Utilisation d' In vivo Imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une imagerie in vivo de nouveau-nés de souris afin d’étudier la dissémination du cytomégalovirus luminescent. Pour ce faire, il faut d’abord préparer la dilution appropriée du virus à partir d’une solution mère. Ensuite, les nouveau-nés reçoivent une injection du MCMV luminescent dans la cavité péritonéale.

À des moments après l’injection. Les chiots sont anesthésiés et injectés avec Lucifer avant l’imagerie in vivo. En fin de compte, l’imagerie in vivo est utilisée pour montrer et quantifier la réplication et la dissémination du virus dans la cavité péritonéale et le système nerveux central.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les filtrations virales dans les organes après l’euthanasie d’animaux infectés, est qu’elle consomme moins de temps et moins de ressources. La démonstration de la procédure sera Mr.Il Macan, un technicien de mon laboratoire. Une souche de MCMV exprimant la luciférase obtenue du laboratoire d’Ulrich Kowski est utilisée dans l’étude suivante.

Pour amplifier la souche, ajoutez le virus à des cellules cultivées dans un milieu exempt de sérum à 37 degrés Celsius. Au bout d’une heure, retirez le surnageant et remplacez-le par du DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal. Cinq jours plus tard, la culture est récoltée et les aliquotes sont stockées à moins 80 degrés Celsius.

Jusqu’à nouvel ordre. Après avoir titré la suspension virale par dosage en plaque, diluer l’échantillon à 50 pfu dans 50 microlitres de DMEM et laisser sur de la glace jusqu’à ce que des injections prêtes à l’emploi soient effectuées chez les nouveau-nés âgés de quatre à 20 heures. Avant de manipuler les chiots, manipulez la litière et les excréments avec des mains gantées.

Pour éviter d’introduire des odeurs étrangères qui pourraient stresser la mère à effectuer une injection d’entraînement, remplissez une seringue à insuline avec 1 % de bleu de méthylène dilué dans du DPBS. Lorsque vous êtes prêt, tenez le nouveau-né par la peau dorsale comme on le voit ici avec le côté ventral vers le haut. Introduisez l’aiguille sous les quatre pattes et enfoncez-la doucement par voie sous-cutanée dans la cavité péritonéale.

Une fois que la pointe de l’aiguille est dans la bonne position, injectez le méthyle en bleu. Ensuite, retirez lentement l’aiguille et essuyez le sang du site d’injection. Renvoyez le nouveau-né dans la cage d’origine après l’injection après une injection d’entraînement réussie, répétez cette procédure avec la suspension virale préparée précédemment.

Les images sont prises sept jours après l’injection, en manipulant les nouveau-nés avec prudence comme indiqué précédemment. Injectez chacun un mélange d’anesthésiques et de Lucifer en attendant 12 à 15 minutes Pour que le LUCIFÉRIAN atteigne son émission maximale, assurez-vous que la plate-forme dans la chambre d’acquisition de l’appareil d’imagerie est chauffée pour maintenir la température corporelle correcte. Une fois que les petits ont été anesthésiés et étiquetés pour identification, ils sont prêts à être placés dans le système d’imagerie.

Tout d’abord, effectuez l’acquisition de la lumière émise par l’ensemble du corps. Étant donné que le virus s’est répliqué dans plusieurs organes cibles, la durée de l’exposition devrait être courte. Ici, l’acquisition est effectuée pendant 10 à 20 secondes.

Il est utile d’obtenir des images à basse résolution de plusieurs animaux au cours d’un seul tour d’acquisition, puis de rapprocher la plate-forme afin de se concentrer sur une partie d’un animal particulier ou d’un organe isolé après la dissection. Pour obtenir un signal lumineux uniquement de la tête, couvrez le reste du corps avec un papier épais et sombre qui masquera les photons, effectuez l’acquisition pendant cinq à 10 minutes et répétez cette opération pour le côté opposé de l’animal. Dans les mêmes conditions.

Après l’imagerie, renvoyez les chiots dans une cage chauffée pour maintenir leur température corporelle pendant l’anesthésie. Ces images ont été prises aux jours 7, 9, 11 et 14 après l’infection, le titre viral global chez l’animal semble diminuer avec le temps. Dans cet exemple, le corps est couvert, laissant la tête exposée.

Cela révèle une tache discrète au niveau de l’oreille gauche dont l’intensité augmente entre le septième et le 14e jour, suggérant que la dissémination du MCMV vers le cerveau peut être observée dynamiquement in vivo. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunohistochimie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur l’emplacement précis du virus dans le cerveau.