation. Ensuite, centrifugez un volume de la culture AH 109 transformée PG BK T sept correspondant à une quantité équivalente de cellules de levure Y 187 viables pendant cinq minutes à 3 500 tr/min et 20 degrés Celsius.

Retirez délicatement le surnageant et Resus suspendez le palais dans 10 millilitres de colle YP. Mélangez la levure AH 109 remise en suspension avec la bibliothèque contenant Y 187. Transférer dans un tube de 50 millilitres avant de centrifuger pendant cinq minutes à 3 500 tr/min et 20 degrés Celsius.

Après avoir soigneusement retiré le super dat Resus, suspendez le granulé dans de la colle YP pour obtenir un total de 1,5 millilitres. Ensuite, étalez la levure sur trois assiettes de gélose YCM, 150 millimètres à 0,5 millilitre par assiette et incubez 4,5 heures à 30 degrés Celsius. Récupérez la levure accouplée dans les assiettes YCM en grattant avec un verre râteau dans 10 millilitres de milieu de chute sélective moins de leucine, de tryptophane et d’histidine.

Rincez la plaque deux fois avec cinq millilitres du même milieu et faites une piscine après centrifugation pendant cinq minutes à 3 500 tr/min et 20 degrés Celsius. Jeter le surnageant et le reus. Suspendez la pastille de levure dans cinq millilitres de milieu de chute sélective moins leucine, tryptophane et histidine.

Ensuite, étalez la levure accouplée sur 10 plaques de gélose sélective moins la leucine, le tryptophane et l’histamine complétées par la concentration appropriée de trois amino triazole ou trois à déterminée dans l’essai d’auto-activation. Calculer le taux diploïde tel que décrit dans le protocole écrit après l’incubation à 30 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée pendant six à 10 jours. Prélever les colonies de levure et les transférer dans des assiettes préparées fraîches à partir de gélose à chute sélective moins leucine, tryptophane et histidine plus trois a t.

Commandez la levure dans un schéma de huit voies de 12 puits reproduisant une plaque de 96 puits afin qu’il soit plus facile pour le séquençage plus tard. Laissez les colonies de levures se développer pendant quatre à cinq jours à 30 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée. L’objectif de cette section est de PCR, amplifier l’ADNC contenu dans le PA ct deux vecteurs de colonies de levures lysées cultivées sur des plaques de laquette sélective moins de leucine, de trytophane et d’histidine.

Commencez par placer une plaque PCR de 96 puits sur de la glace pour lycer des cellules de levure à 50 microlitres par puits de solution xmal 20 T. Remettre doucement en suspension une colonie par puits. Incuber la plaque 15 minutes à 37 degrés Celsius et 15 minutes à 95 degrés Celsius.

Après avoir remis la plaque sur de la glace, ajoutez 50 microlitres d’eau distillée par mélange de puits en pipetant de haut en bas, puis passez à la centrifugeuse pendant cinq minutes à 3 500 tr/min et quatre degrés Celsius. Après avoir préparé le mélange X tack comme décrit dans le protocole de texte, répartissez 40 microlitres du mélange par puits dans la plaque PCR à 96 puits. Ajoutez 10 microlitres de levure lysée par puits et effectuez l’amplification comme indiqué dans le protocole de texte.

Exécutez trois microlitres de produits PCR sur un gel agros à 1,2 % pour détecter les clones positifs à la PCR. Séquencer les fragments amplifiés par PCR isolés de ses trois clones positifs. Effectuez ensuite une analyse rapide pour identifier les trames de lecture ouvertes cellulaires, en éliminant les alignements à faible niveau de confiance ainsi que le décalage de cadre et le code d’arrêt prématuré sur les séquences contenant avant la transfection cellulaire.

Transférez la protéine pathogène et la protéine cellulaire en ouvrant les cadres de lecture dans leurs vecteurs respectifs pour générer des protéines fusionnées à des fragments de la Gaia luciférase comme détaillé dans le protocole de texte graine 2 9 3 cellules T à 350 000 cellules par millilitre de DMEM avec 10 % de sérum bovin fœtal sans antibiotique. Répartissez 100 microlitres par puits dans des plaques de culture blanches stériles avant de cultiver pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone le lendemain. Les cellules transfectrices utilisant n’importe quel protocole de transfection approprié utilisent 100 nanogrammes par puits de l’agent pathogène et de l’hôte : le cadre de lecture ouvert construit des constructions transfectées 10 nanogrammes par puits de plasmide de luciférase CMV pour normaliser l’efficacité de la transfection.

Chaque point est testé en mélange de transfection de transfert en trois exemplaires sur des plaques de cellules 2, 9 et 3 cellules T cultivées. Attention à déposer délicatement le mélange d’ADN sur les cellules car 2, 9, 3 cellules T ne sont pas fortement adhérentes et se détachent facilement du fond du puits, incuber dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 à 30 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, laver les cellules avec PBS à 100 microlitres par puits. Ajoutez 40 microlitres d’un lyse de vanille, tamponnez et incubez pendant 30 minutes à température ambiante.

Sous agitation, conservez 10 microlitres de lysats cellulaires dans une autre plaque blanche pour le dosage ultérieur de la luciférase stockée à quatre degrés Celsius ou alternativement à moins 20 degrés Celsius avec plafond pour mesurer l’activité de Gaia. Placez la plaque dans un luminomètre et injectez 100 microlitres de réactif de dosage de la luciférase à la vanille sur des lysats cellulaires. Comptez ensuite la luminescence pendant 10 secondes.

Le dosage d’une plaque à 96 puits prend environ une demi-heure. Utilisez toujours des extraits frais, car la congélation ou le stockage à long terme peut affecter l’activité de Gaia médiée par l’interaction sur les 10 extraits de cellules de microlitres restants. Injectez 50 microlitres de réactif de dosage de la luciférase dans les lysats cellulaires à l’aide d’un luminomètre et en comptant la luminescence pendant 10 secondes.

Le dosage d’une plaque à 96 puits prend environ une demi-heure pour chaque interaction. Calculez le rapport entre l’activité de la luciférase Gaia et l’activité de la luciférase des lucioles pour obtenir une valeur de luminescence GAIA normalisée. Prise en compte de l’efficacité de la transfection et de la viabilité cellulaire.

Calculez la moyenne des triplets pour surveiller l’interaction. Estimez un rapport de luminescence normalisé ou NLR pour chaque paire d’hôtes d’agents pathogènes. Pour ce faire, divisez l’activité de luminescence normalisée de GAIA détectée en présence de protéines pathogènes et hôtes par la somme des activités mesurées dans les puits de contrôle.

La valeur seuil du NLR pour les interactions positives a été estimée dans une étude précédente à environ 3,5. L’une des principales forces des préceptes GIA à haut débit, le test de complémentation des protéines, ou H-T-G-P-C-A, réside dans sa haute sensibilité, comme l’illustre l’évaluation des taux de faux positifs et de faux négatifs pour la protéine HPVE deux afin de déterminer le taux de faux négatifs. Les interactions connues de E deux du HPV 16 ont été évaluées par H-T-G-P-C-A ; quatre interactions sur 18 n’ont pas été récupérées, ce qui correspond à un taux de faux négatifs de 22 %.

Les interactions faussement positives ont été mesurées à 5,8 % en utilisant 12 protéines HPVE deux contre un ensemble aléatoire de protéines cellulaires. La forte spécificité de la méthode est mise en évidence dans cette figure montrant qu’une mutation ponctuelle unique connue pour interférer avec la liaison de E deux à son partenaire cellulaire BRD quatre annihile le rapport NLR. Cette approche ectomique comparative à grande échelle a récemment été appliquée avec succès à trois protéines précoces des virus du papillome humain, E deux, E six et E sept, provenant de génotypes différents, représentatifs de leur diversité naturelle en tropismes et pathologies pour chacune des protéines précoces.

Le regroupement hiérarchique des profils d’interaction, récapitule principalement la phylogénie HPV, prouvant la robustesse de l’approche et la pance des ensembles de données d’interaction. Il peut être utilisé pour corréler des profils d’interaction spécifiques de l’hôte du virus avec des traits pathologiques, donnant ainsi des indices sur l’implication des protéines virales. Dans la pathogenèse, des interactions spécifiques au génotype peuvent être extraites, qui correspondent potentiellement à un tropisme ou à des biomarqueurs pathogènes.

Comme illustré ici pour E six partenaires en interaction, les cibles cellulaires ont été triées en fonction de l’intensité de l’interaction et regroupées en fonction du type de VPH en interaction. Cette représentation permet l’identification de biomarqueurs spécifiques tels que la fad, qui n’interagit qu’avec les protéines E six du HPV oncogène. Un tel ciblage doit être crucial pour le caractère cancérogène de tous les HPV oncogènes et constitue donc un bon candidat pour être utilisé soit comme marqueur de substitution de l’infection par le HPV, soit comme cible thérapeutique.

En suivant cette procédure. Le H-T-G-P-C-A peut être adapté pour être utilisé avec une troisième protéine exprimée sous forme de fusion avec un marqueur de biotine. Cela permet de capturer trois complexes partenaires sur des plaques de couleur de plongée streptococcique, et cela peut répondre à la question de la formation de grands complexes protéiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de caractériser les interactions entre les agents pathogènes et les pots hôtes. Troisièmement, en sondant les partenaires d’interaction de plusieurs variantes de souches. Deuxièmement, en comparant leur interaction avec tout un ensemble de types d’agents pathogènes à l’aide d’une durée de protéine protéique, par exemple dans des cellules de mammifères.