Name: Utilisation d In vivo Imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Découvrez l'imagerie in vivo pour suivre la dissémination du cytomégalovirus murin luminescent chez les nouveau-nés. Cette méthode permet de quantifier la réplication virale dans le système nerveux central et la cavité péritonéale en temps réel.

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Nous remercions Lee Tuddenham (IBMC, Strasbourg) pour amplifier et titrant MCMV-Luc et Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) la permission d&#39;utiliser l&#39;animalerie de l&#39;Institut de virologie. Le soutien financier de l&#39;INSERM, Université de Strasbourg et l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) est reconnu. La participation initiale de Sonia Beroud et Laetitia Lelieur au cours de leur projet de master est également reconnu.

1. Préparation de la suspension virale <ol><li> Obtenir la souche Smith de MCMV exprimant la luciférase (MCMV-Luc 15) du laboratoire de Ulrich Koszninowski. Dans ce recombinant, le gène de la luciférase est insérée dans le locus du génome IE2 MCMV. </li><li> Pour amplifier MCMV-Luc, infecter une lignée murine de la moelle osseuse des cellules stromales (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) avec MCMV à différents multiplicité d&#39;infection (MOI, 0,001 à 1) 16. Pour ce faire, ajoutez le virus à des cellules cultivées dans un milieu sans sérum à 37 ° C. Après une heure, retirer le surnageant et le remplacer par du DMEM complété avec du sérum de veau foetal à 10% (FCS). Cinq jours plus tard, récolter le milieu de culture et des aliquotes de conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Titration de la suspension virale par dosage de plaque. <ol><li> Fractionner les cellules 3T3 (ATCC # CRL-1658) dans une plaque à 24 puits à 40.000 cellules / puits dans 1 ml de DMEM complété avec 10% de SVF contenant de la pénicilline (200 UI / ml) et steptomycin (200 mg / ml) Et incuber 24 heures à 37 ° C. </li><li> Préparer des dilutions en série (10 -1 à 10 -8) d&#39;une partie aliquote de MCMV suspension dans du DMEM et d&#39;infecter les cellules cibles (cellules 3T3) par 200 pl de la dilution après avoir enlevé le milieu de culture cellulaire. Incuber 1 heure à 37 ° C. Ajouter 1 ml de Haut Moyen (DMEM FCS à 3%, 2% (v / v) la gentamicine, 200 UI / ml de pénicilline, 200 mg / ml de streptomycine, 8 g / L carboxyméthylcellulose) et incuber 5 jours à 37 ° C. </li><li> Fixer les cellules en ajoutant 200 ul 10% de formaldéhyde (dilution de formaldéhyde avec de l&#39;eau doit être effectuée sous une hotte chimique pour éviter les inhalations toxiques) dans chaque puits et incuber 6 heures à température ambiante. Supprimer milieu de culture + fixateur par pipetage rupture et ajouter 200 de solution de coloration de cellules pi (1% de cristal violet (p / v) dans l&#39;éthanol à 20%). Avant utilisation, diluer 1 partie avec 9 parties d&#39;eau milli-Q. Incuber 2 min à température ambiante, laver la plaque 3-4x en le trempant dans l&#39;eau, laisser sécher et comptez le nombre de plaques avec une paire de jumelles. </li></ol></li> &lt;li&gt; Diluer MCMV-Luc dans DMEM à obtenir 50 PFU dans 50 pi et laisser sur la glace jusqu&#39;à utilisation ultérieure. Utiliser inoculum viral induit une létalité plus élevé avant que les nouveau-nés atteignent 2-3 semaines d&#39;âge. Dans notre expérience, 500 UFP induit de mortalité dans tous les nouveau-nés de 5 à 7 jours après l&#39;injection. </li></ol> 2. Injection des nouveau-nés <ol><li> Quand les nouveau-nés (de 4 à 20 heures des souris âgées) sont disponibles, de manipuler la litière et les excréments de la cage avec des gants avant de manipuler avec soin les chiots pour éviter toute contamination par des odeurs &quot;étrangers&quot; qui mettrait l&#39;accent sur la mère et induire le rejet des chiots . </li><li> Effectuer une injection intrapéritonéale en utilisant une seringue à insuline (29 G) comme indiqué sur la figure 1A. Tenez le nouveau-né avec la peau du dos. Avec face ventrale, introduire l&#39;aiguille sous la patte avant et poussez-le doucement sous la peau pour atteindre la cavité péritonéale (un peu moins de l&#39;ombilic). Nous injectons actuellement 1% de bleu de méthylène dilué dans du DPBS et surveillons la survie de pratique la technique avant d&#39;effectuer les infections virales. Comme le bleu de méthylène est clairement visible pendant le processus d&#39;injection, nous vous recommandons d&#39;effectuer cette injection de «formation» d&#39;abord pour assurer la livraison adéquate de la suspension virale dans la cavité intrapéritonéale. </li><li> Éliminer les minuscules gouttes de sang qui peuvent surgir et placer le nouveau-né de retour dans la cage. </li></ol> 3. L&#39;imagerie in vivo <ol><li> Au jour 7, traiter les nouveau-nés avec la même prudence que mentionné précédemment. Injecter par voie intrapéritonéale d&#39;un mélange d&#39;anesthésiques (4 mg / ml de kétamine, 0,8 mg / ml de xylazine) et la luciférine (0,15 mg / g de poids corporel) dans 50 pi de chaque animal. Poids moyen des animaux est de 1-2 g et la dose d&#39;anesthésiques par animal: la kétamine 40 mg, xylazine 8 pg Attendez 12-15 min jusqu&#39;à ce que la luciférine atteint son maximum d&#39;émission. Cela doit être déterminé à l&#39;avance et dépend du fournisseur luciférine et le système d&#39;imagerie utilisée. </li><li> Alors que les chiots sont anesthetiZed, les marquer pour identification future et récolter un petit morceau de tissu qui peut ensuite être utilisé pour le génotypage avenir si les animaux mutants sont utilisés. </li><li> Placer les chiots dans le système de formation d&#39;image et d&#39;effectuer l&#39;acquisition de la lumière émise par l&#39;ensemble du corps. Sept jours après l&#39;infection, le virus s&#39;est reproduit en de nombreux exemplaires dans les organes cibles tels que le foie, les reins, les poumons et les glandes salivaires, par conséquent, la durée d&#39;exposition doit être court. Dans notre cas, nous procédons à l&#39;acquisition de 10 à 20 sec (figure 1B). La plate-forme dans la chambre de l&#39;acquisition de l&#39;appareil de formation d&#39;image doit être chauffé pour éviter un refroidissement excessif de la température corporelle de l&#39;animal anesthésié. En outre, il est utile d&#39;obtenir des images à faible résolution de plusieurs animaux dans une tour d&#39;acquisition et ensuite, passer à la plate-forme près de la lentille de la caméra afin de se concentrer sur une partie d&#39;un animal ou d&#39;un organe isolé après dissection. Le logiciel doit permettre des changements rapidesdes paramètres (temps d&#39;exposition, la distance échantillon / objectif, sensibilité), la quantification des régions définies d&#39;intérêt et l&#39;avenir exportation des images instantanées. </li><li> Pour acquérir signal lumineux de la tête seulement, couvrir le corps du nouveau-né couché latéralement avec un papier noir épais qui va masquer les photons émis au niveau des organes où la réplication virale élevée se produit (foie, poumons, glandes salivaires) et effectuer acquisition pendant 5 à 10 mn (figure 1C). Effectuer l&#39;acquisition de la face opposée de l&#39;animal dans les mêmes conditions. </li><li> Réintroduire les chiots dans la cage et placer une lampe chauffante sur le dessus pour éviter un refroidissement excessif des nouveau-nés anesthésiés. Surveiller régulièrement la récupération post-anesthésique. Avec la dose indiquée, l&#39;anesthésie dure actuellement 30 min. </li><li> Répétez la même procédure les jours de 9, 11 et 14. Les jours 11 et 14, de modifier la dose d&#39;anesthésiques (6 mg / ml de kétamine, 1,2 mg / ml de xylazine). </li></ol>

<ol><li>Loewendorf, A., Benedict, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+innate+and+adaptive+immune+defenses+by+cytomegalovirus%3A+timing+is+everything%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything.</a> J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).</li>
<li>Lischka, P., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+strategies+to+combat+cytomegalovirus+infections+in+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).</li>
<li>Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+human+cytomegalovirus+a+target+in+cancer+therapy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy?</a> Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).</li>
<li>Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Immunity in neonates.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).</li>
<li>Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+immunity%3A+faulty+T-helpers+and+the+shortcomings+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells.</a> Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).</li>
<li>Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responsiveness+in+the+neonatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immune responsiveness in the neonatal period.</a> J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).</li>
<li>Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathogenesis+of+congenital+cytomegalovirus+infection%3A+disease+mechanisms+and+prospects+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).</li>
<li>Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cytomegalovirus+infection+on+embryogenesis+and+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Congenit.+Anom.+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development.</a> Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).</li>
<li>Sancho-Shimizu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+susceptibility+to+herpes+simplex+virus+1+encephalitis+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans.</a> Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).</li>
<li>Crozat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+MCMV+resistome+by+ENU+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis.</a> Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).</li>
<li>Juanjuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+for+congenital+CMV+infection+and+hearing+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment.</a> Virol. J. 8, 70(2011).</li>
<li>Koontz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+development+of+the+brain+after+focal+herpesvirus+infection+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system.</a> J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).</li>
<li>Bantug, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li>
<li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li>
<li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li>
<li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+%28M2-10B4%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier compétition. Déclaration éthique Les animaux ont été maintenus dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes dans l&#39;établissement de soins des animaux de l&#39;Institut d&#39;Immunologie et d&#39;Hématologie. Manipulation des souris et des procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la loi française sur la protection des animaux de laboratoire. La procédure a été approuvée par le service vétérinaire de la Préfecture du Bas-Rhin (France) sous le numéro d&#39;autorisation A-67-345.

En utilisant la technologie d&#39;imagerie in vivo pour surveiller MCMV-Luc diffusion chez la souris nouveau-nés, nous avons pu observer la propagation du virus dans le cerveau des animaux mutants, par opposition au type sauvage. En outre dissection de l&#39;animal et de l&#39;imagerie ex vivo du cerveau a confirmé la présence du virus de luminescence dans le système nerveux central. En outre, nous avons également procédé à l&#39;immunohistochimie (non représenté) sur coupes fines cerveau avec...

Cytomégalovirus humain (HCMV/HHV-5) est un membre de la famille β-herpesvirus. HCMV est très répandue, pathogène opportuniste qui est généralement acquise en début de vie comme une infection asymptomatique 1. Comme tous les virus de l&#39;herpès, HCMV persiste pendant toute la vie de l&#39;hôte dont le système immunitaire contrôle étroitement la réplication virale. Les épisodes de réactivation virale surviennent surtout chez les personnes immunodéprimées comme les patients transplantés recevant des médicaments pour prévenir le rejet du greffon 2. Chez les adultes, HCMV a également été liée à glioblastomes 3. En outre, HCMV est un agent pathogène important pour les nouveau-nés avec une immunité immature 4-6. La primo-infection dans le développement du fœtus ou nouveau-né peut avoir de graves conséquences. HCMV infection est la cause infectieuse la plus fréquente des malformations congénitales et des troubles de l&#39;enfance dans les pays développés. On estime que l&#39;incidence de l&#39;infection néonatale HCMV affecte 0,5-1% of toutes les naissances vivantes dont 5-10% vont souffrir de symptômes sévères tels que la microcéphalie ou hypoplasie cérébelleuse. En outre, 10% des nourrissons infectés par une infection virale subclinique se développer plus tard des séquelles entraînant un retard mental, perte, défauts visuels ou de la saisie et de l&#39;épilepsie 7,8 auditive. Contrairement aux autres herpèsvirus humains tels que l&#39;herpès simplex 1 (HSV-1/HHV-1) qui peut être inoculé à des souris par différentes voies d&#39;injection 9, la réplication du cytomégalovirus est spécifique à l&#39;espèce. Cette fonctionnalité a gravement entravé les enquêtes de HCMV pathogenèse qui sont effectuées dans différents modèles animaux (souris, rat, cochon Guinée, le singe rhésus) et leurs CMV spécifiques de l&#39;hôte d&#39;origine respectifs. Tous les VMC présentent des similitudes importantes dans la taille du génome et de l&#39;organisation, le tropisme tissulaire et la régulation de l&#39;expression des gènes. Ils induisent également des pathologies similaires dans leur hôte respectif. Malgré la diversité génomique êtreentre HCMV et souris cytomégalovirus (MCMV) (50% des ORF présents dans le virus humain sont identifiés dans le CMV murin), le modèle de la souris s&#39;est récemment révélé être avantageux, surtout parce que les souches mutantes peuvent être testés pour leur capacité à contrôler virale la réplication in vivo. Cela a conduit à un crible génétique qui a permis d&#39;estimer le nombre de gènes de souris exprimés au stade adulte qui composent le &quot;résistome&quot; à ce virus 10. Au total, cela indique que les souris infectées par MCMV représentent un modèle intéressant pour l&#39;étude des interactions hôte-virus chez les adultes. L&#39;exploration de l&#39;infection congénitale à CMV est plus complexe parce que les différences dans l&#39;organisation de la couche placentaire entre l&#39;homme et la souris nuisent à la transmission mère-fœtus de l&#39;infection virale chez la souris. Récemment, l&#39;injection directe de MCMV dans le placenta à jour 12.5 de gestation a permis infection du cerveau de souris nouveau-nés qui ont conduit à la dépréciation audience 11. Cependant, la plupart investigations utilisent désormais injection intrapéritonéale de 4-20 hr-nés âgés de fournir dissémination virale systémique pouvant conduire à une infection hématogène du cerveau, un modèle qui est plus pertinent que celui d&#39;une injection intracrânienne. Ce protocole a fourni d&#39;importantes informations sur la pathogenèse CMV et plus particulièrement, il a été démontré que l&#39;infection par MCMV de nouveau-nés résultats de la réplication virale dans les cellules neuronales et gliales situées dans les foyers inflammatoires qui sont infiltrés par des cellules mononucléaires comme les macrophages 12. Ce rapport décrit également la morphogénèse altérée du cervelet accompagné d&#39;une diminution granulaire prolifération des neurones et de la migration et de l&#39;induction de plusieurs gènes d&#39;interféron-stimulés. Le rôle essentiel des cellules T CD8 + pour le contrôle de MCMV dans le système nerveux central a également été rapporté par le même groupe 13. Un aspect important à considérer lors de l&#39;analyse de l&#39;effet pathologique d&#39;un microbe est la dynamique de l&#39;infecterd&#39;ions. Dans le cas de MCMV, il est particulièrement important d&#39;explorer et de quantifier la progression de la diffusion du virus dans le cerveau en développement afin de comprendre et d&#39;anticiper l&#39;ampleur des futurs blessures neurobiologiques. Traditionnellement, la quantification de la progression d&#39;une infection nécessite le sacrifice régulier des animaux infectés de titrer l&#39;agent pathogène dans les tissus, tels que le cerveau, qui sont autrement inaccessibles. Ce type de protocole est maintenant contestée par l&#39;amélioration nécessaire du bien-être animal et les 3R (Réduire, Refine, Replace) principes 14. L&#39;utilisation des technologies d&#39;imagerie in vivo peut permettre une réduction drastique du nombre d&#39;animaux qui sont nécessaires dans des expériences d&#39;infection in vivo. Ici, nous présentons et décrivons une analyse temps-courant de la diffusion du virus dans le cerveau lors de intrapéritonéale MCMV-Luc injection pour les nouveau-nés de souris. En utilisant les mêmes animaux, nous avons suivi et surveillé in vivo les sites d&#39;intense viréplication ral au cours d&#39;une période de 2 semaines.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactif/Matériel</fort></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3523A</td><td></td></tr><tr><td>Methylen blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319112</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles à insuline</td><td>VWR</td><td>613-4897</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine/Vetranal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>DUTSCHER</td><td>P0436500</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Caliper</td><td>760504</td><td></td></tr><tr><td>gentamycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>carboxyméthylcellulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr><tr><td>formaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>cristal violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>IVIS 50</td><td>Caliper/Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation d&#39;<em&gt; in vivo</em&gt; imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Cytomégalovirus humain (HCMV ou HHV-5) est un agent pathogène mortelle, chez les personnes immunodéprimées. Lors de l&#39;infection congénitale ou néonatale, le virus peut infecter et de se répliquer dans le développement du cerveau, ce qui peut induire des lésions neurologiques graves, y compris la surdité et le retard mental. En dépit de la gravité potentielle des symptômes, les options thérapeutiques sont limitées par l&#39;absence d&#39;un vaccin et l&#39;absence d&#39;un traitement antiviral spécifique. En outre, une description précise des événements moléculaires qui se produisent au cours de l&#39;infection du système nerveux central (SNC) fait encore défaut depuis observations proviennent principalement de l&#39;autopsie des enfants infectés. Plusieurs modèles animaux, comme les macaques rhésus CMV, ont été mis au point et fourni des indications importantes sur la pathogenèse CMV dans le SNC. Cependant, en dépit de sa proximité avec l&#39;évolution des humains, ce modèle a été limitée par la procédure d&#39;inoculation intracrânienne utilisé pour infecter les animaux et les inconvénientsistently induire une infection du système nerveux central. En outre, les considérations éthiques ont favorisé le développement de modèles alternatifs, parmi lesquels l&#39;infection néonatale de souriceaux nouveau-nés par le cytomégalovirus de la souris (MCMV) a récemment permis des avancées significatives. Par exemple, il a été signalé que l&#39;injection intrapéritonéale de MCMV à Balb / c nouveau-nés conduit à l&#39;infection de neurones et les cellules gliales dans des zones spécifiques du cerveau. Ces résultats suggèrent que l&#39;inoculation expérimentale de souris pourrait récapituler les déficits induits par l&#39;infection à CMV chez les enfants. Néanmoins, une analyse dynamique de l&#39;infection par MCMV des nouveau-nés est difficile à réaliser parce que la méthode classique nécessite le sacrifice d&#39;un nombre important d&#39;animaux à différents points dans le temps d&#39;analyser la charge virale et / ou les paramètres liés au système immunitaire. Pour contourner cet obstacle et permettre futures enquêtes sur les animaux mutants rares, nous avons appliqué la technologie d&#39;imagerie in vivo pour effectuer une analyse temps-courant de l&#39;viraL diffusion dans le cerveau lors de l&#39;injection périphérique d&#39;une MCMV recombinant exprimant la luciférase de C57BL / 6 nouveau-nés.

Une expérience représentative est illustrée à la figure 1. Lors de l&#39;injection intrapéritonéale de 50 PFU de MCMV-Luc (groupe A montre une injection similaire menée au bleu de méthylène pour visualiser la voie sous-cutanée de l&#39;aiguille), les nouveau-nés ont été anesthésiés et reçues simultanément 0,3 mg du substrat luciférase (Luciferin, Caliper). Quinze minutes plus tard, les animaux ont été placés face ventrale dans la chambre de l&#39;acquisition de la SIIV 50 (système d&#39;imagerie in vivo...

Le cytomégalovirus (HCMV) infection humaine des nouveau-nés représentent une cause importante de déficience mentale, mais les événements moléculaires conduisant à la pathogenèse induite par le virus sont encore mal compris. Pour étudier la dynamique de l&#39;infection du cerveau, nous avons adapté animal entier<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie d&#39;effectuer une analyse temps-cours des nouveau-nés infectés par un virus recombinant luciférase.

Utilisation d&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un imagerie in vivo de souriceaux afin d'étudier la dissémination du cytomégalovirus luminescent. Cela est réalisé en préparant tout d'abord la dilution appropriée du virus à partir d'une solution mère. Ensuite, les souriceaux sont injectés avec le MCMV luminescent dans la cavité péritonéale.À des temps précis après l'injection, les petits sont anesthésiés puis injectés avec de la luciférine avant l'imagerie in vivo. En fin de compte, l'imagerie in vivo est utilisée pour visualiser et quantifier la réplication et la dissémination du virus dans la cavité péritonéale et le système nerveux central.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les filtrations virales dans les organes après l'euthanasie d'animaux infectés, est qu'elle consomme moins de temps et de ressources. La démonstration de la procédure sera assurée par M. Il Macan, technicien de mon laboratoire. Une souche de MCMV exprimant la luciférase, obtenue du laboratoire d'Ulrich Kowski, est utilisée dans l'étude suivante.Pour amplifier la souche, ajouter le virus à des cellules en culture dans un milieu sans sérum à 37 degrés Ce

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Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

En utilisant la luciférase et in vivo des systèmes d'imagerie (IVIS) comme un nouveau moyen d'identifier les maladies extrêmes avant de développements cliniques se produire. IVIS nous a permis de visualiser en temps réel l'invasion des virus encéphalitique sur plusieurs jours, en fournissant un modèle de maladie plus précise pour des études futures. Il nous a également permis d'identifier les caractéristiques protecteurs potentiels des antiviraux et des vaccins plus rapidement que les modèles...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d&#39;un neuro-invasive virus encéphalitique

Ici, nous développons les outils nécessaires...

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Source : Seman, B. G., et al. Un modèle d’imagerie néonatale de septicémie bactérienne à Gram négatif. J. Vis. Exp. (2020)La vidéo présente un modèle murin néonatal pour étudier l’infection systémique à l’aide de bactéries bioluminescentes encapsulées. Les nouveau-nés sont injectés avec des suspensions bactériennes à forte ou faible dose et sont renvoyés à leur mère pour des soins postnataux. Les bactéries encapsulées échappent à la détection immunitaire précoce, se propagent systémiquement et...

Modéliser l’infection chez les souris néonatales à l’aide de bactéries bioluminescentes encapsulées

Cette vidéo montre le processus d’injection intraventriculaire pour étudier la distribution du cytomégalovirus murin (MCMV) dans le cerveau de souris néonatale. La MCMV, conçue pour exprimer une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) pour la visibilité, est injectée dans le ventricule latéral du cerveau d'un bébé souris. Le virus injecté circule dans le liquide céphalo-rachidien, infectant les cellules de la région périventriculaire, y compris la zone marginale, le plexus choroïde et la...

Injection intra-ventriculaire intra-ventriculaire pour analyser la distribution du cytomégalovirus murin dans le cerveau d’une souris néonatale

Ici, nous démontrons une technique de transduction neuronale généralisée par injection intraventriculaire d’un virus adéno-associé dans le cerveau de souris néonatale.  Cette méthode offre un moyen rapide et facile d’obtenir l’expression à vie des transgènes délivrés par le virus.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Les modèles animaux de la maladie pédiatrique peuvent éprouver précoce et la progression de la maladie agressive. Cliniquement l'administration du traitement pertinent de jeunes modèles de souris peut être techniquement difficile. Ce protocole décrit une méthode d'injection intraveineuse non-invasive pour les souris nouveau-nés dans les deux premiers jours après la naissance de la vie.

Les injections intraveineuses de souriceaux nouveau-nés

Ici, nous décrivons une méthode simple d’injection intraventriculaire et intravasculaire de particules virales ou de microbilles fluorescentes dans le cerveau de souris néonatale. Le modèle de localisation du virus et des nanoparticules a pu être détecté par évaluation microscopique ou par hybridation in situ.

Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal

L’infection des souris néonatales avec E. coli bioluminescent O1:K1:H7 a comme conséquence une infection septique avec l’inflammation pulmonaire significative et la pathologie pulmonaire. Ici, nous décrivons des procédures pour modéliser et étudier davantage la septicémie néonatale utilisant la formation image intravitale longitudinale en parallèle avec l’énumération des charges bactériennes systémiques, du profilage inflammatoire, et de l’histopathologie de poumon.

Un modèle néonatal d’imagerie de la septicémie bactérienne gramnégative

La naissance prématurée (accouchement &lt; 37 semaines) est un problème de santé mondial urgent, avec des options de prévention et de traitement sous-optimales. Nous présentons un modèle murin d’accouchement prématuré induit par une infection bactérienne vaginale ascendante et décrivons comment analyser la morbidité et la mortalité néonatales qui en résultent.

Modélisation de l’infection vaginale ascendante, de l’accouchement prématuré et de la morbidité néonatale chez la souris

Ce protocole démontre l’injection de veines temporales pour la délivrance par voie intraveineuse de cellules cancéreuses pédiatriques à des souris néonatales, permettant une modélisation précise et reproductible des réponses immunitaires précoces contre le cancer. La méthode permet d’évaluer l’impact des interventions, telles que l’immunomodulation ou la thérapie, lorsqu’elles sont appliquées pendant la période néonatale.

Un modèle de transplantation intraveineuse néonatale pour l’évaluation des activités immunitaires précoces contre les cellules cancéreuses

Découvrez l'imagerie in vivo pour suivre la dissémination du cytomégalovirus murin luminescent chez les nouveau-nés. Cette méthode permet de quantifier la réplication virale dans le système nerveux central et la cavité péritonéale en temps réel.

Utilisation d In vivo Imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés (Vidéo) | JoVE Journal

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