Name: Rapides à haut débit amylose Détermination dans lyophilisé échantillons de pommes de terre de tubercules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Apprenez une méthode colorimétrique à haut débit pour déterminer les proportions d'amylose et d'amylopectine dans l'amidon de pomme de terre. Cette technique permet d'évaluer rapidement de grandes populations de clones.

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Le financement de cette recherche a été assuré en partie par le Comité des cultures de matériel génétique USDA programme et associé de recherche de l&#39;USDA-ARS.

Une. Détermination de la pomme de terre amylose Tuber amidon <ol><li> Peler et couper les tubercules frais en petits cubes. </li><li> Placez les cubes de pommes de terre dans de petits sacs bruns et stocker pendant une nuit à -80 ° C. </li><li> Transfert cubes de pommes de terre dans des sacs de nylon et de lyophilisation. </li><li> Après lyophilisé, broyer l&#39;échantillon de pommes de terre en poudre en utilisant un mortier et un pilon ou un broyeur Wiley. </li><li> Dans un tube de 50 ml, ajouter 20 à 30 mg de l&#39;échantillon de sol tubercule lyophilisée. </li><li> Préparer une solution de 45% (p / v) d&#39;acide perchlorique (mélange 24,4 ml d&#39;acide perchlorique à 60% et 25,6 ml d&#39;eau ultra-pure. </li><li> Ajouter 500 ul de 45% (p / v) d&#39;acide perchlorique et secouer ou agiter pour disperser les granules d&#39;amidon. </li><li> Après une période d&#39;incubation de quatre minutes à la température ambiante, ajouter 16 ml d&#39;eau ultra-pure à la solution et mélanger au vortex. </li><li> Après matériau non soluble a déposé au fond du tube (7-10 min plus tard), transférer 40 pi de la solution sur une plaque de microtitration (éviter le pipetage de toutes les particules). </li><li> Ajouter 50 ul de solution d&#39;iode (KI à 2 g + 1 g d&#39;I2 dans 900 ml d&#39;eau ultra-pure) et mélanger l&#39;échantillon par pipettage. </li><li> Lire l&#39;absorbance à 550 nm et 620 nm immédiatement. </li><li> Déterminer le pourcentage d&#39;amylose après comparaison du rapport amylose / amylopectine de chaque échantillon (620 nm/550 nm l&#39;absorbance) avec une courbe standard générée à partir de solutions d&#39;amylose et d&#39;amylopectine dans une gamme de concentrations. Cette procédure sera maintenant décrit. Lire l&#39;ébauche (solution d&#39;iode et de l&#39;acide perchlorique) en même temps que les échantillons d&#39;essai. Utilisation blanchi données pour les analyses. </li></ol> 2. Amylose / amylopectine Curve <ol><li> Dans des tubes séparés pèsent 12,5 mg de l&#39;amylose et de l&#39;amylopectine 12,5 mg. </li><li> Ajouter à chaque tube 5 ml de 45% (p / v) d&#39;acide perchlorique et se dissoudre complètement. </li><li> Pour chacune des solutions (amylose et amylopectine), amener à un volume final de 50 ml avec de l&#39;eau ultra-pure. </li><li> Mélanger 6,25ml de stock amylose de l&#39;étape précédente avec 18,75 ml d&#39;eau ultra-pure. Cela fera une solution d&#39;amylose 6,25 mg / ml. </li><li> Répétez la procédure pour la solution de l&#39;amylopectine. </li><li> Utilisation de l&#39;amylose et des solutions standard de l&#39;amylopectine à partir des étapes 2,4 et 2,5, préparer des normes de teneur en amylose de 0 à 100 pour cent qui sont des% d&#39;amylose (100-0% d&#39;amylopectine) à un volume final de 5 ml pour créer la courbe d&#39;étalonnage à des intervalles de 10%. Par exemple, pour préparer: L&#39;amylose / 100% d&#39;amylopectine-type de 0%, une pipette 5 ml de solution d&#39;amylopectine. L&#39;amylose / 90% d&#39;amylopectine norme de 10%, mélanger 0,5 ml 4,5 ml d&#39;amylose et d&#39;amylopectine solutions. L&#39;amylose / 80% d&#39;amylopectine norme de 20%, mélanger 1,0 ml 4,0 ml d&#39;amylose et d&#39;amylopectine solutions. L&#39;amylose / 70% de la norme de 30% d&#39;amylopectine, de l&#39;amylose combiner 1,5 ml et 3,5 ml des solutions d&#39;amylopectine. L&#39;amylose / 60% de la norme de 40% d&#39;amylopectine, de l&#39;amylose combiner 2,0 ml et 2,0 ml des solutions d&#39;amylopectine. Le 50% d&#39;amylose/ 50% d&#39;amylopectine norme, mélanger 2,5 ml 2,5 ml d&#39;amylose et d&#39;amylopectine solutions. L&#39;amylose / 40% de la norme de 60% d&#39;amylopectine, de l&#39;amylose combiner 3,0 ml et 2,0 ml d&#39;amylopectine, et ainsi de suite). </li><li> Transférer 40 pl de chaque mélange standard à une plaque de microtitration. Inclure un puits avec 40 ul de 45% (p / v) d&#39;acide perchlorique le vide. </li><li> Ajouter 50 ul de solution d&#39;iode (KI à 2 g + 1 g d&#39;I2 dans 900 ml d&#39;eau ultra-pure) et mélanger chacun des échantillons (y compris le blanc) par pipetage. </li><li> Lire les absorbances à 550 nm et 620 nm immédiatement et calculer le rapport amylose / amylopectine pour chaque concentration. </li></ol>

<ol><li>Composition Hoover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+structure%2C+and+physicochemical+properties+of+tuber+and+root+starches%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr%22%5BJournal%5D)">molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review.</a> Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).</li>
<li>Bertoft, E., Blennow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Potato+Starch%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Potato+Chemistry+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Structure of Potato Starch.</a> Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).</li>
<li>Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+amylose+screening+in+maize+starches+from+exotic+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds.</a> Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).</li>
<li>Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+amylose+determination+methods+and+the+development+of+a+dual+wavelength+iodine+binding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique.</a> Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).</li>
<li>Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+estimation+of+the+amylose+amylopectin+ratio+in+small+amounts+of+tuber+and+leaf+tissue+of+the+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Potato+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato.</a> Potato Res. 31, 241-246 (1988).</li>
<li>Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShannon%2C+JC+%22Starch%22">Starch</a>. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).</li>
<li>Haase, N. U., Plate, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+potato+starch+in+relation+to+varieties+and+environmental+factors%5BTitle%5D)+AND+%22St%C3%A4rke%22%5BJournal%5D)">Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors.</a> Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).</li>
<li>Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+on+the+size+distribution+and+amylose%2Famylopectin+ratio+in+potato+starch+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Pot.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules.</a> Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).</li>
<li>Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+to+measure+amylose+in+cereal+starches+and+flours+with+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereal+Sci%22%5BJournal%5D)">A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A.</a> J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).</li>
<li>Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+amylose+content+of+starches+after+precipitation+of+amylopectin+by+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Starch%22%5BJournal%5D)">Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A.</a> Starch. 42, 302-305 (1990).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

La teneur en amylose dans les tubercules de pomme de terre est généralement comprise entre 20-35% 7,8. Si la plupart des valeurs sont en dehors de cette gamme, tenir compte de ces erreurs possibles: 1) les données brutes ont été utilisés à la place des données masquées pour la construction de la courbe standard amylose / amylopectine; 2) les données brutes ont été utilisés à la place des données masquées pour la détermination de la teneur en amylose ratios / amylopectine à partir des échantillons de pommes de...

Environ 80% du poids frais d&#39;un tubercule de pomme de terre est de l&#39;eau; la quasi-totalité de la matière sèche restante est l&#39;amidon 1. La plupart de l&#39;amidon (70%) est composé d&#39;amylopectine, tandis que le reste est de l&#39;amylose. Le rapport entre l&#39;amylose et l&#39;amylopectine est la propriété la plus importante influence sur les propriétés physiques de l&#39;amidon. L&#39;amylose est un alpha 1-4 chaîne linéaire de glucose, tandis que l&#39;amylopectine est un linéaire alpha 1-4 chaîne alpha 1-6 branches 2. Des méthodes telles que la liaison de l&#39;iode, calorimétrie différentielle à balayage (DSC), la Chromatographie d&#39;exclusion stérique haute performance (HPSEC) et les interactions de la concanavaline A a été développée pour la détermination de l&#39;amidon de différentes espèces de plantes cultivées 3,4. Chaque protocole exige des compétences et des équipements spéciaux, ce qui rend difficile à l&#39;échelle à quantifier de nombreux échantillons à la fois. La méthode que nous présentons ici est un protocole modifié à partir de Hovenkamp-Hermelink et al. 5, qui est une longueur d&#39;onde double liaison de l&#39;iodeméthode basée sur les granules d&#39;amidon colorés. Les avantages de ce procédé par rapport à d&#39;autres comprennent la détermination de la teneur en amylose de l&#39;amidon brut sans le purifier et l&#39;utilisation du système à double longueur d&#39;onde pour augmenter la précision de la méthode 4,6.

<table><tbody><tr><td colspan="4"> Réactifs</td></tr><tr><td>Amylose </td><td>Sigma</td><td>859656</td><td></td></tr><tr><td>Amylopectine </td><td>Sigma</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>Acide perchlorique 60 %</td><td>Sigma</td><td>311413</td><td>Très dangereux pour la peau et les yeux</td></tr><tr><td>Iode</td><td>Sigma</td><td>23214TD</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de potassium</td><td>Sigma</td><td>08625JE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Bio Tek</td><td>ELx800</td><td></td></tr></tbody></table>

rapides à haut débit amylose détermination dans lyophilisé échantillons de pommes de terre de tubercules

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Ce protocole décrit un procédé colorimétrique haut à travers mettre qui repose sur la formation d&#39;un complexe entre l&#39;iode et les chaînes de molécules de glucose de l&#39;amidon. Iode forme des complexes avec les deux amylose et l&#39;amylopectine dans de longues chaînes. Après l&#39;addition d&#39;iode à un échantillon d&#39;amidon, l&#39;absorption maximale de l&#39;amylose et de l&#39;amylopectine se produit à 620 et 550 nm, respectivement. Le ratio amylose / amylopectine peut être estimé à partir du rapport des valeurs d&#39;absorbance 620 nm et 550 et en les comparant à une courbe standard dans laquelle les concentrations connues spécifiques sont tracées en fonction des valeurs d&#39;absorption. Ce débit élevé, méthode peu coûteuse est fiable et reproductible, permettant l&#39;évaluation des grandes populations de clones de pommes de terre.

La courbe d&#39;étalonnage construite à partir des données masquées de différentes solutions de concentration amylose / amylopectine montre ratios d&#39;absorbance approximatif allant de 0,7 à 1,6 (Tableau 1). Une ligne de tendance de régression linéaire à partir de ces données sont ensuite utilisées pour déduire la teneur en amylose dans lyophilisés échantillons de pommes de terre (figure 1). L&#39;environnement de production de l&#39;usine a un certain eff...

Rapides à haut débit amylose Détermination dans lyophilisé échantillons de pommes de terre de tubercules

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer de manière haut débit les proportions relatives d'AMLO et d'amylopectine. Dans l'amidon des tubercules de pomme de terre, un amidon riche en AMLO est souhaitable en raison de sa digestibilité plus faible. Les pommes de terre riches en amidon AMLO présentent un indice glycémique plus bas et une teneur en fibres plus élevée.Cette technique est démontrée par Philip Smith, étudiant de premier cycle à l'Université du Wisconsin à Madison. Dans notre laboratoire, nous nous intéressons à l'amélioration de variétés de pommes de terre plus nutritives. Une façon d'y parvenir consiste à augmenter la teneur en AMLO de l'amidon de pomme de terre.L'amidon riche en AMLO est plus nutritif car il possède un indice glycémique plus faible, et dans ce dosage, nous avons mis au point une procédure qui nous permet d'analyser un grand nombre d'échantillons assez rapidement, et qui constitue un test reproductible, à haut débit et peu coûteux. Ce dosage est une modification d'une méthode de coloration à l'iode. Il s'agit d'un dosage colorimétrique, pouvant être réalisé à l'aide d'une plaque de 96 puits. Des tubercules de pomme de terre frais sont utilisés pour cette méthode ; découpez les tubercules en cubes d'environ un centimètre de côté et éliminez les morceaux contenant la peau.Un coupe-frites permet d'effectuer cette étape de manière efficace. Les cubes sont placés dans un sac étiqueté. Nous utilisons des chaussettes en nylon, comme celles utilisées dans les magasins de chaussures.Ils sont peu coûteux et permettent aux échantillons de sécher rapidement et uniformément dans le lyophilisateur. Les sachets en nylon contenant les échantillons sont placés dans un sac en papier et congelés toute une nuit à moins 80 degrés C. Les échantillons congelés sont retirés du sac en papier et placés dans le lyophilisateur. Avec notre lyophilisateur.Il faut environ cinq jours pour sécher complètement les échantillons. Une fois que les cubes sont secs, ils sont prêts à être traités. Les cubes de pomme de terre séchés sont finement broyés à l’aide d’un moulin Wiley ou à l’aide d’un moteur et d’un pilon.Les cubes ou la poudre peuvent être conservés jusqu'à leur traitement. Toutefois, veillez à les sceller dans des sacs en plastique ou des récipients afin d'éviter qu'ils n'absorbent de l'eau. La poudre est placée dans un sac en plastique pour être stockée jusqu'à ce que les dosages AMLO puissent être effectués.Une balance analytique est utilisée pour peser environ 20 milligrammes de poudre de pomme de terre, que l'on place ensuite dans un tube en plastique de 50 ml. Les échantillons pesant moins de 20 milligrammes ou plus de 30 milligrammes ne donnent pas de résultats fiables pour solubiliser l'amidon. 500 microlitres d'acide perchlorique à 45 % sont ajoutés à chaque tube.Soyez prudent lors de la manipulation de l'acide perchlorique : travaillez sous une hotte de ventilation et utilisez des équipements de protection individuelle. Après une période d'incubation de quatre minutes, l'échantillon est dilué avec 16 millilitres d'eau Milli Q en mélangeant sur un vortex. Monsieur, une fois que les matières insolubles se sont déposées au fond du tube, transférez 40 microlitres du liquide dans la microplaque.Veillez à ne pas transférer de matériau non soluble. Ajoutez 50 microlitres de solution d'iode à l'échantillon et mélangez délicatement à l'aide d'une pipette. N'acceptez pas la présence de bulles d'air dans l'échantillon ou sur les parois du puits. Si des bulles d'air se forment, tapez doucement sur la plaque posée sur la paillasse afin de les éliminer. Placez la plaque microtitration dans le lecteur de plaques et mesurez l'absorbance de chaque échantillon à 550 nanomètres et 620 nanomètres. Une fois les résultats du lecteur de plaques obtenus, nous pouvons comparer les données avec la courbe standard et déterminer le rapport AMLO sur amylopectine dans l'échantillon de fécule, tableau un.Il s'agit d'un résultat typique de la courbe standard telle qu'expliquée dans le protocole. Sur la figure un, les rapports d'absorbance sont tracés et une droite de régression est calculée pour la détermination de l'AMLO dans les échantillons de pomme de terre. Lors de l'élaboration de la courbe standard, chaque point de la courbe doit correspondre à la valeur d'absorbance de l'échantillon ayant une concentration connue d'AMLO.Après soustraction de la valeur d'absorbance du témoin. Lors du calcul de la valeur d'un échantillon inconnu, soustraire également la valeur d'absorbance du tableau témoin. Deux. Ceci est un résultat typique de la teneur en AMLO dans les tubercules de pomme de terre.En utilisant cette méthode COLORIMÉTRIQUE, nous avons appliqué ce dosage dans notre laboratoire afin de déterminer les contributions relatives du génotype et de l'environnement au rapport AMLO amylopectine dans l'amidon de pomme de terre. Nous espérons finalement développer des marqueurs moléculaires associés à un amidon et à une pomme de terre riches en AMLO, ainsi que créer des lignées génétiques que les sélectionneurs pourront utiliser pour développer des variétés de pommes de terre riches en amylose.

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